Creëren Anatomisch nauwkeurige en reproduceerbare Intracranial Xenograften van Human hersentumoren

Samenvatting

De hersenen is een unieke site met eigenschappen die niet goed weergegeven door in vitro of ectopische analyses. Orthotopische muismodellen met reproduceerbare ligging en groei-eigenschappen op betrouwbare wijze kan worden gemaakt met intracraniële injecties met een stereotaxisch fixatie instrument en een lage druk spuit pomp.

Samenvatting

Orthotopische tumor modellen zijn op dit moment de beste manier om de studie van de eigenschappen van een type tumor, met en zonder interventie, in de context van een levend dier - vooral op locaties met unieke fysiologische en architectonische kwaliteiten, zoals de hersenen In vitro en buitenbaarmoederlijke modellen niet kunnen. goed voor functies zoals het vaatstelsel, bloed-hersenbarrière, het metabolisme, drug delivery en toxiciteit, en een tal van andere relevante factoren. Orthotopische modellen hebben hun beperkingen ook, maar met de juiste techniek tumorcellen plaats nauwkeurig worden geënt in weefsel dat het meest bootst omstandigheden in het menselijk brein. Door het gebruik van methoden die precies afgemeten hoeveelheden te leveren aan nauwkeurig gedefinieerde locaties in een gelijkmatige en druk, muismodellen van menselijke hersentumoren met voorspelbare groei kan reproduceerbaar worden gemaakt en zijn geschikt voor een betrouwbare analyse van de verschillende interventies. De hier beschreven protocol is gericht op de technische de details van het ontwerpen van en de voorbereiding op een intracraniële injectie, het uitvoeren van de operatie, en het waarborgen van een succesvolle en reproduceerbare tumorgroei en biedt aanknopingspunten voor een verscheidenheid van aandoeningen die kunnen worden aangepast voor een waaier van verschillende hersentumor modellen.

Inleiding

In vitro studies van hersentumor cellen onschatbare waarde voor het ontleden van de moleculaire mechanismen die groei, overleving, migratie en invasie van kankercellen; gekweekte cel experimenten kunnen definiëren signaalwegen, wijzen op een mogelijke therapeutische doelwitten en karakteriseren cellulaire respons op de behandeling met geneesmiddelen. Maar in vitro systemen zijn veel te simplistisch om organismal reactie op geneesmiddelen te voorspellen; ze missen de fysiologische reacties, immuunreacties, cel micro-omgeving, en de algehele heterogeniteit van levende dier-systemen. Genetisch gemanipuleerde modellen kunnen van onschatbare waarde, wanneer deze beschikbaar zijn, maar moleculaire verschillen tussen soorten en muizen cellen kunnen gebeurtenissen in de menselijke processen niet recapituleren, wat resulteert in aanzienlijke verschillen bij het ​​vergelijken van diermodellen om de klinische waarnemingen ^1. Muis xenograft modellen met subcutane (SQ) injectie van menselijke hersenen tumorcellijnen onder de huid van de flank zijn eenvoudig uit te voerenen meten; ze kunnen worden gebruikt om de effecten van genetische modificatie en toediening / aflevering, metabolisme en toxiciteit pakken. Belangrijke nadelen beperken echter de bruikbaarheid van SQ modellen. De micro niet recapituleren die van een natuurlijk voorkomende hersentumor: de interacties van verschillende celtypes en weefsels; de plaatselijke vaatstelsel, en vele andere factoren uniek aan de hersenen kan niet worden gerepliceerd. Om nauwkeuriger reproduceren unieke milieu van een natuurlijk voorkomend hersentumor en test de effecten van farmaceutische interventie, zou een muis orthotopic model worden gebruikt. Verder kan orthotope technieken worden gebruikt als onderdeel van een genetisch gemanipuleerde benadering waarin humane primaire niet-kankercellen (gedifferentieerde of progenitor) genetisch gemodificeerd en geïnjecteerd in de desbetreffende plaats van een muis, met of zonder menselijke stroma cellen, resulterend in tumorigenese vergelijkbaar met dat bij de mens ^1.

