Methodenartikel

Sublinguale immunotherapie als een alternatief voor bescherming tegen acute luchtwegeninfecties Induce

18.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52036

⸱

30 augustus 2014

 ,  ,  , 
1Departamento de Desarrollo Biotecnológico, Universidad de la República, 2Present Affiliation: Trinity Biomedical Science Institute, Trinity College Dublin

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige werk illustreert het gemak van het gebruik van sublinguale immunotherapie om de aangeboren immuunrespons in de longen te versterken en bescherming te bieden tegen acute pneumokokkenpneumonie bij muizen.

Samenvatting

De sublinguale route is veel gebruikt om kleine moleculen in de bloedbaan af te geven en de immuunrespons op verschillende plaatsen te moduleren. Het is aangetoond dat het effectief humorale en cellulaire reacties induceert op systemische en mucosale locaties, namelijk de longen en het urogenitale kanaal. Sublinguale vaccinatie kan bescherming bevorderen tegen infecties in de lagere en bovenste luchtwegen; het kan ook tolerantie voor allergenen bevorderen en astmasymptomen verminderen. Modulatie van de immuunrespons van de longen door sublinguale immunotherapie (SLIT) is veiliger dan directe toediening van formuleringen via de intranasale route omdat het geen afgifte van potentieel schadelijke moleculen rechtstreeks in de luchtwegen vereist. In tegenstelling tot intranasale toediening, worden bijwerkingen die betrekking hebben op hersentoxiciteit of gelaatsverlamming niet bevorderd door SLIT. De immuunmechanismen die ten grondslag liggen aan SLIT blijven onduidelijk en het gebruik ervan voor de behandeling van acute longinfecties is nog niet onderzocht. Daarom is de ontwikkeling van geschikte diermodellen voor SLIT nodig om de mogelijke voordelen verder te onderzoeken.

Dit werk laat zien hoe sublinguale toediening van therapeutische middelen bij muizen kan worden uitgevoerd om hun vermogen om te beschermen tegen acute pneumokokkenpneumonie te evalueren. Technische aspecten van het omgaan met muizen tijdens sublinguale inoculatie, nauwkeurige identificatie van sublinguale mucosa, lymfeklieren die afvoeren en isolatie van weefsels, bronchoalveolaire lavage en longen worden geïllustreerd. Protocollen voor de bereiding van eencellige suspensie voor FACS-analyse worden in detail beschreven. Andere downstream toepassingen voor de analyse van de immuunrespons worden besproken. Technische aspecten van de bereiding van Streptococcus pneumoniae inoculum en intranasale uitdaging van muizen worden ook uitgelegd.

SLIT is een eenvoudige techniek die het screenen van kandidaatmoleculen mogelijk maakt om de immuunrespons van de longen te moduleren. Parameters die van invloed zijn op het succes van SLIT zijn gerelateerd aan moleculaire grootte, gevoeligheid voor afbraak en stabiliteit van hoog geconcentreerde formuleringen.

Inleiding

Het algemene doel van dit werk is om de voordelen van sublinguale immunotherapie voor de behandeling van acute respiratoire infecties (ARI) te illustreren en de voordelen van deze toedieningsroute te presenteren in vergelijking met andere toedieningsroutes, namelijk intranasaal.

ARI veroorzaken miljoenen sterfgevallen per jaar, vooral bij kinderen onder de vijf. Streptococcus pneumoniae blijft een van de belangrijkste etiologische agentia van bacteriële longontsteking bij zuigelingen en ouderen1,2. Tot op heden berust de belangrijkste beschikbare behandeling op het gebruik van antibiotica, maar er komen voortdurend resistente stammen op3,4.

