Methodenartikel

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

DOI:

10.3791/52021

⸱

6 november 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwitafbraak door de ubiquitine-proteasoom-systeem (UPS) is een belangrijk regulerend mechanisme voor proteïne homeostase in alle eukaryoten. De standaard aanpak voor het bepalen van intracellulaire eiwitafbraak vertrouwt op biochemische assays voor het volgen van de kinetiek van eiwit daling. Dergelijke methoden zijn vaak omslachtig en tijdrovend en derhalve niet vatbaar experimenten ter beoordeling van verschillende substraten en afbraakcondities. Als alternatief hebben celgroei gebaseerde testen ontwikkeld die, in hun conventionele formaat eindpunt assays die niet kwantitatief bepalen relatieve veranderingen in eiwitniveaus.

Hier een methode die getrouw bepaalt veranderingen in eiwitafbraak tarieven koppelen ze gistcel-groeikinetiek beschrijven we. De methode is gebaseerd op een vast selectiesysteem waarbij uracil auxotrofie van URA3 -deleted gistcellen wordt gered door een exogeen reportergen expressie, Bestaande uit een fusie tussen de essentiële URA3-gen en een degradatie determinant (degron). De reporter proteïne is ontworpen zodat de synthese constant is terwijl de afbraak wordt bepaald door de degron. Zoals celgroei in uracil-deficiënt medium evenredig met de relatieve niveaus van Ura3, groeikinetiek zijn volledig afhankelijk van de reporter eiwitafbraak.

Deze methode meet nauwkeurig veranderingen in intracellulaire eiwitafbraak kinetiek. Het wordt toegepast op: (a) Bepaling van de relatieve bijdrage van bekende ubiquitine conjugeren factoren proteolyse (b) E2 conjugeren enzym structuur-functie analyse (c) de identificatie en karakterisatie van nieuwe degrons. Toepassing van de degron- URA3 gebaseerde systeem overstijgt het veld eiwitafbraak, als het kan worden aangepast aan het volgen van veranderingen van eiwitten die samenhangen met functies van andere moleculaire processen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ubiquitine-proteasoom degradatie systeem is een belangrijke regulerende machine, die is betrokken bij het handhaven van homeostase eiwitten in alle eukaryoten. De UPS conjugaten eerst meerdere ubiquitine moleculen aan een doeleiwit waarna de poly-ubiquitine-gemerkt eiwit wordt afgebroken door het 26S proteasoom. In de meeste gevallen, de snelheidsbepalende stap voor ubiquitine gemedieerde afbraak beperkt is substraat ubiquitinering, gemedieerd door conjugeren van enzymen E2 en E3 ligeren enzymen (E3 ligasen) 1. Bijgevolg intracellulaire stabiliteit van eiwitten weerspiegelt hun gevoeligheid voor ubiquitine conjugatie en de activiteit van hun verwante ubiquitinering enzymen.

E3 ligases zijn de belangrijkste componenten substraat erkenning van de UPS. Als zodanig zijn deze enzymen herkennen degrons in hun substraten die ofwel afwezig of niet blootgesteld in de stal 2 tegenhangers. Bijvoorbeeld, veel regulatoren van de celcyclus must worden gesynthetiseerd en afgebroken in een tijdelijk specifieke manier om voortgang van de celcyclus in orde te houden. De afbraak van deze eiwitten wordt vaak geregeld door fosforylering-gemedieerde signaaltransductie gereguleerde kinasen 3,4. Aan de andere kant, zijn afwijkend gevouwen eiwitten herkend door cryptische degrons. Dit zijn gebieden die normaal verborgen in de natieve structuur worden blootgesteld aan structuur verstoring. Dergelijke degrons omvatten hydrofobe domeinen 5-7 en intrinsiek ontvouwen segmenten 8.

