Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dystrofische cardiomyopathie is een slecht begrepen gevolg van spierdystrofie. Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van patiënten met spierdystrofie is een waardevolle cellulaire bron in vitro ziekte modelsystemen en kan worden gebruikt voor drug discovery studies. -Patiënt afgeleid urine cellen zijn gebruikt in succesvolle herprogrammering in geïnduceerde pluripotente stamcellen om te modelleren dystrophic cardiomyopathie 1. Het aanpakken van de bezorgdheid over de veiligheid van de integratie van vector systemen, presenteren we een protocol met behulp van een niet-integrerende Sendaivirusvector voor transductie van Yamanaka factoren in de urine cellen verzameld van patiënten met spierdystrofie. Dit protocol genereert volledig geherprogrammeerd klonen binnen 2-3 weken. De pluripotente cellen zijn vectorvrij door passage-13. Deze dystrofische iPSCs kunnen worden onderscheiden in hartspiercellen en gebruikt worden om de ziekte mechanismen of voor drug discovery bestuderen.
Inleiding
Cardiomyopathie is de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij patiënten met Duchenne en Becker spierdystrofie (MD). Hoewel mutaties in het X-gebonden dystrofine-gen optreden bij 1: 3.500 mannelijke geboortes, zeer weinig bekend over de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die leiden tot progressieve hartspier schade. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van spierdystrofie patiënten hebben ontpopt als een nieuwe gereedschap om de onderliggende ziekte mechanismen bestuderen en te gebruiken voor drug discovery 1,2.
De verwachte ongemak van huidbiopsies of bloedmonsters kunnen jonge patiënten en / of hun verzorger....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Patiënten en / of hun verzorgers moeten geïnformeerde toestemming om deel te nemen in een Institutional Review Board geven goedgekeurd studie.
1. Buffers en Media Voorbereidingen
- Wasbuffer: bereiding van 100 ml wasbuffer, voeg 1 ml 100x pen / strep (100 U / ml penicilline + 100 pg / ml streptomycine) tot 99 ml fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
- Urine progenitorcel (UPC) Medium: Voor UPC medium te bereiden, meng gelijke volumes Keratinocyte Serum Gratis (KSF) Medium + progenitorcel Medium.
- KSF Medium: keratinocyten medium wordt 5 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 50 ng / ml runderhypofyse-extrac....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De meeste stamcellen geïsoleerd uit menselijke urine zijn positief voor uroepithelial voorlopercellen en pericyte merkers zoals CD44, CD73 en CD146 (97,37%, 97,09% en 97,3% respectievelijk Figuur 1A en 1B). Deze cellen brachten ook andere mesenchymale markers zoals alfa-gladde spier actine en vimentine (Figuur 1B). RT-PCR analyse getuigt van een gemengde populatie van cellen in de culturen die er zwakke expressie van Cytokeratin-7 (CK-7) en Uroplakin (UP) -Ia & -III.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Modelleren van hart- en vaatziekten met behulp van iPSCs wordt steeds meer een gemeenschappelijke aanpak van de genetische bijdrage 4-6 begrijpen. Sommige onverwachte moeilijkheden om celmonsters van patiënten, met name jonge kinderen, kunnen worden vermeden door het aanbieden van de mogelijkheid van een niet-invasieve benadering zoals urine inzameling. In deze jonge patiëntenpopulatie, is het vaak moeilijk een voldoende hoeveelheid urine verzamelen voldoende urine cellen opleveren herprogrammering. Coachen v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De ontwikkeling van dit protocol werd ondersteund door Advancing a Healthier Wisconsin en het National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, via Grant Nummer 8UL1TR000055. De inhoud ervan valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële opvattingen van de NIH.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | Voor Urinemonsterverzameling |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep zonder Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| B-27 Supplement met Insuline (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| B-27 Supplement zonder Insuline (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Versene, 1:5.000 | Life Technologies | 15040066 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml fles) | Life Technologies | 10828-028 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| DMEM, Hoge Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Cholera Toxin van Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Hydrocortison | Sigma Aldrich | H0888-1G | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Holo-transferrine van mensen | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antilichamen | |||
| Muis anti CD44 - gelabeld met FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Muis anti CD146 - gelabeld met PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Muis anti CD73 - gelabeld met PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Muis anti-α-smoothe spieractine | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Muis anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Muis Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Konijn anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Muis Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Referenties
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