Dit artikel beschrijfteen methodologie om hersentumoren nauwkeurig en reproduceerbaar te creëren in muizen. Met deze techniek kan de gebruiker nauwkeurig injecteren van een kleine hoeveelheid van gesuspendeerde cellen in een opgegeven locatie van de fronto-parieto-temporale gebied van de muis hersenschors. Mouse mortaliteit is zeer laag; in onze handen, zijn er geen muizen stierven van chirurgische complicaties na 185 procedures. Kenmerken van het resulterende tumor te vergelijken met die van typische klinische tumoren; bijvoorbeeld: snelheid van groei, graad van necrose, invasiediepte, heterogeniteit van celtype aanwezigheid van mitotische cellen merkers van proliferatie en apoptose, etc. Cellijnen of gescheiden menselijk weefsel of tumor samples dan geëvalueerd worden op basis van hun vermogen simuleren feitelijke klinische presentatie. Pharmaceuticals, geselecteerd op basis van hun prestaties in celkweek, kunnen worden getest in de context van een functionerende stofwisseling, bloedsomloop en bloed-hersenbarrière zoals die per dier belast witha tumor, alle in een relevante architecturale context. Bovendien kan de gekozen injectie cellen genetisch gemodificeerd worden om het effect van specifieke knockdowns, deleties onderzoeken knock-ins, mutaties, etc. tumorgroei en overleving.

Een aantal publicaties documenteren tumoren studies met verschillende intracraniale technieken. Yamada et al. Heeft een gedetailleerde studie van de injectie van kleurstof en U87 cellen en vond dat volume en injectiesnelheid minimaliseren produceerde de beste tumor ^2. . Brooks et al gevonden superieure reproduceerbaarheid en efficiëntie met behulp van een microprocessor gestuurde injector in plaats van een handmatige methode om virale vectoren te leveren; hun conclusies ten aanzien van optimale injectie parameters zijn van toepassing op mobiele aflevering ^3. Shankavaram et al. Aangetoond dat glioblastoma multiforme (GBM) cellijnen geïnjecteerd orthotopically (met een handmatige methode) in de hersenen recapituleerde het genexpressieprofiel van het clinical tumoren beter dan ofwel in vitro of SQ xenotransplantaten, die het gebruik van intracraniale modellen voor preklinische studies ^4. Giannini et al. Geïnjecteerde cellen uit humane biopten die in de flanken van naakt muizen hadden geleden door seriële passages in de hersenen van aanvullende muizen en aangetoond dat deze benadering bewaarde patiënt tumor gen veranderingen in het model ^5. Vergelijkbare resultaten werden gerapporteerd door Yi c.s. ^6. Met behulp van een stereotaxisch setup en nauwkeurig gedefinieerde injectieplaats, en een langzame en gestage injectie snelheid, verkregen zij reproduceerbaar hersentumoren met consistente groei en een hoog (100%) aanslaan tarief. De geldigheid van deze techniek is dan ook goed ingeburgerd; een literatuuronderzoek blijkt dat de toepassingen van deze techniek zijn uitgebreid. Carty et al. Gebruikt intracraniële injecties om virale vectoren die therapeutische genen met succes te leveren in de frontale cortex van transgenic model van de ziekte van Alzheimer ^7. Thaci et al. De toepassing beschreven van intracraniale injecties therapeutische oncolytische adenovirus leveren een neurale stamcel gebaseerde drager in naakt muizen reeds uitvoert orthotopically ingespoten GBM tumoren ^8. Duidelijk, intracraniële injecties zijn een veelzijdige en effectieve tool voor preklinisch onderzoek. Eerdere publicaties in The Journal of Gevisualiseerd Experimenten beschrijven fundamentele benaderingen ^9-11, maar we nemen het concept van intracraniële tumor injectie en orthotopic modelleren naar een hoger niveau van precisie met behulp van eenvoudig te master-technologie.

Protocol

Alle procedures werden beoordeeld en door onze institutionele dierlijke zorg en gebruik commissie goedgekeurd.

