De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Samenvatting

Een protocol voor entorhino-hippocampus organotypische slice culturen, die het mogelijk maakt het reproduceren vele aspecten van ischemisch hersenletsel, wordt gepresenteerd. Door het bestuderen van veranderingen in de neurovasculatuur naast veranderingen in de neuronen, dit protocol is een veelzijdig gereedschap plastic veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging.

Samenvatting

Ischemisch hersenletsel is een van de meest voorkomende en verwoestende omstandigheden afbreuk goede werking van de hersenen en leidt vaak tot blijvende functionele tekorten in de getroffen patiënten. Ondanks intensief onderzoek is er nog steeds geen effectieve behandeling optie die neuronale schade vermindert en beschermt neuronen in de ischemische gebieden van vertraagde secundaire dood. Onderzoek op dit gebied omvat gewoonlijk het gebruik van ingewikkelde en problematische diermodellen. Entorhino-hippocampus organotypische slice culturen uitgedaagd met zuurstof en glucose deprivatie (OGD) gevestigd zijn in vitro modellen die cerebrale ischemie na te bootsen. Het nieuwe aspect van deze studie is dat veranderingen in de hersenen bloedvaten bestudeerd naast neuronale veranderingen en de reactie van zowel neuronale compartiment en het vasculaire compartiment kan worden vergeleken en gecorreleerd. De in dit protocol de werkwijze van de mogelijke toepassingen van de substantieel te verbreden ofganotypic slice cultuur aanpak. De inductie van OGD of hypoxie kan met vrij eenvoudige middelen in organotypische slice cultures worden toegepast en leidt tot betrouwbare en reproduceerbare schade in neuraal weefsel. Dit staat in schril contrast met de ingewikkelde en problematische dierproeven inducerende beroerte en ischemie in vivo. Door verbreding van de analyse voor de studie van de reactie van het vaatstelsel nieuwe manieren over hoe om te behouden en te herstellen de hersenfuncties zou kunnen bieden omvatten. De slice cultuur aanpak hier gepresenteerd zou kunnen ontwikkelen tot een aantrekkelijk en belangrijk instrument voor de studie van ischemisch hersenletsel en kan nuttig zijn voor het testen van potentiële therapeutische maatregelen gericht op neuroprotection zijn.

Inleiding

Het centrale zenuwstelsel is bijzonder gevoelig voor verlies of vermindering van zuurstof en glucose levering door de vasculatuur. Zelfs een vrij korte onderbreking van de bloedtoevoer naar de hersenen kan een permanent verlies van functie van het betreffende hersengebieden die tot de typische beroerte syndromen veroorzaken. Naast de neuronaal verlies in de primaire getroffen gebieden, is er meestal extra vertraagde neuronale verlies door secundaire schade. Helaas heden geen neuroprotectieve behandeling voor de vermindering van secundaire neuronale dood beschikbaar ^1. Onderzoeksinspanningen voor het bestuderen van de mechanismen van secundaire schade afhankelijk van het gebruik van dierlijke modellen van cerebrale ischemie, zoals midden cerebrale slagader occlusie en diverse trombotische occlusie technieken (voor een recent overzicht zie ^2). Parallel, ook als gevolg van beperkingen en ethische bezwaren met gebruik van diermodellen, organotypische slice cultuur van verschillende CNS weefsels gebruikt dat de stu toestaandy van neuronale reacties op verschillende soorten verwondingen ^3-5.

Voor het bestuderen van de neuronale reactie onder omstandigheden die ischemische hersenschade na te bootsen, is het modelsysteem zuurstof glucosedeprivatie (OGD) ontwikkeld. In dit model worden slice cultures tijdelijk blootgesteld aan een medium dat glucose mist en is geëquilibreerd met stikstofgas in afwezigheid van zuurstof. Met een dergelijke behandeling is het mogelijk om neuronaal letsel en schade die vrij vergelijkbaar met die waargenomen na ischemisch letsel in vivo ^{6, 7} induceren. In de hippocampus, een dergelijke behandeling induceert specifiek neuronaal verlies in het CA1, maar niet in de CA3 gebied of de dentate gyrus van de hippocampus. In tegenstelling, de studie van vasculaire reacties slice cultures nu toe niet op grote schaal uitgevoerd. Een voor de hand liggende reden is het gebrek aan circulatie en bloedvat perfusie in de slice cultuur-model. Wij hebben echter eerder aangetoond dat het mogelijk is b handhavenlood schepen in CNS slice culturen voor meerdere dagen ^{8, 9.}

