Dit protocol omvat gedetailleerde procedures voor de isolatie van urine-afgeleide cellen van patiënten met spierdystrofie; hun efficiënte en snelle herprogrammering door Sendai-virus transductie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van spierdystrofie patiënten: Efficiënte-Integratie gratis herprogrammeren van Urine-afgeleide cellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dystrofische cardiomyopathie is een slecht begrepen gevolg van spierdystrofie. Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van patiënten met spierdystrofie is een waardevolle cellulaire bron in vitro ziekte modelsystemen en kan worden gebruikt voor drug discovery studies. -Patiënt afgeleid urine cellen zijn gebruikt in succesvolle herprogrammering in geïnduceerde pluripotente stamcellen om te modelleren dystrophic cardiomyopathie 1. Het aanpakken van de bezorgdheid over de veiligheid van de integratie van vector systemen, presenteren we een protocol met behulp van een niet-integrerende Sendaivirusvector voor transductie van Yamanaka factoren in de urine cellen verzameld van patiënten met spierdystrofie. Dit protocol genereert volledig geherprogrammeerd klonen binnen 2-3 weken. De pluripotente cellen zijn vectorvrij door passage-13. Deze dystrofische iPSCs kunnen worden onderscheiden in hartspiercellen en gebruikt worden om de ziekte mechanismen of voor drug discovery bestuderen.
Inleiding
Cardiomyopathie is de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij patiënten met Duchenne en Becker spierdystrofie (MD). Hoewel mutaties in het X-gebonden dystrofine-gen optreden bij 1: 3.500 mannelijke geboortes, zeer weinig bekend over de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die leiden tot progressieve hartspier schade. Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van spierdystrofie patiënten hebben ontpopt als een nieuwe gereedschap om de onderliggende ziekte mechanismen bestuderen en te gebruiken voor drug discovery 1,2.
De verwachte ongemak van huidbiopsies of bloedmonsters kunnen jonge patiënten en / of hun verzorgers ontmoedigen om toestemming voor deelname aan het onderzoek te geven. Urinemonsters zijn een non-invasieve bron van somatische cellen die amendeerbaar tot herprogrammering methoden zijn. We hebben onlangs aangetoond dat urine cellen verzameld van spierdystrofie patiënten gekweekt kan zijn en efficiënt geprogrammeerd in iPSCs behulp van retrovirale transductie met de Yamanaka factoren (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, en c-Myc; OSKM) 1. Het nadeel van retrovirale genoverdracht is de willekeurige integratie van de herprogrammering genen in de gastheer chromosomen. Om deze beperking te overwinnen, hebben wij de niet-integrerende Sendai virus urine cel herprogrammering gebruikt.
Dit protocol geeft de Sendai virus herprogrammering van urine geïsoleerde cellen van spierdystrofie patiënten die vervolgens kunnen worden onderscheiden in cardiomyocyten of andere celtypes voor verdere studie. Dit protocol kan ook worden aangepast voor andere patiënten specifieke ziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Patiënten en / of hun verzorgers moeten geïnformeerde toestemming om deel te nemen in een Institutional Review Board geven goedgekeurd studie.
1. Buffers en Media Voorbereidingen
- Wasbuffer: bereiding van 100 ml wasbuffer, voeg 1 ml 100x pen / strep (100 U / ml penicilline + 100 pg / ml streptomycine) tot 99 ml fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
- Urine progenitorcel (UPC) Medium: Voor UPC medium te bereiden, meng gelijke volumes Keratinocyte Serum Gratis (KSF) Medium + progenitorcel Medium.
- KSF Medium: keratinocyten medium wordt 5 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 50 ng / ml runderhypofyse-extract (BPE), 30 ng / ml choleratoxine en pen / strep (100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine) tot 500 ml KSF medium.