1 Plan de Experiment

1. Selecteer cellen te injecteren. Cellen uit verschillende bronnen zijn kandidaten voor injectie: hechtende celkweek lijnen genetisch gemodificeerde klonen neurosfeercellen primaire kweken, of gescheiden tumoren. Het type model gewenst zal de meest geschikte injectieplaats definiëren.
   1. Bepaal het aantal cellen voor injectie. Het aantal cellen dat nodig is om tumoren te vormen afhankelijk cellijn en moet empirisch worden bepaald; tumor groei sterk afhankelijk van celtype celaantal en weefselkweek passage nummer. Celaantallen variërend van 1 x ^04-2 oktober x 10 ⁵ of meer per injectie zijn tumoren van verschillende groei geproduceerd.
   2. Beperk het volume voor injectie. De cellen moeten in het kleinste volume van serumvrij medium of fosfaat gebufferde s geschorstaline (PBS) die zorgt voor een soepele, gemakkelijke doorgang door een 26 G naald. Hoe kleiner het volume daadwerkelijk in de hersenen afgegeven, hoe preciezer omschreven en de resulterende tumor; optimale resultaten worden verkregen door het injecteren van volumes variërend van 3 tot 6 pl. Plan een totaal eindvolume van ten minste 50 ui gesuspendeerde cellen te bereiden, ongeacht het aantal injecties voorzien teneinde nauwkeurige meting mengen en bemonstering mogelijk.
2. Kies de juiste muizen voor het model. Murine modellen van menselijke tumoren gebruiken meestal jonge immuun-gecompromitteerde muizen immuungemedieerde transplantaatafstoting te voorkomen. Het is niet nodig om het werk te laten plaatsvinden in een biologisch veiligheidskabinet indien de juiste voorzorgsmaatregelen worden genomen, met inbegrip van ontsmetting, desinfectie en sterilisatie van materialen en apparatuur. Het hier getoonde werk is gedaan in athymische naakt muizen, man en vrouw, tussen de 6 en 12 weken leeftijd. Muizen die minder dan 20 g wegen kan moeilijk te positioneren op alstereotaxic frame en kunnen meer vatbaar voor onderkoeling.

2 Monteer de apparatuur

1. Verkrijgen en te ontsmetten een muis stereotaxisch frame, uitlijning console, en de muis gas anesthesie hoofd houder, injectiespuit pomp, warmte-pad, anesthesie machine, glasvezel werklamp, en variabele snelheid roterende boor. Reinigen en ontsmetten van alle apparatuur.
2. Programmeer de injectie parameters (inclusief injectievolume, stroomsnelheid, snelheid, type spuit) en andere variabelen die voor de werking van de injectiepomp. Optimaliseer instellingen voor elke specifieke model.
   OPMERKING: In deze injecties waren de instellingen 3.000 nl monsters met een snelheid van 400 nl / min (tarief eenheden "M") met behulp van een 25 ul injectiespuit (Device Type "E") in de niet-gegroepeerde ("N") modus.
3. Reinig een precisie micro met 26 G naald met meerdere keren wordt gespoeld steriel gedemineraliseerd water (Dih ₂ O) en 70% ethanol (EtOH), het doen van een laatste rinse met Dih ₂ O. Sommige, maar niet alle modellen zijn ontworpen om te worden geautoclaveerd. Zorg ervoor dat de zuiger beweging is glad en vrij.
4. Verkrijgen anesthesie levering apparatuur. Isofluraan de voorkeur verdoving is gemakkelijk om de diepte en duur van de anesthesie regelen. Zorg ervoor dat de stereotactische apparaat is uitgerust met een muis anesthesie gas gehechtheid en dat de benodigde slangen en aansluitingen zijn getroffen om het gasmengsel te leveren uit de narcose machine naar de muis.
5. Autoclaaf chirurgische instrumenten, met inbegrip van fijne punt schaar, twee tangen / hemostats (met tanden) voor het hechten, middelgrote schaar, middellange en puntig pincet, en ten minste twee 1 mm tandheelkundige boren. Houd instrumenten schoon tijdens de procedure met 70% EtOH, ontsmettingsmiddel, of een kraal sterilisator.
6. Verkrijgen isofluraan, pijnstillende, oogzalf / smeermiddel, antibiotische zalf, zoutoplossing, 30% waterstofperoxide (H ₂ O _2), antiseptisch en botwas (indien gewenst) eenveterinaire of medische voorziening. Bereid steriele Dih ₂ O en 70% EtOH. Disposables zoals gaasjes, steriele dressings, hechtingen, ethanol wattenstaafjes, wattenstaafje wattenstaafjes, steriele chirurgische handschoenen, chirurgische mesjes en meer worden gespecificeerd in de lijst met materialen. Een fijne punt permanente marker voor het markeren van de schedel moet worden ontsmet en toegewijd voor chirurgisch gebruik.

