Methodenartikel

Kwantitatieve immunofluorescentiebepaling op het Variatie in eiwitgehalten op centrosomes Maatregel

15K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52030

⸱

20 december 2014

 , 
1Department of Molecular Genetics, The Ohio State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een nieuwe kwantitatieve fluorescentietest ontwikkeld om veranderingen in het niveau van een specifiek eiwit op centrosomen te meten door de fluorescentie-intensiteit van dat eiwit te normaliseren naar die van een geschikte interne standaard.

Samenvatting

Centrosomen zijn kleine maar belangrijke organellen die dienen als de polen van mitotische spoel om genomische integriteit te behouden of te assembleren primaire cilia op zintuiglijke functies in cellen te vergemakkelijken. Het niveau van een eiwit verschillend geregeld op centrosomes dan bij andere .cellular locaties, en de variatie in de centrosomal niveau van verscheidene eiwitten op verschillende punten van de celcyclus wordt essentieel voor een goede regeling van centriole samenstel te zijn. We ontwikkelden een kwantitatieve fluorescentie microscopie test die relatieve veranderingen in het niveau van een eiwit op centrosomes in gefixeerde cellen van verschillende monsters, zoals in verschillende fasen van de celcyclus of na behandeling met diverse reagentia meet. Het principe van deze test ligt meten de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit die overeenkomt met een eiwit in een klein gebied en normaliseren die meting tegen dezelfde een ander eiwit dat niet varieert onder de gekozen experimentele condition. Gebruik makend van deze test in combinatie met BrdU pulse chase en strategie ongestoorde celcyclus bestuderen, hebben we kwantitatief gevalideerd onze recente waarneming dat het centrosomal pool van VDAC3 wordt geregeld op centrosomes tijdens de celcyclus, waarschijnlijk door proteasoom-gemedieerde degradatie specifiek op centrosomes.

Inleiding

Centrosomes bestaan ​​uit een paar centrioles omringd door pericentriolar materiaal (PCM). Omdat de belangrijkste microtubule organiserende centra (MTOCs) in zoogdiercellen, centrosomes dienen als de twee polen van mitotische spindel in delende cellen, en zo helpen genomische integriteit 1 behouden. In rustende cellen (bijvoorbeeld in G0-fase), één van de twee centrioles van het centrosoom, namelijk de moeder centriole, verandert in een basale lichaam de primaire cilium, een sensorische organel uitstekende uit het celoppervlak 2 monteren. Zodra de cellen opnieuw in te voeren van de celcyclus, zijn primaire cilia gedemonteerd en elk centriole regisseert de montage van een procentriole aan het proximale uiteinde die geleidelijk verlengt tot een volwassen centriole 3 vormen. Bij het begin van S-fase wordt een cartwheel structuur die de 9-voudige symmetrie de centriole verschaft gevormd op het oppervlak van elke bestaande centriole en de basis van elke procentriole worden. SAS6 thoed is onmisbaar voor centriole assemblage wordt aangeworven om de naaf van de radslag 4-6 te vormen. Andere centriolar eiwitten worden vervolgens gemonteerd op het waterrad in een sterk gereguleerde, proximaal van de distale manier 7. Na precies centriole duplicatie voltooien, cellen assembleren extra pericentriolar materialen om twee functionele centrosomes bouwen tegen het einde van de G2-fase 8. Naast de belangrijkste componenten centriolar 9-11, verscheidene andere eiwitten zoals kinasen, fosfatasen, chaperones, steiger componenten, membraan-geassocieerde eiwitten en degradatie machines zijn geassocieerd met centriolen, basaalkorrels en PCM op verschillende tijdstippen van de celcyclus 12-16. Het wordt vaak opgemerkt dat de centrosomal niveaus van veel eiwitten tijdelijk worden gereguleerd door centrosomal targeting mechanismen en / of proteasomale degradatie bij centrosomes. Belangrijk is dat de schommelingen in de centrosomal niveau van een aantal eiwitten zoals Plk4, Mps1, SAS6, en CP110 eent verschillende punten van de celcyclus lijkt cruciaal centriole samenstel 5,17-22 regelen zijn en in het geval van Mps1 voorkomen deze centrosomal degradatie leidt tot de vorming van overtollige centrioles 19. Aan de andere kant, de centrosomal fracties van verschillende eiwitten zijn minder labiel vergelijking met cytosolische pools. Bijvoorbeeld siRNA gemedieerde down-regulatie van Centrin 2 (Cetn2) leidde tot slechts een matige afname van het eiwit niveau aan het centriolen ondanks grote vermindering van de gehele cel niveau 23. Het is daarom van cruciaal belang om de veranderingen in het niveau van centrosomal eiwitten bij de centrosome meten in plaats van het meten van de gehele cel eiwit niveaus bij de beoordeling van hun centrosome-specifieke functies.