- Progenitor Cell Medium Voeg driekwart van DMEM met een kwart van Ham-F12 medium en aangevuld met 10% FBS, 0,4 ug / ml hydrocortison, 0,1nM cholera toxine, 5 ng / ml insuline, 1,8 x 10 -4 M adenine, 5 ug / ml transferrine, 2 x 10 -9 M trijood thyronine, 10 ng / ml EGF en pen / strep oplossing.
- HES Medium: Voeg 20% KO-serum vervangen (K-SR), 1x MEM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine, 100 uM β-mercaptoethanol, 20 ng / ml bFGF en pen / strep 400 ml DMEM / F12-medium.
2. urinemonster Collection
- Instrueer de patiënt om vloeistoffen 30 min voorafgaand aan urine verzameling drinken om ervoor te zorgen dat er een voldoende hoeveelheid (~ 30-40 ml) van de urine kan worden opgevangen.
- Geven de patiënten en / of hun verzorgers een urine-inzameling kit bevat de volgende onderdelen: (1) schriftelijke instructies over hoe steriel of schoon te vangen urine monster te verkrijgen, (2) vochtige anti-bacteriële toilettes, en (3) een 100 ml steriele specimeninzameling beker. Patiënten moeten monster te verzamelen.
- Onmiddellijk plaats de urinemonsters op ijs en over te dragen aan de laboratory in een koeler. Verwerk de urine voor celisolatie onmiddellijk. Indien dit niet mogelijk is, slaan het monster op ijs gedurende maximaal 4 uur met minimaal verlies van cellevensvatbaarheid.
3. Isolatie en uitbreiding van Urine Cellen
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden in een BSL2 bioveiligheidskast.
- Met steriele pipetten, overdracht urinemonsters steriele 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant verlaten van 1 ml in de buis; wees voorzichtig de cel pellet niet te verstoren.
- Resuspendeer en combineren de pellets van meerdere buizen in 7 ml wasbuffer en opnieuw centrifugatie bij 400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Zuig voorzichtig het supernatant, het verlaten van de cel pellet en ~ 0,2-0,5 ml van de bovenstaande. Resuspendeer in 2-3 ml urine progenitorcel (UPC) medium en breng het mengsel op in 4-6 putten uit een ungecoate 24-well plaat.
- Na 72 uur, vullen de cultuur met 0,5 ml vers UPC medium per putje en veranderen medium elke 2-3 dagen na. De erytrocyten en squameuze cellen die niet hechten aan de plaat worden verwijderd met het medium verandert.
- Monitor cultuur na 4-6 dagen.
OPMERKING: Small 2-4 celkolonies zal beginnen te verschijnen. Cellen worden afgerond of langwerpig welk type I of type II van renale epitheelcellen (RE) cellen respectievelijk 3 representeren. - Verander het medium elke 2-3 dagen sinds wanneer de cellen blijken, zullen ze een snelle groeifase ondergaan.
- Wanneer de cellen 80-90% confluentie bereiken, ongeveer 9-15 dagen na plateren, dissociëren en passage van de cellen (15,000-18,000 cellen / cm2) op 2-4 putjes van 24 putjes voor verdere expansie. Markeer dit als celpassage 1 (P1).
- Karakteriseren urine cellen voor lineage specificaties door flowcytometrische analyse, immunohistochemical kleuring of door reverse transcriptase-polymerase kettingreactie (RT-PCR).
- Herprogrammeren geïsoleerde urine cellen (hoofdstuk 4) of bevriezen ze naar beneden in Invriezen Medium (DMEM aangevuld met 10% serum en 10% DMSO) voor de lange termijn cryo.
4. Urine Cell herprogrammeren Met behulp van Sendai virus
OPMERKING: De juiste behandeling en het gebruik van PBM (persoonlijke beschermingsmiddelen) wordt aanbevolen, terwijl het manipuleren van de transfecteren agenten. Voer de volgende stappen onder steriele omstandigheden in een BSL2 bioveiligheidskast. De correcte verwijdering van transfectie middel en / of getransfecteerde cellen wordt aanbevolen om het risico van milieu- en gezondheidsrisico's te voorkomen. Voor urine cel herprogrammering, gebruik dan een Sendai herprogrammeren Kit met aanpassingen aan feeder-afhankelijke protocol van de fabrikant, zoals hieronder beschreven.