3 Bereid Cellen voor Injectie

1. In de hier getoonde experimenten, selecteer een onsterfelijk mens GBM cellijn. Bepaal het aantal cellen (2 x 10 ⁵⁾ en het volume suspensie te spuiten (3 ui) empirisch; informatie kan variëren met het type cel. Gebruik een volume van ten minste 50 pl nauwkeurige meting, mengen en injectie vergemakkelijken.
2. Trypsinize cellen en resuspendeer in media of PBS. Voer de volgende stappen vlak voor celinjectie:
   1. Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen door aspiratie en spoelen met 10 ml PBS per 100 mm plaat; verwijderen PBS.
   2. Advertentied 1 ml trypsine elke 100 mm plaat en incubeer bij kamertemperatuur net lang genoeg om een ​​enkele celsuspensie werd verkregen.
   3. Stop trypsinewerking met 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% foetaal runderserum (FBS) per 100 mm plaat.
   4. Pellet cellen door centrifugatie bij 450 xg en resuspendeer in ~ 5 ml serumvrij DMEM (DMEM-SF) per 100 mm plaat.
   5. Telling levensvatbare cellen met behulp van een hemacytometer of een geautomatiseerde celteller.
   6. Stel de levende celdichtheid 2 x 10 ⁵ cellen / 3 ui (of proefondervindelijk bepaald) door pelletiseren de cellen en hersuspenderen in SF-DMEM.
3. Houd cellen gekoeld op ijs of een chill pack (niet mogelijk cellen te bevriezen). Meng voorzichtig met de vinger te vegen.

4 Verdoven en Bereid Muis voor Heelkunde

1. Induceren anesthesie met behulp van ~ 5% isofluraan (zuurstoftoevoer ~ 2 L / min) of zoals voorgeschreven door de dierenarts. Inductie moet nemen 2 tot 3 minuten. Handhaaf de muis op een adequate dieptevan anesthesie met ~ 3% isofluraan.
   1. Controleer de diepte van de anesthesie door teen knijpen, stel isofluraan indien geïndiceerd en doorgaan met ademhalen en teen knijpen respons tijdens de gehele procedure te volgen. Bedek muis met gaasjes voor de warmte en de monitor muis regelmatig gedurende de procedure, die 45 min kan duren tot 1 uur, afhankelijk van de snelheid van de injectie.
2. Plaats de muis in stereotaxisch frame door het gehemelte bar voorzichtig glijden over de tong en in de mond. Haak de voorste snijtanden in de tand gat. Gebruik oor bars om het hoofd te stabiliseren, met het oor-to-eye oppervlak zo dicht horizontaal mogelijk. Niet bars kracht in de gehoorgang. Het is cruciaal om goed te positioneren het hoofd: check side-to-side en op-en-neer gaande beweging voorzichtig met de vingertoppen. Gebruik de instelbare bedieningselementen van de stereotaxisch eenheid optimaliseren fit.
3. Smeer de ogen met oogzalf. Het reinigen van de huid tussen de oren en ogen tweemaal met afwisselende toepassingen van een povidon-jodiume antiseptische en 70% EtOH.
4. Injecteren gekozen pijnstillende subcutaan (SQ) in de flank (of zoals voorgeschreven).