In deze studie hebben we een test met indirecte immunofluorescentie (IIF) het relatieve niveau van een eiwit op centrosomes kwantificeren ontwikkeld. Deze test is in het bijzonder ontwikkeld om cellen die uit verschillende monsters analyserenen dus niet worden afgebeeld op hetzelfde moment. Deze monsters kunnen cellen die werden behandeld met verschillende reagentia (bijv geneesmiddel versus controle), verzameld op verschillende tijdstippen (bijv puls versus chase), of in verschillende stadia van de celcyclus. Het principe van deze test ligt meten de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit die overeenkomt met een eiwit in een klein gebied en die waarde tegen dezelfde normaliseren ander eiwit waarvan de spiegels niet variëren onder de gekozen experimentele omstandigheden. Verschillende studies in centrosoom biologie onlangs gebruikt verschillende kwantitatieve microscopie, zowel levende of gefixeerde cellen, het centrosoom specifieke functie van kandidaateiwitten 24-27 bepalen. Vergelijkbaar met de testen de onderhavige techniek meet ook de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit van het onderzochte eiwit. Echter, zou de opname van de normalisatie behulp van een interne standaard in deze assay waarschijnlijk bieden meernauwkeurig en betrouwbaar analyseren twee verschillende monsters die op twee verschillende dekglaasjes. Bovendien, naast het onderzoek van de proteïne niveau centrosomes, met kleine aanpassingen deze methode kan worden toegepast op een uiteenlopende reeks experimentele omstandigheden of andere cellulaire plaatsen.

Hier combineren we onze kwantitatieve microscopie test met een BrdU pulse-chase strategie om te vergelijken cellen uit verschillende fasen van de celcyclus. In plaats van standaard celcyclus en afgifte technieken om diverse celcyclus tijdstippen bestuderen asynchroon groeiende cellen worden geïncubeerd met BrdU cellen labelen in S-fase en de gemerkte cellen worden achtervolgd diverse tijdstippen (gewoonlijk 4-6 uur). Het merendeel van de gemerkte cellen in S-fase direct na de puls. De lengte van de chase wordt gekozen zodat na de jacht, zal gelabelde cellen in late S, G2 of mitose, die kan worden geverifieerd door morfologische kenmerken zoals-positie centrosomes ten opzichte nuclei, afstand tussen centrosomes, condensatie van chromosomen etc. Dus, de lengte van de jacht afhankelijk van de gemiddelde duur van S, G2 en M-fase van een bepaald celtype. Omdat deze benadering vermijdt celcyclus inhibitoren zoals hydroxyureum, afidicoline, nocodazole, etc., is het mogelijk een meer fysiologisch relevante celcyclusanalyse.

Zo hebben we hier aangetoond dat de kwantitatieve fluorescentiemicroscopie assay alleen of in combinatie met BrdU pulse-chase analyse, is een eenvoudige maar krachtige techniek om de relatieve veranderingen in de centrosomal niveau van een kandidaat eiwit gedurende een onverstoord celcyclus nauwkeurig te meten. We maten de centrosomal niveau van VDAC3, een eiwit dat we recent geïdentificeerde bij centrosomes naast mitochondria 16,28 via deze assays. Resultaten hier verkregen controleren onze eerdere constatering dat de centrosomal pool van VDAC3 wordt geregeld door degradatie, en varieert ook in een celcyclus dependent manier 16, verder valideren van de toepasbaarheid van deze methode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celkweek