SLIT induceert brede reacties op systeem- en ook op slijmvliesniveau, met name in de luchtwegen5. Het heeft bewezen effectiviteit tegen influenza-infectie en bevordert langdurige bescherming met productie van humorale en cellulaire reacties6,7. Daarnaast is aangetoond dat profylactisch behandelen met bacteriële lysaten die via de sublinguale route worden toegediend, verergering van chronische obstructieve bronchitis bij ouderen vermindert8 en terugkerende luchtweginfecties bij kinderen voorkomt9. SLIT wordt veel gebruikt voor de behandeling van allergieën en astma. Klinische studies hebben niet alleen de effectiviteit aangetoond om het immuunrespons in de luchtwegen te moduleren, maar ook de veiligheid10. Ondanks de groeiende interesse van farmaceutische bedrijven en onderzoekers in SLIT, blijven de mechanismen die betrokken zijn bij het induceren van mucosale immuunresponsen na sublinguale toediening van verbindingen onduidelijk. Recentelijk is de aandacht gericht op de mechanismen die tolerantie bevorderen die geassocieerd is met allergeendesensibilisatie. Er is voorgesteld dat residente en gerecruetete cellen in het sublinguale slijmvlies, zoals dendritische cellen en macrofagen, tolerantie kunnen bevorderen na SLIT11-13. Dendritische cellen van het orale slijmvlies kunnen IFN-gamma en IL-10 producerende T-helpercellen11 bevorderen, evenals recirculeren naar het distale genitale slijmvlies en CD8+ T-cellen14 bevorderen. Er is echter weinig bekend over de impact van SLIT op aangeboren cellen of over de capaciteit om de ziekteverwekkers op te ruimen tijdens acute respiratoire infecties.

De natuurlijke controle van pneumokokkeninfectie in de longen hangt grotendeels af van de efficiënte en snelle activering van lokale aangeboren afweer. We toonden eerder aan dat verbetering van de aangeboren immuniteit van de longen door een enkele intranasale dosis flagelline (FliC), een TLR5 en NLRC4-agonist, 75-100% van de muizen beschermt die worden uitgedaagd met een dodelijke dosis van een klinisch isolaat van Streptococcus pneumoniae serotype 1. Deze bescherming bleek afhankelijk te zijn van lokale recrutering van GR1+ cellen (waarschijnlijk polymorf-nucleaire neutrofielen, PMN's) en niet afhankelijk van antilichamen, B- of T-cellen15.

Flagelline is het structurele component van het bacteriële flagellum. In zijn monomere vorm wordt het herkend door twee Pathogen Recognition Receptors (PRR's), TLR5 die extracellulair FliC16 detecteert en NLRC4/NAIP5 inflammasoom dat intracellulair flagelline detecteert17,18. Wanneer FliC wordt gedetecteerd door de PRR's, wordt een belangrijke ontstekingsreactie geactiveerd. Wij en anderen hebben aangetoond dat instillatie van gezuiverd FliC uit Salmonella enterica serovar Typhimurium in de longen leidt tot een snelle productie van chemokines en cytokinen, vooral wanneer het wordt herkend door het longepitheel, dat op zijn beurt de recrutering van immuuncellen naar de luchtwegen, voornamelijk PMN's, orkestreert15,19-21. Hoewel tijdelijk, zou de substantiële neutrofieleninfiltratie die plaatsvindt in de luchtwegen na nasale toediening van FliC een zorg kunnen zijn als we gaan naar klinische therapieën voor menselijk gebruik. Overmatige ontsteking zou nadelig kunnen zijn voor de functie van de longen. Bovendien is aangetoond dat intranasale toediening van immunostimulerende moleculen gezichtsverlamming en/of hersentoxiciteit kan veroorzaken22-24.

Sublinguale immunotherapie biedt een veiligere alternatief om het immuunrespons in de luchtwegen te moduleren in vergelijking met de intranasale route. Het is niet-invasief, pijnloos, eenvoudig en heeft een goede patiëntcompliantie25. Verder, zoals eerder vermeld, kan het beschermende reacties in het respiratoire slijmvlies induceren zonder de risico's die geassocieerd zijn met directe intranasale of intrapulmonale toediening van formuleringen. De sublinguale route kan alternatief worden gebruikt om moleculen te leveren die grote effecten hebben op het immuunsysteem van de longen, maar die zijn bewezen giftig of grote ontsteking veroorzaken wanneer intranasaal worden toegediend. Naast deze voordelen hebben formuleringen voor sublinguale immunotherapie lagere productiekosten, aangezien niet-steriele producten via deze route kunnen worden geleverd en endotoxic shock geen zorg is voor SLIT. Aan de andere kant is het vermeldenswaard dat hogere doses van de immunostimulerende verbindingen nodig zijn in vergelijking met die gebruikt door intranasale of parenterale routes om een immuunrespons in de longen te induceren; ook zijn hoog geconcentreerde oplossingen nodig bij gebruik van het muismodel van SLIT, aangezien de anatomische plaats waar de formuleringen worden afgezet klein is.