- Om een hoog rendement herprogrammering met behulp van de Sendai virus, moet gebruik worden passages 1-5 van urine cellen die snel zijnly verdelen. Als de cellen niet goed repliceren of worden senescent, gooi ze weg omdat ze niet efficiënt zullen herprogrammeren.
- Zaad 60.000 cellen per putje in twee putjes van een 6 well plaat. Markeer dit als Dag van -2. Pas cel zaaien dichtheid (5 x 04-9 oktober x 10 4 cellen per putje) als nodig is om 80-90% samenvloeiing bereiken per dag 0.
- Op dag 0 (48 uur na het uitplaten van de cellen), bereid de Sendai herprogrammering vectoren (SeV) met elk van de vier OSKM factoren. Voeg elk van de vectoren om 1 ml voorverwarmde UPC medium. Met een MOI van 1-1,5 (5-7.5 x 10 5 CIU), wat voldoende is voor herprogrammering urine cellen. Zuig het medium en voeg langzaam de 1 ml UPC + SeV om een goed van de urine cellen. Gebruik de tweede en de transductie negatieve controle.
- Op dag 1, vervang de UPC + SeV medium met verse UPC medium. Sommige celdood gemeten na 24 uur door een virale cytotoxiciteit.
- Afhankelijk van de efficiëntie van reprogrammed clone formaties en de compacte morfologie, blijven veranderen het medium dagelijks tot dag 6 of 7.
- Één dag voor dissociatie van getransduceerde cellen (dag 5 of 6), bereidt MEF feeder platen door uitplaten mitomycine-C (10 ug / ml gedurende 3 uur) behandeld-MEFs op dichtheid van 5 x 10 4 cellen / cm2, op 0,1 % gelatine gecoate 100 mm 2 cultuur gerechten.
- De volgende dag (dag 6 of 7), dissociëren de cellen met 0,25% trypsine, resuspendeer de cellen in UPC medium en plaat 5 x 04-02 oktober x 10 5 cellen / 100 mm 2 MEF feeder plaat.
- De volgende dag, over te schakelen naar HES medium en elke dag verandert het medium. Let op de cellen onder een microscoop om getransformeerde cellen te controleren.
OPMERKING: De cellen vormen van klonen aggregaten met karakteristieke geplaveide morfologie en met hogere kern naar het cytoplasma-ratio (12-18 dagen na transductie). - Binnen twee tot drie weken na transductie, kies kolonies transfer naar nieuwe platen voor clonal expansie.
- Voer levende cel kleuring voor het selecteren iPSC klonen door incubatie cellen met TRA-1-81 antilichaam gedurende 1 uur bij 37 ° C in CO2 incubator gevolgd door teller kleuring met specifieke fluorescente kleurstof geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur bij 37 ° C in CO2 incubator.
- Gebruik een 26 G 1½ inch naald om cross-hatch de grotere TRA-1-81 positieve iPSC klonen in kleine gelijke stukjes (4-6 stuks per kloon).
- Gebruik een steriele pipet-tip op te halen en de overdracht 10-20 gearceerde stukken uit meerdere klonen in elk putje van Matrigel (10 ug / cm2) -gecoate 24 goed plaat met hES medium.
OPMERKING: Stukken uit een enkele kloon individueel uitgeplaat in een enkele put niet uit of pluripotency behouden. - Verandering van HES tot iPSC medium 24-48 uur na de herprogrammering klonen zijn bevestigd aan de Matrigel oppervlak.