  1. Gebruik menselijk telomerase reverse transcriptase (hTERT) onsterfelijk retinale pigment epitheelcellen (hTERT-RPE1, hier aangeduid als RPE1).
    OPMERKING: RPE1 cellen zijn bijna-diploïde, niet-getransformeerde humane cellen die vaak worden gebruikt om centriole assemblage en ciliogenese bestuderen. Deze cellen volgen een normale centriole duplicatie cyclus gecoördineerd met een gereglementeerde celcyclus.
  2. Passage een bijna-confluente 100 mm celkweekschaaltje van RPE1 cellen bij 1: 5 verdunning van de oorspronkelijke kweek in een schoon 100 mm schotel met 10 ml DME / F-12 (1: 1) medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline G en 100 ug / ml streptomycine (het compleet medium wordt aangeduid als DME / F-12-medium). Kweek cellen bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2.
    1. Incubeer 12 mm ronde glazen dekglaasjes in 50 ml 1 N HCl in een afgedekte bekerglas O / N zonder schudden, bij 60 ° C in een waterbad of broedstoof.
    2. After teruggooien de zure oplossing, was de dekglaasjes drie keer in 100 ml gedestilleerd water door incubatie gedurende 15 minuten met af en toe schudden. Herhaal het wassen eveneens in 70% ethanol en 95% ethanol.
    3. Droog de dekglaasjes door hen individueel uitspreiden op een laboratorium vloeipapier in een bioveiligheid kast, gevolgd door sterilisatie met UV-straling voor 60 min.
  3. Plaats 2-4 droge dekglaasjes in een 35 mm celkweekschaaltje. Verdun de oplossing van fibronectine of fibronectine dergelijke gemodificeerde polymeer (voorraad concentratie van 1 mg / ml) tot een concentratie van 25 ug / ml in celkweek PBS.
    1. Plaats 80-100 pl van de verdunde oplossing op elk dekglaasje en incubeer gedurende 60 min het bekleden van de bovenzijde van het dekglaasje. Was de dekglaasjes driemaal met behulp van PBS voor het toevoegen van compleet medium.

2. groeiende cellen en behandelen cellen met proteasoomremmers

  1. Passage 2 x 10 5 asynchroon groeiening RPE1 cellen per 35 mm schotel met dekglaasjes en groeien de cellen in 2 ml compleet medium. Vervang het kweekmedium elke 24 uur met vers voorverwarmd compleet medium.
    1. Om het effect van proteasoomremming op de centrosomal niveau van het onderzochte eiwit geanalyseerd (hier VDAC3 of γ-tubuline), groeien de cellen in twee 35 mm schalen voor 44 uur. Vervang het kweekmedium met volledig medium respectievelijk voeg hetzij MG115 of DMSO als controle oplosmiddel bij een uiteindelijke concentratie van 5 uM of 0,05%. Tegelijkertijd, voeg BrdU aan de cellen in een eindconcentratie van 40 uM en incubeer cellen 4 uur.
    2. Breng elke dekglaasje in een 24-well plaat. Voeg 500 ul gekoeld methanol aan elk putje en incubeer de plaat bij -20 ° C gedurende 10 minuten om de cellen vast te stellen op dekglaasjes. Onmiddellijk de dekglaasjes driemaal met 500 ul wasbuffer (1 x PBS bevattende 0,5 mM MgCl2 en 0,05% Triton-X 100).
  2. Oogst de resterendecellen van de 35 mm schaal en centrifugeer de cellen bij 1000 g gedurende 5 min. Gebruik de celpellet het totale eiwit door Western blotting (stap 6) geanalyseerd.

3. BrdU Pulse en Chase Assay om eiwitgehaltes in verschillende fasen van de celcyclus Analyseer

  1. Om de variatie van het niveau van een eiwit (hier VDAC3, SAS6 of Cep135) te analyseren centrosomes in verschillende fasen van de celcyclus, groeien de cellen in twee 35 mm platen met dekglaasjes gedurende 44 uur. Vervang het kweekmedium met complete medium dat 40 uM BrdU en incubeer de cellen gedurende 4 uur in de celkweek incubator.
  2. Vanuit één schotel, breng de dekglaasjes tot een 24-well plaat om de cellen met gekoelde methanol vast zoals beschreven in stap 2.1.2.
  3. Na 4 uur BrdU puls verwijderen BrdU bevattend medium, was de cellen eenmaal met PBS en eenmaal met compleet medium, voeg vers medium, en vervolgens groeien de cellen in afwezigheid van BrdU voor diverse tijdstippen (gewoonlijk nog 4 uurvoor RPE1 cellen) vóór de vaststelling van de cellen zoals beschreven in stap 2.1.2.
    OPMERKING: RPE1 cellen het merendeel van de BrdU-positieve cellen in late S en G2-fase na 4 uur chase. Dit dient onafhankelijk voor elk celtype worden bepaald.