5 Voer Injectie

1. Bepaal de injectieplaats. De injectieplaats kan variëren met de grootte en de stam van de muis en het type cel. Cellen geïnjecteerd te dicht bij de ventrikels kunnen leiden tot cranio-spinale verspreiding van ziekten. Cellen geïnjecteerd te ondiep kan groeien door de naald spoor.
   Opmerking: In de hier getoonde experimenten werd het doelwit gedefinieerd als het frontale gebied van de cerebrale cortex een plaats 2,5 mm lateraal (rechts), 1.5 mm anterior en 3,5 mm ventraal ten opzichte van de fontanel werd gekozen (figuur 1), produceert een middenhersenen tumor in muizen van 20 tot 30 g.
2. Voeg een kleine incisie (~ 8 mm lang) met behulp van steriele techniek door de huid van het hoofd naar de bregma en de injectieplaats bloot. Een diagonaal gesneden, vanaf een punt tussen de middellijn as en het rechteroog naar het rechteroor ( Figuur 2) biedt toegang tot zowel de bregma en de injectieplaats.
3. Trek de huid en gebruik een steriel wattenstaafje om het oppervlak van de schedel drogen. Dep het bot met een bevochtigd met H ₂ O ₂ tot bregma visualiseren. De H ₂ O ₂ zal zuurstofbellen produceren, waardoor er dunne witte lijnen van schuim langs de coronale en sagittale hechtingen, die elkaar onder bregma.
4. Kleur een lege injectiespuit met naald op de micropomp en manoeuvreren de punt van de naald direct boven de bregma; set coördineert op de uitlijning console tot 0,0 mm lateraal, 0.0 mm voor / achter, en 0.0 mm ventrale / dorsale.
5. Breng de naald tot 2,5 mm lateraal (rechts) en 1,5 mm anterieur ten opzichte van bregma (of gewenste locatie) met de bedieningsknoppen op het stereotaxische apparaat. Til de injectiespuit in een licht en markeer de exacte locatie op de schedel met een speciale viltstift. Indien het buitenoppervlak van de schedel niet horizontaal te bregma met (i.e., de dorsale / ventrale coördineren niet langer nul staat), reset de ventrale / dorsale lezen op 0,0 om ervoor te zorgen dat de diepte van de injectie niet wordt verschoven.
6. Boor een gaatje in de schedel met een handbediende boormachine uitgerust met een steriele tandheelkundige tip op de juiste plaats voorzien van de pen in stap 5.5. Houd de boor in een hoek aan de schedel en heel zachtjes aanraken van de tip tot op het bot. Herhalen als nodig is. Boren bijna maar niet geheel door het bot, waardoor de naald daadwerkelijk dringen deze laag van de schedel, bepaalt het schoonste injectie.
7. Verwijder het bot stof met een wattenstaafje dat in PBS of zoutoplossing. Zet de spuit op de pomp en laat de naald recht naar beneden naar de braam gat naar de locatie te bevestigen. Als het boorgat niet in het midden met de naald, gebruik maken van de boor voor een vergroting van de opening.
8. Meng de celsuspensie en trekken de cellen in de spuit met behulp van de pomp controller. Vermijd bubbels en bosjes en veeg de naald with een alcoholdoekje om contaminerende cellen op het buitenoppervlak te verwijderen. Als de spuit / naald verstopt is of bevroren, te verwijderen en snel schoon met steriel water en 70% EtOH.
9. Zet de naald omlaag tot het niveau van de schedel oppervlak (0,0 mm ventraal / dorsaal). Dan langzaam (in ongeveer 1 min) lager de naald prikken door de volledige dikte van de schedel en de hersenen doordringen tot een diepte van 4 mm ventrall. Trek de naald langzaam tot 3,5 mm ventraal. Als de muis kop stevig vastgehouden in de stereotaxische apparaat, zou er bijna geen beweging van de schedel zijn.
10. Controleer of de juiste parameters in de pomp controller worden ingevoerd (paragraaf 2.2) en druk op "RUN / STOP" (of zoals voorgeschreven door de handleiding van het product) om cellen autoinject. Bewaken van de muis en stel isofluraan indien geïndiceerd. Let op de spuit en ervoor zorgen dat de zuiger beweegt zich in het vat. Bevroren of verstopte beweging kan resulteren in een gebogen / gebroken zuiger.
11. Wacht 1 tot 2 minuten met de naald in de bregen, dan heel langzaam (gedurende 3 tot 4 min) terugtrekken naald uit weefsel. Totale tijd om de naald te verwijderen na de injectie is voltooid is 5 minuten. Gebruik een wattenstaafje om het gebied rond het boorgat vlek; Laat de randen van de huid open om het bot drogen.
12. Haal de spuit uit de pomp en snel spoelen 3x met steriele H ₂ O, 3x met 70% EtOH, en 3x met steriele H ₂ O (of zoals voorgeschreven door maker). Veeg naald met EtOH en zet apart.
13. Toepassen steriele botwas (overeenkomend met 1 of 2 ui) aan het boorgat en gebruik het houten uiteinde van een steriel wattenstaafje om de was stampen op en in het bot. Als het oppervlak voldoende gedroogd moet blijven.
14. Verspreid steriel laken over de muis en het omliggende werkgebied en hechtdraad de incisie; drie steken moet voldoende zijn. Alternatief kan chirurgische kleefmiddel worden gebruikt. Breng een actueel antibioticum.
15. Verminder isofluraan tot 0% en verwijder de muis uit de stereotaxisch eenheid, zijnde careful om tanden te beschermen. Controleer de oren, mond en tong.
16. Bewaken van de muis volgt de injectie. Plaats muis op een warmte-pad 5 tot 10 min; vervolgens over te dragen aan de kooi (op warmte-pad) en observeren totdat de muis wakker en is ambulant. Laat de muis onbeheerd achter, totdat het genoeg weer bij bewustzijn is om borstbeen recumbence behouden. Laat de muis niet terug te keren naar het gezelschap van andere dieren tot ze volledig hersteld. Overweeg het gebruik van extra pijnstillende als tekenen van pijn zijn opgevallen.