Het algemene doel van deze methode is om niet alleen toezicht houden op de lot van neuronen na OGD maar de studie uit te breiden tot het lot en de herinrichting van het vaatstelsel dat een belangrijk deel van de schade respons. Tot nu toe dergelijke studies het gebruik van dierproeven hebben geëist (. De Jong et al, 1999; Cavaglia et al, 2001.). In de hier gepresenteerde protocol, we detail hoe deze studies kan op entorhino-hippocampale organotypische slice cultures uitgedaagd ofwel met hypoxie of door excitotoxische laesies gevolgd door analyse van zowel neuronale overleving en bloedvaten reacties. Dit protocol is gebaseerd op een eerder gepubliceerde studie hierover ¹⁰ en kan nuttig zijn voor een laboratoriumtest vindt het neurovasculaire interacties in het CZS.

Protocol

Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen van de Raad van 22 september 2010 worden uitgevoerd (2010/63 / EU) en werden beoordeeld en toegestaan ​​door de Zwitserse autoriteiten.

1 instellen Organotypische Entorhino-hippocampus Slice culturen

1. Bereid entorhino-hippocampus organotypische slice culturen (EHOSCs) van postnatale dag 4 (P4) muis pups met behulp van de statische incubatie methode ^4,11. Hier gebruiken C57Bl6 en CB6F1 muizen.
   1. Duurt ongeveer 30 minuten per muis pup voor de voorbereiding van slice culturen, dat wil zeggen, 3 uur voor een nest van 6 pups muis. Het uitvoeren van alle stappen onder steriele omstandigheden in een laminaire stroming werkbank met gesteriliseerde chirurgische instrumenten.
   2. Met het oog op een mogelijke storing van de positie van het segment samen de Septo-temporele as te voorkomen uitsluitend hippocampus plakjes van het septum helft. Indien niet anders vermeld, het uitvoeren van alle stappen bij RT.
2. Afgesneden thij hoofd van een P4 muis pup met chirurgische schaar. Geen verdoving nodig voor deze stap.
   1. Verwijder de schedel rond de hersenen en het identificeren van de kloof tussen het caudale einde van de hersenhelften en de middenhersenen. Verwijder voorzichtig het gedeelte van de hersenen rostraal van de middenhersenen van de schedel en plaats deze in ijskoud bereiding medium bestaande uit MEM aangevuld met een gestabiliseerde vorm van L-glutamine.
3. Blijven de dissectie onder een stereomicroscoop met de hersenen wordt ondergedompeld in het ijskoude voorbereiding medium. Verwijder de resterende hersenvliezen van de corticale hemisferen. Identificeer de hippocampus op het caudale mediale oppervlak van de halve bol en scheiden samen met het aangrenzende entorhinale cortex van de rest van de hersenen.
   1. Breng het weefsel een weefsel chopper en snijd 400 urn dikke plakken onder aseptische omstandigheden dwars op de Septo-temporele as van de hippocampus.
4. Leg de plakjes op cell cultuur inserts (ongeveer 6 segmenten per insert) en incubeer ze in 6-well platen met 1 ml per putje incubatiemedium (47 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml paardenserum, 1 ml glutamax I, 1 ml van een steriele 10% glucose-oplossing, pH 7,3) in een bevochtigde atmosfeer met 5% _CO2 bij 37 ° C. Verander het medium de volgende dag en dan om de andere dag tot 1 week.