Aangezien de rudimentaire ontdekking van het ubiquitine-systeem eiwitafbraak en karakterisering van de fundamenten in reticulocyten-lysaten 9, gist genetica was instrumenteel ontdekken vele componenten van het ubiquitine systeem 10. Het succes van gist als modelorganisme voor systematische analyse van eiwitafbraak door de UPS is vooral te wijten aan het feit dat de UPS hoogly geconserveerd in alle eukaryoten 4, in combinatie met zeer geschikt zijn als een experimenteel systeem. Inderdaad, gist gebaseerde systemen algemeen gebruikt om de werkingsmechanismen van de ubiquitinering machine ontcijferen.

Studeren eiwitafbraak door biochemische middel meestal vereist voorbereiding van cel extracten. Terwijl dierlijke cel eiwitten onder relatief milde omstandigheden dat eiwit interacties en functie behouden kunnen worden geëxtraheerd, de aanwezigheid van een stevige celwand van gist 11 zijn aanmerkelijk zwaardere verstoring voorwaarden eiwit herstel kunnen beïnvloeden. Sterker nog, verschillende procedures voor gistcel verstoring verschillen aanzienlijk in hun mogelijkheden om intacte eiwitten herstellen in hoeveelheden die hun relatieve cellulaire overvloed correct voor te stellen. Verder onnauwkeurigheid is inherent aan de verschillende methoden voor het bepalen afbraaksnelheden van specifieke eiwitten: Metabolisch labelen based 'pulse-chase experimenten van gevolgd door immunoprecipitation, specifieke eiwitten 12 isoleren, is vaak niet strikt kwantitatief. Dus, als afbraak van eiwitten wordt vergeleken met deze methode, extra voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van de resultaten. Om dit nadeel te omzeilen, kan een alternatief cycloheximide (CHX) chase assay worden gebruikt 12. In deze test wordt de vertaling inhibitor toegevoegd aan celculturen en temporele veranderingen in eiwit steady-state niveaus worden vervolgens gecontroleerd. Niettemin is het gebruik van CHX beperkt tot eiwitten met relatief korte halfwaardetijden (<90 min), de inhibitie van de eiwitsynthese langdurige cytotoxisch. Met name beide bovengenoemde assays vereisen het gebruik van eiwit-specifieke antilichamen, die niet altijd beschikbaar zijn.

Om deze technische beperkingen te overwinnen, hebben de onderzoekers verschillende benaderingen die niet celextractie en directe eiwit behandeling nodig hebben ontwikkeld. Een benadering is gebaseerd op de vaststelling van auxotrofe yeast stammen, verkregen door deletie van genen die coderen voor essentiële metabole enzymen. Dergelijke genen omvatten HIS3, LEU2, LYS2 en TRP1, coderen voor enzymen die nodig zijn voor aminozuur biosynthese en URA3 dat OMP decarboxylase codeert (Ura3), een enzym van pyrimidine biosynthese ribonucleotide. Ura3 is op grote schaal gebruikt in de eiwitafbraak studies. In deze testen constitutieve expressie van Ura3 redt groei van ura3 cellen in uracil-deficiënt medium 13. Derhalve gedestabiliseerd Ura3 door de fusie van een degron kan celgroei verspilling van minimaal medium zonder uracil. Deze werkwijze is gebruikt in diverse eiwitafbraak onderzoeken, inclusief de identificatie van determinanten degradatie 5, E3 ligasen 14 en hulpstoffen ubiquitinering factoren 15 en de ontdekking van nieuwe UPS degrons 16. Al deze methoden celgroei op agarplaten als assay uitlezing. Echter, tHij groei criterium (positieve / negatieve groei), terwijl robuust en efficiënt is meestal kwalitatieve en niet kwantitatieve informatie die belangrijk is voor het evalueren potentie een degron of de relatieve bijdrage van de verschillende hulpstoffen afbraak factoren verschaffen.