Op basis van onze eerder gepubliceerde gegevens, ontwikkelden we een beschermingsmodel dat gebruik maakt van sublinguale immunotherapie met flagelline als modelimunostimulerend middel. We toonden aan dat een enkele dosis flagelline 60% overleving induceerde tegen invasieve pneumokokkenpneumonie veroorzaakt door de serotype 1-stam, terwijl alle muizen in de controlegroep binnen 5 dagen aan de infectie stierven. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat een hoger aantal PMN's werd gerekruteerd in de luchtwegen van beschermde dieren na sublinguale behandeling met flagelline, wat su

Protocol

Procedures waarbij dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen N ° 071140-000821-12 en 08052010 van de Ere-Commissie voor Dierproeven en de richtlijn Raad van de School of Medicine, Universidad de la República goedgekeurd - Uruguay.

1 sublinguale toediening van het therapeutische middel

  1. Bereid de oplossing die het therapeutische middel te testen. Stel concentratie een maximum volume van 10 pi per muis beheren.
    OPMERKING: Voor gezuiverd flagelline van Salmonella enterica serovar Typhimurium de optimale dosis om bescherming in muizen die besmet zijn met het eerste dodelijke dosis van S. induceren pneumoniae serotype 1 E1586, 100% sterfte veroorzaakt is 10 ug / muis. Flagelline oplossing moet bij 65 ° C gedurende 5 minuten verhit om afgifte van de monomeren te verzekeren. Voor meer informatie over flagelline zuivering zie referentie 26.
    1. Vary effectieve concentratie van verschillende immunomodulerende middelen volgens de molecuulgrootte, zuiverheid, gevoeligheid voor proteolyse en het gebruik van mucoadhesieve middelen. Pas optimale concentratie voor elke verbinding te testen om de effecten te maximaliseren. Als eerdere studies door intranasale route zijn uitgevoerd voor een bepaalde verbinding, in een startdosering 5 tot 10 keer hoger zijn werkzaamheid testen door sublinguale route.
  2. Verdoven de muizen door het injecteren van een cocktail bevattende 110 mg / kg ketamine met 5,5 mg / kg Xylacine en laat de dieren rusten gedurende 7 tot 10 minuten.
  3. Bevestig de juiste verdoving door zachtjes te drukken op de voetzool van een van de achterpoten; indien goed verdoven het dier beweegt niet in reactie op de stimulus.
  4. Een dun laagje vet zalf over de ogen van elke muis tot droog voorkomen terwijl onder verdoving.
    OPMERKING: inademing anesthetica zoals isofluorane kan ook worden gebruikt in plaats Ketamine / Xylacine als een systeem rustenped met inductie kamer en neus kegels beschikbaar. Gebruik de inductie kamer om de dieren te verdoven en beheren de immunostimulant door sublinguale route. Onmiddellijk verbinding het dier een neuskegel ten minste 15 minuten om het onder narcose houden inslikken voorkomen en laat absorptie van de therapeutische verbinding.
  5. Pipet de oplossing die de immunostimulant of het voertuig oplossing; met behulp van de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand nemen de muis en houd hem in verticale positie.
  6. Met behulp van de dominante hand plaats een paar gesloten tang onder de tong en houd deze op zijn plaats met behulp van het midden-en ringvinger, opent de tang iets naar de tong te tillen.
  7. Neem de pipet en dien de oplossing op de bodem van de mond en dorsale zijde van de tong.
  8. Verwijder de forceps en laat de muis rusten gedurende 3 tot 5 minuten alvorens deze weer in de kooi. Om ervoor te zorgen dat normothermie wordt gehandhaafd in de verdoofde mice Sluit de kooien om een ​​kooi verwarmingssysteem. Indien dergelijk systeem niet beschikbaar, plaats muizen van dezelfde behandelingsgroep terug in het overeenkomstige kooi een naast elkaar over het beddengoed en deze gedeeltelijk bedekken met schone tissue papiervellen wanneer hiermee de lichaamstemperatuur.
  9. Verzamel weefselmonsters op elk tijdstip na de toediening van de immunomodulerende middel van veranderingen in de celpopulaties geïnduceerd door de behandeling analyseren.
    OPMERKING: In dit specifieke protocol toediening van flagelline werd uitgevoerd 2 uur voor uitdaging. Bepaal optimale tijd tussen behandeling en uitdaging voor elke afzonderlijke therapeutische middel en pathogeen te testen.