2 In Vitro Hypoxie en zuurstof-glucose beroving met Reperfusie

1. Zie tabel 1 voor een exacte tijdschema van de procedure. Cultuur EHOSCs voor 5 dagen (DIV5) voor de blootstelling aan hypoxie of OGD. Op dat tijdstip schakelt het medium incubatiemedium met 25% paardenserum om serum-vrij medium met de volgende samenstelling: Neurobasal medium met 2% B27 supplement, 1% glutamax en extra 0,1% glucose.
2. Bereid de OGD medium zoals beschreven in Reference 7 .De uiteindelijke concentraties van de componenten zijn de volgende: 0.3mM _CaCl2, 70 mM NaCl, 5,25 mM _NaHCO3, 70 mM KCl, 1,25 mM NaH _{2PO 4,} 2 mM _MgSO4 en 10 mM sucrose bij pH 6.8. Voeg 1 ml van OGD medium aan elk putje van twee 6-well weefselkweekplaten.
   1. Perfuseren de OGD medium met _N2 gedurende 1 uur in een kamer hypoxie en verzegel en bewaar O / N in een incubator bij 37 ° C.
   2. Gebruik anaërobe strips als hypoxische indicatoren. Beschouw het medium zuurstofvrij wanneer de kleur van de stroken veranderd van roze naar wit.
   3. Voor de inductie van hypoxie, gebruik serumvrij medium met glucose plaats van OGD medium. Voor het gebruik, perfuse het medium met _N2 in een hypoxie kamer zoals hierboven beschreven voor OGD medium.
3. Voor de plakjes worden blootgesteld aan OGD, perfuseren de OGD medium opnieuw met _N2 gedurende 30 minuten. Voeg 2 ui van een 1 mg / ml propidiumjodide (PI) oplossing per putje (voor een uiteindelijke concentratie van 2 ug / ml) aan de schijfjes gedurende 30 min en selecteeralleen gezond plakjes voor experimenten zoals aangegeven door lage aantallen PI positieve cellen.
4. Gebruik het tijdschema OGD blootstelling en reperfusie in figuur 1. Beroven plakjes hetzij alleen zuurstof (hypoxie) of zuurstof en glucose (OGD) gedurende 15 minuten.
   1. Voor de inductie van hypoxie of OGD, overdragen plakjes in OGD medium en bewaar ze voor 15 min in de hypoxie kamer. Zorg ervoor dat alle vloeistoffen die blijven de zijkanten van het inzetstuk weg aangezogen wanneer de kweken overgang van reguliere medium OGD medium en terug.
   2. Na hypoxie of OGD, vervangen OGD zuurstofrijk medium serumvrij medium en kweken mogen herstellen gedurende 3, 24 of 48 uur in serumvrij medium in de normale incubator bij 37 ° C met 5% _CO2. PI Voeg nogmaals vóór bevestiging voor de bepaling van celdood.

3 farmacologische behandelingen van Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

1. Culture EHOSCs voor 5 dagen (DIV5) in incubatie medium voor de blootstelling aan farmacologische behandelingen. Beginnen farmacologische behandelingen hetzij tijdens of onmiddellijk na OGD OGD wanneer plakjes worden overgebracht naar serumvrij medium.
2. Behandelingen voor de bescherming van OGD.
   1. Voeg 100 uM 6-cyaan-7-nitrochinoxaline-2,3-dion (CNQX) of 1 uM tetrodotoxine (TTX) aan het kweekmedium tijdens OGD inductie (15 min) of onmiddellijk na OGD inductie gedurende 30 minuten. Vervolgens incuberen in normoxische serumvrij medium gedurende 48 uur vóór fixatie.
3. Behandelingen voor de inductie van excitotoxische dood.
   1. Na 5 dagen incubatie medium schakel kweken op medium dat 100 uM (RS) -α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) gedurende 30 min serum.
   2. Verwijder het kweekmedium met AMPA door aspiratie (hij eventuele resten van het medium op de inserts te verwijderen), vervolgens over de plakjes verse platen met normale serum vrij medium enbewaar ze voor 48 uur tot fixatie.

4 Fixatie en Immunokleuring van Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

1. Propidium jodide (PI) kleuring.
   1. PI's van 30 min aan het kweekmedium van levende segmenten in een concentratie van 2 ug / ml. Bekijk levende culturen met een omgekeerde microscoop uitgerust met fluorescentie optiek en selecteer plakken voor verdere behandelingen. Voor PI kleuring in combinatie met immunohistochemie, commentaar PI oplossing 30 min voor fixatie van de kweken.
2. Fixatie van de plakjes.
   1. Verwijder het kweekmedium van de 6-well plaat en voeg 3 ml vers bereide 4% paraformaldehyde (PFA) in elk putje. Plaats de 6-well plaat in een koelkast en lossen O / N bij 4 ° C.
   2. Verwijder de PFA oplossing de volgende dag was de plakjes 3-4 keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
3. Verwijdering van de segmenten van de celkweek insert en het blokkeren van de procedure voor immunohistochemie van vrij zwevende delen.
   1. Voorzichtig los en verwijder de plakjes uit de inserts cultuur met een kunst penseel van de maat 0 of kleiner. Breng elk individu sneetje in een putje van een plaat met 96 putjes gevuld met blokkerende buffer (PBS met 3% normaal geitenserum (NGS) en 2% Triton-X100). Houd de segmenten in de blokkerende buffer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder constant roeren met een rondschudapparaat.
4. Immunokleuring van de slice culturen
   1. Voor labeling bloedvaten polyklonale anti-laminine bij een verdunning van 1: 200 in PBS bevattende 1% NGS en 0,5% Triton-X100.
   2. Voor labeling neuronen gebruiken anti-microtubule geassocieerde proteïne 2 (MAP2) bij een verdunning van 1: 500 in PBS bevattende 1% NGS en 0,5% Triton-X100.
   3. Incubeer de segmenten met primaire antilichamen gedurende 48 uur bij 4 ° C onder constant roeren. Na de incubatieperiode wassen in PBS met 0,5% Triton-X100 voor 3-4 keer.
   4. Verdun secundaire antilichamen 1: 500 in PBS bevattende 1% NGS en 0,5% Triton-X100. Incubeer de schijfjes gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker met de Alexa fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen. Toepasselijke geit anti-konijn of geit anti-muis secundair antilichaam geconjugeerd met Alexa 350 of 488.
   5. Verwijder het secundaire antilichaam oplossing en was de schijfjes driemaal met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS); monteer ze op glasplaatjes en dekglaasje de dia's met Mowiol.
5. Microscopie van de gebrandschilderde plakjes
6. Bekijk de gekleurde schijfjes worden op een standaard microscoop met epifluorescentie apparatuur of met een confocale microscoop. Maak opnamen met een geschikte camera. Voor sommige foto's, draai de fluorescentie contrast om donkergele schepen op een lichte achtergrond geven (figuur 5 en 6).