4. Immunokleuring

  1. Incubeer de gefixeerde cellen op dekglaasjes in 200 pl blokkerende buffer (2% BSA en 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) gedurende 30 min.
    1. Incubeer de cellen met een mengsel van primaire antilichamen (typisch één verhoogd bij konijnen en andere opgewekt in muizen) verdund in blokkerende buffer O / N bij 4 ° C in een bevochtigde kamer.
    2. Om een ​​vochtige kamer te maken, zet een natte papieren handdoek in de onderste helft van een lege 1.000 III pipettip doos. Leg een strook van Parafilm op het rek oppervlak en ter plaatse een druppel (15-20 pl) van het antilichaam oplossing op de Parafilm per dekglaasje wordt geïncubeerd. Inverteren een dekglaasje op een druppel van antilichaam-oplossing (zodat de cellen worden ondergedompeld) en dichthet deksel van de doos tip.
    3. Omkeren coverslips opnieuw en weer terug te geven aan de 24-putjes. Was dekglaasjes en incubeer ze in 150 pi secondair antilichaam mengsel (hier groen fluorescerende kleurstof geconjugeerd anti-konijn en rode fluorescerende kleurstof geconjugeerd anti-muis verdund in blokkeerbuffer) gedurende 1 uur bij KT. Was de dekglaasjes driemaal.
      OPMERKING: De fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. Bescherm de monsters van het licht tijdens het stappen 4.1.3-5.1.2.
  2. Bereid voor anti-BrdU kleuring door vaststelling van de gekleurde RPE1 cellen opnieuw met 500 ul gekoelde methanol bij -20 ° C gedurende 10 minuten, zoals beschreven in stap 2.1.2. Was de dekglaasjes driemaal.
    LET OP: Deze fixatie stelt de primaire en secundaire antilichaam etikettering van het eiwit (s) van de rente gedurende de zure hydrolyse proces in de volgende stap.
    1. Incubeer de cellen in 200 ul 2 N HCl gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Neutraliseer met 300 ul van 1 M Tris-Cl, pH 8 eend was de cellen drie keer met behulp van wasbuffer.
    2. Blokkeer de cellen opnieuw met 200 ui blokkeerbuffer gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
    3. Incubeer de cellen met rat anti-BrdU-antilichaam (verdund in blokkerende buffer) gedurende 45 min bij 37 ° C in een bevochtigde kamer. Zet de dekglaasjes naar de 24-putjes, wassen en vervolgens incuberen met blauwe fluorescerende kleurstof geconjugeerd anti-rat secundair antilichaam (verdund in 150 pl blokkerende buffer in 24-putjes gedurende 1 uur bij KT.
  3. Was de dekglaasjes driemaal. Spot een druppel (ongeveer 3-6 ul) van een montage oplossing die antifade reagens op een microscoopglaasje. Inverteren een dekglaasje, met de cel-kant naar beneden, op de montage-oplossing. Veeg overtollige vloeistof door zachtjes te drukken op de dekglaasje tegen de dia met behulp van zachte reiniging weefsel. Gelden transparante nagellak langs de rand van het dekglaasje te verzegelen op de microscoop dia.