We hebben daarom en gebruikt gistvectoren en selectie mogelijk systematische en kwantitatieve analyse van eiwitafbraak door de URA3 -degron fusiesysteem. Het protocol is gebaseerd op een eenvoudig te hanteren assay die Groeikinetiek meet in vloeibare kweek onder selectieve omstandigheden (Gils) en het genereren van standaard groeicurves. Gist groei kinetiek worden gekenmerkt door drie fasen - de vertraging, de exponentiële (log) en de stationaire fase. Berekening van gist replicatie kinetiek gedurende de log-fase onder selectieve omstandigheden, die wordt bepaald door de niveaus van expressie van het Ura3-degron, geeft een onbevooroordeelde kwantitatieve meting of eiwitafbraak. Deze methode kan worden toegepast voor het meten en vergelijken van afbraaksnelheden van meerdere UPS substraten gelijktijdig meerdere stammen en onder verschillende omstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek

  1. Transformeer de geschikte auxotrofe gistcellen, zoals Try467 (tabel 2), met een plasmide dat (a) een URA3 -degron fusie en (b) een additionele metabole merker voor plasmideselectie en onderhoud.
    Opmerking: Een voorbeeld van een geschikte plasmide-YDpK MET25p-° 1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dit is een gist integratief plasmide dat een fusie-eiwit omvattende ° 1 - een degron afgeleid uit de gisttranscriptiefactor. factor Mat2 17, FLAG epitoop - voor detectie door immunoblotting, Vma12 - een stabiele ER eiwit, en Ura3 15,18 (Figuur 3A). (Zie Tabel 3 voor plasmiden die in deze studie en aanvullende voorbeelden van geschikte plasmiden.)
  2. Voor plasmideselectie onderhoud houden cellen in agarplaten onder een geschikte synthetische Defined (SD) medium zonder aminozuur selectiemerkers 19 (bijvoorbeeld ° 1 -UV geselecteerd onder SD-LYS selectief medium gehandhaafd).
  3. Kweek cellen O / N bij 30 ° C in een geschikt selectief medium voor SD plasmide onderhoud tot een stationaire fase is bereikt. Groeien de cellen in reageerbuizen of in een 96-well plaat, afhankelijk van het aantal te onderzoeken monsters (deel 2).

2. Cel Voorbereiding voor Analyse

  1. Bij een klein aantal monsters (N≤15) moeten worden getest, verdun de cellen en het medium vervangen als volgt:
    1. Verdun 50 pi cellen van een O / N kweek met 150 pl SD medium per putje in een 96-well plaat (heldere bodem). Let op, het eerste monster wordt aangeduid als blanco bevat medium alleen.
    2. Bepaal de OD 600-waarden van de monsters in de 96-well plaat met een microplaat lezer.
    3. Bereken de werkelijke OD 600 in elk putje van de OD 600 lezing van de verdunningsfactor (x4) te vermenigvuldigen, uit which de waarde van de blanko afgetrokken. Normaliseren van de verkregen waarden te delen door 0,55 tot een berekende padlengte van 1 cm volgens de Beer-Lambert wet verkrijgen. Merk deze waarde constant bij het ​​meten van de OD 600 van 200 ul cellen in een standaard 96-putjesplaat.
    4. Bereken de exacte benodigde volume voor het verkrijgen van gistcellen in bedrag ter OD600 van 0,25 en overgebracht naar een Eppendorf buis.
    5. Spin down van de cellen met een hoge snelheid (12.000 xg) gedurende 1 min.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml van het geschikte selectieve medium (zie paragraaf 3.1) te verkrijgen OD 600 van 0,25.
    7. Breng 200 pi van de verdunde stammen een nieuwe put in een 96-well plaat.
  2. Wanneer een groot aantal monsters (N> 15) te testen, verdun de cellen en plaats het medium zonder voorafgaande OD600 metingen als volgt:
    1. Breng 10 pl stationaire cellengegroeid O / N in een 96-wells plaat in een nieuwe 96-well plaat met 190 pl (verdunning 1:20) van de geschikte selectieve media (zie paragraaf 3.1).