2 Voorbereiding van de bacteriële suspensie en Intranasale Challenge met Streptococcus pneumoniae

OPMERKING: S. pneumoniae is een natuurlijke menselijke pathogeen dat levensbedreigende ziekten zoals invasieve pneumonie, sepsis kunnen veroorzakenen meningitis. Transmission optreden bij inademing of contact met slijmvliezen. Daarom, alle monsters die in contact kunnen zijn geweest met S. pneumoniae moet met een hiertoe Biosecurity Level II-faciliteit met een klasse II bioveiligheid kast worden behandeld. Controleer de Standard Operating Procedures van uw instelling met betrekking tot de behandeling van type II pathogenen voor beschermende kleding, afvalverwerking en aanvullende beveiligingsmaatregelen die van toepassing kunnen zijn. Besmette dieren moeten worden gehouden in individueel geventileerde kooien in isolatoren voorzien van HEPA-filters. Anti-pneumokokken vaccins en antibiotica behandeling zijn beschikbaar. Voor meer informatie zie de referenties 27 en 1.

  1. Ontdooi een hoeveelheid van een werkvoorraad suspensie van Streptococcus pneumoniae van bekende bacteriële CFU aantal bereid zoals beschreven in 15.
  2. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2500 xg en RT.
  3. Verwijder het supernatant en was de bacteriële pellet door schorsing van het in 1 ml van sterile zoutoplossing. Gebruik filter tips bij het opstellen van bacteriële suspensie, verdunningen of voor dierlijke uitdaging.
  4. Centrifugeer opnieuw zoals beschreven in stap 2.2.
  5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid steriele zoutoplossing aan een suspensie van 4x10 5 CFU / 50 pl te verkrijgen. Deze dosis komt overeen met de minimum bacteriële dosis S. pneumoniae serotype 1 E1586 die 100% mortaliteit veroorzaakt BALB / c muizen volgens eerdere studies 15.
    OPMERKING: Bij de vaststelling van een model van pneumokokkenpneumonie bij muizen, de minimale bacteriële dosis die 100% van de sterfte moet worden bepaald voor elke specifieke combinatie van bacteriële stam, serotype en muis stam.
  6. Homogeniseren van de bacteriële suspensie door vortexen of en neer te pipetteren 5 keer.
  7. Plaats 50 gl bacteriesuspensie met een steriele filter tip en wekt de totale hoeveelheid in de neusgaten van een verdoofde muis. Houd de muis Upright gedurende 2 minuten en laat het rusten in dorsale positie voor 2 minuten. Solliciteer dierenarts zalf op de ogen en de terugkeer van de dieren naar de kooi; zorg ervoor om normothermie handhaven, terwijl onder narcose.
    Opmerking: In dit onderzoek bacteriële uitdaging werd uitgevoerd in een volume van 50 ul levering van ten minste 90% van het totale CFU waarborgen in de longen zoals eerder bepaald 15,28. Om nood van het dier kleinere volumes (bijvoorbeeld 20 pi) worden gebruikt minimaliseren. Echter, moet efficiënte levering van bacteriën in de longen worden gecontroleerd; Dit kan door het oogsten van de longen 5 min na prikkeling en tellen CFU in homogenaten longen door uitplating seriële verdunningen op bloed-agarplaten.
  8. Bevestig de CFU nummers in de bacteriële suspensie gebruikt voor infectie door plating seriële 10-voudige verdunningen op bloed agar platen. Incubeer O / N bij 37 ° C met 5% CO2 en tel het aantal mucoïde kolonies die een groene halogeen kenmerk van alpha hemolytische bacteriën.