5 Bepaling van de Regionale Vessel Density in de culturen

1. Kwantificeren van de vessel dichtheid gebaseerd op schip kruisingen zoals beschreven in referentie 8.
2. Gebruik plakjes gekleurd voor laminin voor deze metingen. Superponeren opgenomen beelden van 10x vergroting met een 6 x 6 rooster, waarbij elk rooster is gelijk aan 100 x 100 micrometer per vierkante, totale gebied van 0,25 mm ^2.
3. Overlay drie van dergelijke roosters in de CA1, CA3, DG en EG (Figuur 2). De vaartuigen die de lijnen van het raster te tellen.
4. Voor het behalen van resultaten met een goede statistische relevantie, maken metingen in minstens 3 onafhankelijke experimenten, elk met gegevens uit 3 muis pups met 3 plakjes per muis pup.
5. Bepaal de gemiddelde waarde van het vaartuig overtochten van de netten voor elke regio en het uitvoeren van een statistische analyse met ANOVA met Bonferroni correctie als post hoc-test (p <0,05 gedefinieerd als significant) met behulp van geschikte statistische software.

Resultaten

Zuurstof glucose ontbering en hypoxie induceert neuronale dood en vermindering van bloedvaten met name in de hippocampus CA1 regio.
OGD of zuurstof-deprivatie alone gedurende 15 minuten induceerde een sterke inductie van celdood zoals gezien door propidium iodide kleuring specifiek in het CA1 gebied van de hippocampus (figuur 3) hetzelfde als hiervoor ⁷ beschreven. Met markers het netwerk van bloedvaten te visualiseren, werd vastgesteld dat bloedvat dichtheid en organisatie ve...

Discussie

Met de hier beschreven werkwijzen kunnen hippocampale organotypische slice cultures worden gebruikt als een veelzijdige tool kunststof veranderingen in hersenweefsel bestuderen na beschadiging. Terwijl organotypische slice cultures in het verleden gebruikt voor het bestuderen van neuronale reacties na ischemie ^{6, 7} de nieuwe aspect van de gelijktijdige onderzoek van vasculaire veranderingen verbetert aanzienlijk de mogelijke toepassingen van deze methode. De inductie van OGD of hypoxie kan met vrij eenvoudige...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Minimum Essential Medium MEM	Gibco	11012-044
Glutamax	Gibco	35050-061	gestabiliseerde vorm van L-glutamine
Millicell cell culture inserts	Millipore	PICM03050
Basal medium Eagle	Gibco	41010-026
Paarden serum	Gibco	26050-088
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
B27 supplement	Gibco	17504-044
Anaërobe strips	Sigma-Aldrich	59886
Propidium jodide oplossing	Sigma-Aldrich	P4864
AMPA	R&D systems	0169-10
CNQX	R&D systems	0190/10
TTX	R&D systems	1078/1
Polyklonaal anti-laminine	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-MAP2	Abcam	ab11267
Alexa anti-muis 350	Molecular Probes	A11045
Alexa anti-muis 488	Molecular Probes	A11001
Alexa anti-konijn 350	Molecular Probes	A11046
Alexa anti-konijn 488	Molecular Probes	A11008
Statistieken software	GraphPad Software	GraphPad Prism
McIlwain weefselsnijder	Ted Pella	10180
Hypoxiekamer	Billups-Rothenberg	MIC-101