3. Groei Kinetics in Liquid Culture onder Selectief Voorwaarden (Gils)

  1. Gebruik de volgende media voor groei metingen met behulp van de Ura3-degron reporter:
    1. Voor de positieve controles van groei gist onder niet-beperkende voorwaarden, gebruik plasmide selectieve SD media (zie paragraaf 1.2). Indien geen plasmideselectie vereist, bijvoorbeeld bij gebruik van een integratieve plasmide zoals ° 1 -UV, SD medium dat alle benodigde aminozuren (SD volledig) worden gebruikt.
    2. Voor experimentele monsters meten groei onder beperkende voorwaarden, gebruik maken van SD-URA medium.
  2. Stel een multimode microplaat lezer. Een incubatietemperatuur van 30 ° C, OD 600 meetintervallen van 15 min, en een orbitaal schudden en lineaire cycli van 1 min zeven min
    OPMERKING: Deze dual-mode schudden werd geoptimaliseerd om een ​​homogene verdeling van de cellen te verkrijgen; kunnen evenwel ook andere schudden modes of zelfs geen schudden zo goed werkt.
  3. Incubeer de cellen bij 30 ° C in een microplaat reader O / N of totdat de cellen de stationaire fase (12-24 uur) bereikt.
  4. De ruwe data te exporteren naar een spreadsheet-bestand.
  5. Bepaal gist groeikinetiek behulp MDTcalc, een aangepaste software-programma dat de minimale tijd berekent (in uur) voor de cellen om hun bevolkingsomvang verdubbelen (Minimal Verdubbeling Time (MDT), voor meer informatie zie hoofdstuk 4).

4. Berekening van de Minimal Verdubbeling Time (MDT): Principes van de MDTcalc Algorithm

OPMERKING: Principes van het MDTcalc algoritme, met een representatief monster van Try467 gistcellen (tabel 2) gekweekt in SD compleet medium, worden weergegeven in tabel 1 en figuur 1, die een data spreadsheet en groei plots, respectief.

  1. Aftrekken OD 600 blanco waarden verkregen in de desbetreffende holte van elk van de verkregen in de monsterhouder metingen. Verdeel de resulterende verschillen met 0,55 (96-well platen) te corrigeren voor de lengte lichtweg. Zet de eindwaarden (tabel 1, Trans.) Tegen de tijd om de werkelijke gist groeicurve (OD 600 / hr) (Figuur 1A) produceren.
  2. Bereken log 2 (OD 600) voor elk van de getransformeerde waarden van de logaritmische groeifase te zetten in een lineaire curve (Figuur 1B).
  3. Bereken de helling van 10 tijdstippen interval (N = 10) begint op tijdstip 0 en één tijdpunt bewegen in tot N <10 (tabel 1, Slope Figuur 1C).
  4. Bereken de inverse waarde van elke helling naar de tijd die de celpopulatie verdubbelen verkrijgen (tabel 1, 1 / Slope Figuur 1C). Bereken de minimale1 / Helling waarde voor de MDT (Figuur 1C Tabel 1, zwarte rechthoek) te bepalen. Extraheer de berekende MDT van cellen in het monster (Tabel 1, 1 / Helling, zwarte rechthoek) vanaf het geselecteerde tijdsinterval (Tabel 1, door rode rechthoek geschetst, Figuren 1B, 1D).
    OPMERKING: De snelheid van celgroei op SD-URA medium is omgekeerd evenredig met de MDT.