3 Tissue Collection en Monstervoorbereiding voor flowcytometrie (FACS) Analyse

3.1) weefselverzameltoestel

  1. Euthanaseren het dier door cervicale dislocatie of met een CO 2 kamer; Open de borstholte helemaal tot aan de nek en een insnijding langs de voorpoten op de ventrale zijde van de hals en submandibulaire gebied bloot.
  2. Met de fijne punt gebogen pincet voorzichtig omhoog te trekken van de speekselklieren en de aangrenzende weke delen aan de dorsale zijde van de mond vloer bloot. Met behulp van gebogen dunne tip pincet, neem de onderkaak en accessoire mandibulaire lymfknopen door zachtjes te trekken en leg ze in een buisje met volledige RPMI (cRPMI, voor 500 ml- 10% Foetaal Bovine Serum, 5 ml van een oplossing die 10.000 E / ml penicilline en 10 mg / ml streptomycine-oplossing en 5 ml L-glutamine 200 mM) of nucleïnezuur conserverende oplossing volgens de stroomafwaartse procedure zallater worden uitgevoerd.
  3. Openen van de borstholte een insnijding in het membraan; met behulp van een paar van de rat-getande tang klem de xyphoid kraakbeen van het borstbeen en knip de ribben aan beide dorsale zijden vanaf de valse ribben helemaal naar boven tot aan het punt waar de ware ribben aan de manubrium van het borstbeen.
  4. Door het vasthouden van de xyphoid kraakbeen van het borstbeen met de tang, trek zachtjes aan de organen van de borstholte bloot.
  5. Verwijder de ribben volledig door het snijden van de eerste ribben en het sleutelbeen. De thymus verschijnt als een witte structuur twee lobben in de anteroventral gedeelte van de thorax nabij de basis van het hart.
  6. Neem een ​​van de lobben door klemmen met een pincet en gebruik een schaar de ligamenten tussen de inferieure gezicht en het pericardium verwijderen. Overgaan tot de tweede kwab verwijderen.
  7. Identificeer de buikholte en open deze door te snijden langs de middenas van de muscular muur naar de organen bloot. Met een pincet knippen de achterste holle ader en thoracale aorta; Verwijder het teveel aan bloed met een absorberende tissue.
  8. Analyseren van de bewoner en infiltreren cel populaties van de longblaasjes voeren bronchoalveolaire lavage (BAL). Snijd de spieren in het ventrale deel van de nek naar de luchtpijp en de slokdarm brengen; om ze te scheiden maken incisies bij laterale en dorsale zijden van de structuren.
  9. Til de luchtpijp met de tang en een kleine incisie met een scalpel een dunne-tip pipet wordt gevuld met 1 ml PBS voeren zonder Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA. Bijbrengen en zuig het totale volume ten minste drie keer; aspireren en breng de celsuspensie in een steriele 1,5 ml tube en plaats het op het ijs.
  10. De celpopulaties aanwezig in longparenchym analyseren eerst de longen perfuseren door het injecteren van 5 ml van PBS zonder Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA in het rechterventrikelvan het hart.
    OPMERKING: Dit zal het grootste deel van de rode bloedcellen en het immuunsysteem cellen aanwezig in de bloedvaten van de longen 'te elimineren. Als perfusie correct werd uitgevoerd, zal longen kleurverschuiving van roze naar wit.
  11. Isoleer het hart van de longen door klemming van de basis van de linkerventrikel en subtiel de bloedvaten met een schaar gesneden om deze volledig te verwijderen. Neem geperfundeerde longen en plaats ze in cRPMI of nucleïnezuur stoffen zijn toegevoegd, afhankelijk van de stroomafwaartse analyse uit te voeren.
  12. Voor de analyse van de celpopulaties in de sublinguale mucosa, isoleren de kop van het dier en verwijder de speekselklieren en aangrenzende zachte weefsels als deze niet is gebeurd in stap 3.2.1.
  13. Maak een insnijding aan beide zijden van de mond tot aan de onderkaak gewricht en scheiden de onderste kaak tezamen met de tong en de bodem van de mond, gebruikt kunnen repareren aan de dissectie bord. Trek de tong; met behulp van een scalpel een incisie te maken waar de base van de tong aan de vloer van de mond tot aan de derde molaren de sublinguale mucosa bloot.
  14. Volledig verwijderen van de tong; neem een ​​0,5 mm biopsie punch en leg deze naast de onderste snijtanden. Snijd uit het tandvlees inbrengen van de sublinguale weefsel en druk zachtjes tot de vloer van de mond is volledig uitgesneden.
  15. Herhaal nog een tijd plaatsen van de biopsie punch dichtbij de derde molaren verwijdering van de sublinguale weefsel voltooien. Plaats op een schone buis met cRPMI of nucleïnezuur conserveermiddel.