- Tijdens het onderhoud aan Matrigel-gecoate platen, handmatig scrape-off elke gedifferentieerde cellen of besmettende MEF feeder cellen met behulp van een pipet-tip om te verrijken voor een volledig opnieuw geprogrammeerd en pluripotente dystrofische iPSC (MD-iPSC) klonen.
- Na individuele klonen ~ 100 micrometer grootte hebben bereikt, uit te breiden het klonen door dissociëren met 0,48 mM EDTA (ethyleendiaminetetraazijnzuur) oplossing voor 3 min en plating kleincellige aggregaten van de MD-iPSCs gesuspendeerd in iPSC medium (aangevuld met 5 uM Y27632, Rho kinase remmer ) op verse Matrigel (10 ug / cm2) beklede 12 well plaat. Veranderen dagelijks iPSC medium.
- Volledige herprogrammering van elke kloon kan worden bepaald door zowel genexpressieanalyse van OSKM genen en immunohistochemische kleuring van pluripotentie markers (Oct3 / 4 en TRA-1-81). Een grondige evaluatie van pluripotency potentieel moeten worden gebruikt om te bevestigen volledig reprogrammed iPSC lijnen kunnen differentiëren tot drie kiembladen. Dit kan worden bereikt door embryoid body (EB) de vorming en differentiatie assay of terAtoma vorming test.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De meeste stamcellen geïsoleerd uit menselijke urine zijn positief voor uroepithelial voorlopercellen en pericyte merkers zoals CD44, CD73 en CD146 (97,37%, 97,09% en 97,3% respectievelijk Figuur 1A en 1B). Deze cellen brachten ook andere mesenchymale markers zoals alfa-gladde spier actine en vimentine (Figuur 1B). RT-PCR analyse getuigt van een gemengde populatie van cellen in de culturen die er zwakke expressie van Cytokeratin-7 (CK-7) en Uroplakin (UP) -Ia & -III...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Modelleren van hart- en vaatziekten met behulp van iPSCs wordt steeds meer een gemeenschappelijke aanpak van de genetische bijdrage 4-6 begrijpen. Sommige onverwachte moeilijkheden om celmonsters van patiënten, met name jonge kinderen, kunnen worden vermeden door het aanbieden van de mogelijkheid van een niet-invasieve benadering zoals urine inzameling. In deze jonge patiëntenpopulatie, is het vaak moeilijk een voldoende hoeveelheid urine verzamelen voldoende urine cellen opleveren herprogrammering. Coachen v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De ontwikkeling van dit protocol werd ondersteund door Advancing a Healthier Wisconsin en het National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, via Grant Nummer 8UL1TR000055. De inhoud ervan valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële opvattingen van de NIH.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 Oz. Specimen Cup with Lid | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | Voor Urinemonsterverzameling |
| 15 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 ml BD-Falcon Tubes | Fisher Scientific | 352098 | |
| Round Glass Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep zonder Glutamine | Life Technologies | 15140-122 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| B-27 Supplement met Insuline (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| B-27 Supplement zonder Insuline (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Versene, 1:5.000 | Life Technologies | 15040066 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| bFGF (10 µg) | Life Technologies | 13256-029 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 ml fles) | Life Technologies | 10828-028 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| DMEM, Hoge Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Insulin, Human Recombinant, Zinc Soln | Life Technologies | 12585-014 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-Qualified | Sigma Aldrich | F6178 | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Adenine Bioreagent | Sigma Aldrich | A2786-5G | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Cholera Toxin van Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Hydrocortison | Sigma Aldrich | H0888-1G | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| Holo-transferrine van mensen | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Fluoromount Aquous mounting medium | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa-Aesar | 43368 | |
| Antilichamen | |||
| Muis anti CD44 - gelabeld met FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Muis anti CD146 - gelabeld met PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Muis anti CD73 - gelabeld met PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Muis anti-α-smoothe spieractine | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Muis anti-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Muis Anti - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Konijn anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Muis Anti Dystrophin | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Referenties
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