5. Met behulp van MDTcalc

  1. Kopieer de aangevulde programma bestanden in een opgegeven map op de computer.
  2. Zorg ervoor dat de spreadsheet-bestand met de groei van data wordt opgeslagen en gesloten. Open het MDTcalc applicatieprogramma aan de start verschijnt zien.
    1. Plaats de benodigde informatie, zoals getoond in Figuur 2:
      1. Onder 'Bestand pad', klikt u op de rechthoek aan de rechterkant om de spreadsheet bestand te zoeken.
      2. Onder 'Vel naam', schrijf de naam spreadsheet waar thij ruwe data zich bevindt.
      3. Onder 'Uitgangspositie', steekt u de spreadsheet-coördinaat van de tijd 0 van het eerste monster.
      4. Onder 'Time column', plaatst de brief het definiëren van de locatie van het tijdstip kolom (tijd moet worden voorzien in seconden).
      5. Onder "lege kolom, plaatst de letter definieert de locatie van de lege kolom (meestal, maar niet noodzakelijk in goede A1 van de 96-well plaat).
      6. Onder 'OD-waarde', kies de minimale getransformeerd OD 600 waarde die nodig is voor de start van de MDT-berekening (meestal 0,15-0,25). Stel deze waarde in voorkomt berekeningen van MDT voor culturen in lag-fase als gevolg van overmatige verdunning zodat MDT wordt alleen berekend voor monsters die de gedefinieerde OD 600 waarde of hoger bereiken.
    2. Zodra de laatste waarde is ingevoerd, drukt u op de 'berekenen' knop aan de onderkant van het scherm. Zorg ervoor dat de voortgangsbalk op de rechter verandert geleidelijk te green. Gebruik de spreadsheet bestand niet openen tijdens het rekenproces.
    3. De twee reeksen gegevens die automatisch op het scherm bij het voltooien van de MDT berekening in een spreadsheet exporteren. Zorg ervoor dat de gegevens bevat: (a) de MDT waarde voor elk goed dat de minimale OD-waarde test (zoals vermeld in paragraaf 5.2.1.6) en (b) de oorspronkelijke tijdstip van het interval waaruit de MDT werd berekend passeert (Start tijd).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoeken de rol van enzymen van de Doa10 route in de afbraak van een reporter substraat

Om de geldigheid van de GILS werkwijze werd vergeleken met een traditionele degradatie assay te testen. Dit experiment evalueert de relatieve bijdrage van componenten van de ER-membraan gelokaliseerde Doa10 E3-ligase complex 20,21 de afbraak van het eiwit kwaliteitscontrole reporter substraat Deg1- VU (Figuur 3A). De Deg1- VU plasmide geïnt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een test op basis van de celgroei voor het bepalen van de relatieve eiwitafbraak prijzen, genoemd 'Groeikinetiek in Liquid cultuur onder Selectief omstandigheden' (Gils). De Gils assay heeft een aantal voordelen: Het is eenvoudig in te stellen, data-acquisitie en analyse is eenvoudig en het is uiterst modulair. Bijgevolg kan gils gelijktijdig uitgeoefend op meerdere monsters in een gebruiksvriendelijke multi-well plaat formaat dat kan worden aangepast aan automatisering voor high throughput t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Yuval Reiss en Dr. William Breuer voor het kritisch beoordelen van het manuscript en Omri Alfassy voor de hulp bij de ontwikkeling van de Ura3-GFP screen assay. We danken ook Dr. M. Hochstrasser en Dr. R. Kulka voor plasmiden en stammen. Dit werk werd gefinancierd door de Israelische Academie van Wetenschappen (subsidie 786/08) en door de Verenigde Staten-Israëlische Binationale Wetenschappelijke Stichting (subsidie 2011253).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids en ammonium sulfateBD Biosciences233520Voor gistgroei op SD minimaal media.  Aminozuren die geleverd moeten worden zijn: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Fenylalanine, Threonine, Tryptophan
AmmoniumsulfaatSigma - AldrichA4418
GlucoseSigma - Aldrich16325
AdenineSigma - AldrichA8626
UracilSigma - AldrichU0750
AminozurenHoogste beschikbare zuiverheid 
96-wells platenNunc167008Elk ander compatibel merk kan worden gebruikt
Cyclohexamide Sigma - AldrichC7698Werkconcentratie 0,5 mg/ml
Infinite 200 PRO-serieTecanVoor gistincubatie en OD600 metingen. Elke andere compatibele temperatuur-gecontroleerde lezer kan worden gebruikt.
MDTcalcExperimentele software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
  3. Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
  4. Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
  5. Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
  6. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  7. Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
  8. Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
  9. Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
  12. Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
  13. Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
  14. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
  15. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
  16. Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
  17. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  18. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
  19. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
  20. Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
  21. Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
  22. Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
  23. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
  24. Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
  25. Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GistgroeianalyseURA3 reportersysteemdegron fusiemicroplaatlezergroeikinetiekminimale verdubbelingstijdubiquitine proteasoomE2 conjugerende enzymenidentificatie van nieuwe degrons

Gerelateerde artikelen