5. Immuunfluorescentie Afbeelding Acquisition en Analyse

  1. Gebruik een 100X Plan Apo olie-immersie objectief (met 1,4 numerieke apertuur) tot de beelden van BrdU-positieve cellen RPE1 verwerven bij omgevingstemperatuur.
    1. Zet een dia op de microscoop (zie uitrusting) bevestigd met een camera die in staat van digitale beeldbewerking. Voor elke fluorofoor, de geschikte blootstellingstijd (meestal tussen 300-1000 msec) handmatig onderzoek van alle monsters van een experiment. Alvorens beelden van een cel handmatig de geschikte bovenste en onderste focal plane langs de Z-as (typisch 0,2 urn stapgrootte). Afbeeldingen ophalen van verschillende monsters die op verschillende dekglaasjes met dezelfde belichtingstijd voor verschillende fluoroforen langs de Z-as met behulp van een digitale microscopie softwarepakket.
  2. Voer deconvolutie (waarin gebruik Geen buren algoritme) van afbeeldingsstapels verkregen langs de Z-as.
    1. Het verkrijgen van de totale intensiteit projectie van elk beeld stapel samende Z-as.
  3. In cellen waar centrosomes zijn dicht (afstand tussen twee centrosomes is kleiner dan 2 micrometer), trek een klein vierkant (meestal 20-30 pixels per zijde) rond beide centrosomes en markeer het geselecteerde gebied.
    1. Teken een grotere vierkante (meestal 24-35 pixels per zijde) rondom het eerste vierkant en markeer het geselecteerde gebied van het grote plein.
    2. Verkrijg de omgeving (A) en de totale fluorescentie-intensiteit (F) van elk fluorofoor in elk vak (S zit je kleine doos en L geeft grote doos).
    3. Analyseer de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit van elke fluorofor met behulp van de formule beschreven door Howell et al 29:. F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)].
    4. Haal de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van het eiwit van belang (hier VDAC3 of SAS6) door berekening van de verhouding van de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit van de fluorophore die van de fluorofoor gebruikt voor een interne standaard (hier γ-tubuline, SAS6 of Cep135).
  4. Bij het analyseren cellen waarin centrosomes goed gescheiden (afstand tussen twee centrosomes groter dan 2 micrometer), analyseert elk centrosome afzonderlijk door tekening twee reeksen dozen. Teken een klein vierkant (meestal 15-25 pixels per zijde) rond elke centrosome en markeer het geselecteerde gebied. Teken een grotere vierkante (20-30 pixels per zijde) rondom het eerste vierkant en markeer het geselecteerde gebied.
    1. Verkrijg de omgeving (A) en de totale fluorescentie-intensiteit (F) van elk fluorofoor in elk vak, en bereken de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteiten van elk fluorofoor, afzonderlijk voor elk centrosome, zoals beschreven in stap 5.3.3.
    2. Combineer de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteiten van elk eiwit van de twee centrosomes het totale centrosomal niveau van dat eiwit in die cel te verkrijgen.
    3. Het verkrijgen van degenormaliseerde intensiteit voor het eiwit van interesse door berekening van de verhouding van de totale centrosomal intensiteit centrosomal de totale intensiteit van de interne standaard.
  5. Analyseer tenminste 15-25 cellen voor elke experimentele conditie en plot de grafiek in een spreadsheet.