3.2) Voorbereiding van het monster voor FACS analyse.

  1. Breng weefsel longen geïsoleerd uit elke muis in een 24-well plaat en gehakt met een schone schaar verkrijgen tot kleine stukjes weefsel van ongeveer 2 mm. Voeg 1 ml per putje van digestie medium bevattende 30 mg collagenase type II, 50 ug DNAse-I in 1 ml RPMI zonder FBS. Pipet op en neer vijf keer en incubeer bij37 ° C en 5% CO2 gedurende 40 minuten.
    1. Voor de analyse van celpopulaties in de sublinguale weefsel wordt vervangen digestiemedium 3.2.1 met een met 2 eenheden van Dispase, 30 mg collagenase type II, 50 ug DNAse-I in 1 ml RPMI. Incubeer de verzamelde ve muis in 500 ul digestiemedium voor 20 min weefsel bij 37 ° C in een orbitale schudder bij 50 rpm.
  2. Na incubatie pipet op en neer tot 10 keer of 30 seconden tot het meeste weefsel is verstoord. Filter de celsuspensie hoewel een 40 urn steriele cel zeef en was met 5 ml PBS aangevuld met 5 mM EDTA.
    OPMERKING: Volledige ontsluiting van de extracellulaire matrix en vezelig weefsel zal niet worden gehaald. Echter, langere incubatietijd keer in aanwezigheid van collagenase en / of dispase of agressieve fijnwrijving afgeraden, omdat het zal leiden tot een verhoogde celdood en vernietiging van extracellulaire eiwitten die het totale resultaat van de FACS analyse.
  3. Centrifugeer bij 400 xg, 5 min, 4 ° C.
    1. Voor de analyse van de celpopulaties in BAL, centrifugeer de cellen bij 400 xg, 5 min bij 4 ° C en doorgaan met stap 3.2.4.
    2. Voor de analyse van celpopulaties in de lymfeklieren, plaats een 70 um cel zeef op een steriele petrischaal gebracht en de lymfeklieren met 1 ml van cRPMI in de zeef. Neem een ​​duik van een 2 ml steriele spuit en gebruik het als een stamper naar de lymfeklieren tegen gaas de zeef's verpletteren. Spoel de cel zeef met 1 ml verse cRPMI en breng de cellen van de petrischaal in een steriele buis.
  4. Een representatief monster van elk monster en vlekken met trypaanblauw aan aantal levensvatbare cellen te bepalen.
  5. Resuspendeer de cellen in FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% Bovine Serum Albumin- om een suspensie van 2x10 7 cellen / ml en voeg 50 ul aan een cytometer buis.
  6. Bereid een 2X antilichaam mix bevat de ca.opriate combinaties van antilichamen tegen oppervlaktemerkers en fluorochromen volgens de beschikbare FACS instrument. Voeg 50 ul van 2X antilichaam mengsel in elke buis met de celsuspensie.
    OPMERKING: Titreer elk fluorochroom gemerkte antilichaam de optimale hoeveelheid moeten worden vastgesteld voor een gedetailleerd protocol zie referentie 29.
  7. Incubeer 30 min op ijs in het donker.
  8. Was eenmaal met 3 ml van FACS-EDTA en spin down de cellen door centrifugeren bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C, resuspendeer de cellen in 200 ul van dezelfde buffer en geanalyseerd op een flow cytometer.
    OPMERKING: Bij de behandeling van een groot aantal monsters kan de kleuring protocol voor FACS-analyse beschreven in U-bodem 96-well platen in plaats van cytometer buizen worden uitgevoerd. Indien gebruikt stappen platen wassen 96 putjes worden uitgevoerd door het toevoegen tot 200 ui FACS-EDTA en herhalen 4 keer stoppen met draaien de cellen bij 400 g gedurende 5 min bij 4 ° C tussen elk washing stap.
  9. Op dit punt, bevestig de monsters voor analyse in de flowcytometer later (tot 72 uur na bevestiging).
    1. Om de cellen te repareren na labeling met de FACS-antilichamen was de cellen in PBS zonder Ca2 + / Mg2 +, 1 mM EDTA zonder FBS. Suspendeer de cellen in 50 ul van dezelfde buffer en voeg 50 ul van een vers bereide 4% paraformaldehyde oplossing hypertoon (2X) PBS zonder Ca2 + / Mg2 +.
    2. Incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur en was 3 maal in FACS-EDTA.
    3. Resuspendeer de cellen in 200 ui FACS-EDTA en bewaar bij 4 ° C en beschermd tegen licht gedurende maximaal 72 uur.
      OPMERKING: FSC-SSC kan worden beïnvloed door fixatie. Indien de vaststelling van de monsters de compatibiliteit van fluorescent gelabelde antilichamen met de fabrikant sinds tandem kleurstoffen kunnen worden afgebroken in aanwezigheid van fixatief agenten. Als monsters afkomstig van besmette dieren fixatie wordt sterk aanbevolen om ervoor te zorgen dat er geen levensvatbare ziekteverwekkers aanwezig zal zijn bij het analyzingen de monsters in de FACS machine sinds microaerosols tijdens acquisitie van het monster kan worden gegenereerd.