6 Finish en Monitor Recovery & Tumor Development

1. Reinig alle instrumenten en apparatuur met 70% EtOH, een kraal sterilisator of ontsmettingsmiddel tussen muizen.
2. Controleer de geïnjecteerde muizen gedurende twee dagen na de procedure op tekenen van pijn, infectie of andere complicaties. Injecteren pijnstillende 24 en 48 uur (of zoals aangegeven) na de procedure. Verwijder hechtingen 7 tot 10 dagen, indien nodig.
3. Evalueer de muizen voor de klinische symptomen van de ziekte, paralysis, verminderde activiteit, gewichtsverlies, toevallen of algemene ziekte.
4. Controleer de tumorontwikkeling door de geschikte methode [magnetic resonance imaging (MRI), In Vivo Imaging Systems (IVIS), etc.].

Resultaten

Betrouwbare intracraniële xenotransplantaten kunnen worden gemaakt met deze techniek beschreven. Het identificeren van de kritische structuren van de schedel muis (Figuur 1) zal voor de erkenning van de bregma en begeleiden de onderzoeker om een nauwkeurige en reproduceerbare injectie locatie. In deze studies de ouderlijn U251, U251-cellen getransfecteerd met luciferase (U251-Luc) of U87 geïmmortaliseerde humane GBM weefselkweek cellen werden 4 tot 6 pl-SF DMEM gesuspendeerd en geïnjecteerd 2,5 mm later...

Discussie

Orthotopische muismodellen van menselijke hersenen kanker kan een uitstekend hulpmiddel voor het beoordelen van de effectiviteit van klinische therapieën te zijn, maar zorg moeten worden genomen om de plaatsing van de cellen in het hersenweefsel te optimaliseren. Studies hebben aangetoond dat overmatige hoeveelheid volumes suboptimale injectietechniek en haastige injectiesnelheden kan leiden tot lekkages en de verschijning van tumorcellen in ongewenste plaatsen (ventrikels, ruggenmerg, extradurale gebieden, etc.)

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Equipment
Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console	Kopf	Model 940
Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 923-B
Mouse Ear Bars	Kopf	Medel 922
Fiber Optic Illuminator	Fisher	12-562-36
UltraMicroPump III	WPI	UMP3
Micro4 microprocessor	WPI	UMC4
Variable speed hand-held rotary drill	Dremel	Model 300
Dental drill bit, 1.0 mm	Spoelting	514554
Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet	Dremel	481
Heating pad			voor muizen
Isoflurane vaporizer system			voor muizen
Medical tubing and connectors			om isoflurane vaporizer met stereotaxische frame te verbinden
Instruments
Precision 25 μl microsyringe	Hamilton	7636-01	Model 702, zonder naald
Microsyringe needles, 26s G	Hamilton	7804-04	RN, 25 mm puntstijl 2
Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)
Medium-sized standard scissors
Standard serrated forceps
Serrated hemostats (2)
Fine-tipped forceps
Supplies
Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)	MWI	J463G
Surgical blades #10, stainless (Feather)	Fisher	296#10
Isoflurane (Fluriso)	VetOne	NDC 13985-528-60	Item #502017. Vloeibaar inhalatieanestheticum. federale wet beperkt dit medicijn tot gebruik door of op bevel van een erkende dierenarts.
Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/ml)	Pfizer	NDC 61106-8507-01	verdunnen in zoutoplossing
Ophthalmic ointment (artificial tears)	Rugby	NDC 0536-6550-91
Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )	Akorn	NDC 17478-238-35
Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)	Betadine	NDC 67618-150-04
Hydrogen peroxide, 30%	Fisher	H325-100	voor het visualiseren van schedellandmerken
Sterile saline	VetOne	NDC 13985-807-25	voor het verdunnen van oplossingen, weefsel schoonmaken
Bone wax	WPI	Item #501771
Sterile drapes	McKesson	25-517
Sterile surgical gloves	McKesson	(om te passen)
Sterile gauze pads, 2 x 2	Fisherbrand	22028556
Sterile gauze pads, 4 x 4	Fisherbrand	22-415-469
Alcohol prep pads (medium)	PDI	B603
Sterile cotton-tipped applicators	Fisherbrand	23-400-114
Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells	USA Scientific	1405-4700	voor cellen
Individually wrapped sterile dispo pipettes	Fisher	BD 357575	voor naaldreningsoplossingen
BD insulin syringes with needles	Fisher	329461	voor pijnstiller
70% Ethanol			voor schoonmaken
Sterile diH2O			voor schoonmaken
Microfuge tubes for cleaning solutions			voor naaldreningsoplossingen
Felt tip pen (dedicated)			voor het markeren van de schedel