6. Het analyseren van de totale hoeveelheid eiwit met behulp van Western blotting

  1. Resuspendeer de cellen in radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer die 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) en incubeer gedurende 10 minuten op ijs het lyseren.
    1. Centrifugeer het mengsel bij 10.000 xg gedurende 10 minuten, scheid de lysaat van de pelletfractie en meet de totale eiwitconcentratie van elk lysaat met een bicinchoninezuur (BCA) assay kit.
  2. Meng 40 ug lysaat met 4x SDS-PAGE laadbuffer (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 100 mM dithiothreitol, 0,1% Bromophenol blauw).
    1. Kook de monsters gedurende 10 minuten en laat de monsters op een 12,5% denaturerende SDS-PAGE op een constante spanning van 200 V.
  3. Breng de eiwitten gescheiden op SDS-PAGE op een nitrocellulosemembraan met behulp van western blotting-techniek (bij een constante spanning van 90 V gedurende 1 uur koud).
    1. Blokkeer het membraan met 3% magere melk in 1x PBS, en vervolgens incuberen van de membraan met oplossingen van verdunde primaire antilichamen (in dit geval konijn anti-VDAC3, konijn anti-γ-tubuline en muis anti-α-tubuline) 1 uur bij KT.
    2. Na wassen van de membraan drie maal (elk 5 min incubatie onder schudden) met PBS-T-buffer (1x PBS en 0,2% Tween-20), incubeer de membraan in een mengsel van nabij-infrarood (IR) fluorescente kleurstof geconjugeerd anti-konijn en IR fluorescente kleurstof geconjugeerd anti-muis secundaire antilichamen (verdund in PBS-T) gedurende 1 uur.
    3. Was het membraan driemaal en vervolgens de membraan naar de banden geanalyseerd via infrarood fluorescence beeldvormingssysteem geschikt voor immunoblot detectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Onze recente studies die nieuwe centrosomal lokalisatie en functie van VDAC3, een van de mitochondriale porinen 16,28. Immunokleuring van verscheidene zoogdiercellen waaronder RPE1 cellen met een VDAC3 specifiek antilichaam vertoonde prominente centrosomal kleuring en relatief zwakke mitochondriale kleuring. We toonden ook aan dat centrosomal VDAC3 voorkeur geassocieerd met de moeder centriole en het centrosomal pool van zowel de endogene als ectopisch expressie VDAC3 wordt gereguleerd door afbraak 16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kwantitatieve microscopie in de celbiologie is vaak geassocieerd met live-cell imaging assays zoals Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), fluorescentieherstel na Photobleaching (FRAP), etc. Echter, er steeds voorbeelden cel biologen ontwikkelen van verschillende kwantitatieve microscopie assays voor vaste cellen in de afgelopen jaren 27,34-36. Belangrijker nog, de vooruitgang in het begrijpen van centrosome biologie vaak vereist inzicht in de centrosome-specifieke functie van eiwitten waarva...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een National Institutes of Health-subsidie (GM77311) en een startsubsidie van The Ohio Cancer Research Associates (aan H.A.F.). SM werd gedeeltelijk ondersteund door een Up on the Roof-beurs van het Human Cancer Genetics Program van het Comprehensive Cancer Center van The Ohio State University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
FibronectinSigmaF8141Voorraad van 1 mg/ml in water
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP0005Voorraad van 10 mM in DMSO
BrdUSigmaB5002Voorraad van 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (muis monoklonaal, klonale GTU 88)SigmaT 65571:200 in IIF blokkeerbuffer 
Anti-VDAC3 (konijn polyklonaal) Aviva Systems BiologyARP35180-P0501:50 in IIF blokkeerbuffer, 1:1.000 in WB blokkeerbuffer
Anti-Sas6 (muis monoklonaal) Santa cruz biotechnologysc-814311:100 in IIF blokkeerbuffer
Anti-Cep135 (konijn polyklonaal)Abcamab-750051:500 in IIF blokkeerbuffer
Anti-BrdU (rat monoklonaal) Abcamab63261:250 in IIF blokkeerbuffer
Alexa Fluor 350 Geit Anti-Rat IgG (H+L)Life technologiesA210931:200 in IIF blokkeerbuffer
Alexa Fluor 488 Ezel Anti-Muis IgG (H+L) AntilichaamLife technologiesA212021:1.000 in IIF blokkeerbuffer
Alexa Fluor 594 Ezel Anti-Muis IgG (H+L) AntilichaamLife technologiesA212031:1.000 in IIF blokkeerbuffer
Alexa Fluor 488 Ezel Anti-Konijn IgG (H+L) AntilichaamLife technologiesA212061:1.000 in IIF blokkeerbuffer
Alexa Fluor 594 Ezel Anti-Konijn IgG (H+L) AntilichaamLife technologiesA212071:1.000 in IIF blokkeerbuffer
Anti-γ-tubulin (konijn polyklonaal)SigmaT51921:1.000 in WB blokkeerbuffer
Anti-α-tubulin (muis monoklonaal, DM1A)SigmaT90261:20.000 in WB blokkeerbuffer
Alexa Fluor 680 Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)Life technologiesA100431:10.000 in WB blokkeerbuffer
Muis IgG (H&L) Antilichaam IRDye800CW GeconjugeerdRockland antibodies610-731-0021:10.000 in WB blokkeerbuffer
SlowFade Gold Antifade Reagens Life technologiesS36936Montage medium
Ronde dekvlakjes 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Olympus IX-81 microscoopOlympus
Retiga ExiFAST 1394 IR cameraQImaging 32-0082B-238
100X Plan Apo olie-immersie objectiefOlympus1,4 numerieke apertuur
Slidebook softwarepakketIntelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging SysteemLi-cor Biosciences
Bicinchoninic zuur (BCA) testThermo Scientific23227
U-MNU2 Narrow UV cubeOlympusU-M622Filter
U-MNU2 Narrow Blue cubeOlympusU-M643Filter
U-MNU2 Narrow Green cubeOlympusU-M663Filter

Referenties

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9(2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976(2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287(2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291(2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Centrosome eiwitniveausfluorescentiemicroscopie assayproteasoemremmingBrdU pulse chasegamma tubulineRPE1 cellenachtergrondgecorrigeerde intensiteiteiwitnormalisatiecelcyclusanalyse

Gerelateerde artikelen