4 Totaal RNA-extractie, cDNA Synthesis en Real Time PCR.

4.1) RNA-extractie en cDNA synthese.

  1. Homogeniseer het weefsel in het nucleïnezuur conserverende oplossing van keuze door mechanische verbreking (bijvoorbeeld met behulp van een rotor-stator homogenisator, snelle schudden weefsel-ruptor en kralen, etc.). Centrifugeer bij 12.600 xg gedurende 15 min en 4 ° C om het weefsel vuil te verwijderen. Breng de supernatant een schone buis.
  2. Extraheer het RNA met de methode van keuze volgende instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: RNA is zeer gevoelig voor degradatie, indien niet gaat meteen na isolatie worden gebruikt, maken aliquots en opslaan in RNAse vrij buizen bij -80 ° C. Vermijd herhaaldelijk bevriezen en ontdooien. De buizen moeten met handschoenen te allen tijde worden behandeld. Na ontdooien van de monsters eenltijd bewaar ze op ijs.
  3. Meet de absorptie van nucleïnezuren bij 260 nm en bereken de concentratie in ug / ul.
  4. Bereid DNAse-I meng door toevoeging van (voor 1 monster): 7.6 gl ultrazuiver water, 1 ui 10X DNAse I-buffer, 0,4 pl DNAse-I (amplificatie graad) stock 1 U / pl, en voeg 8,4 pl de DNAse-I mixen om elk monster met 1 ug totaal RNA.
    1. Gebruik RNA bij een concentratie van 1 ug / ul en voer de retrotranscription reactie (RT-PCR) door toevoeging van 1 pi van het totale RNA als matrijs. Als de monsters te verdunde en de concentratie lager dan verwacht, voeg grotere hoeveelheden totaal RNA in plaats van water. Niet meer dan 20% van de uiteindelijke reactie volume bij het toevoegen van het RNA speciaal als de RNA-extractie protocol van keuze betrokken fenolchloroform mengsel sinds fenol sporen kunnen invloed hebben op de opbrengst van de RT-PCR.
  5. Incubeer 15 min bij kamertemperatuur gevolgd door 10 min bij 4 ° C of ice. (Overschrijd de incubatietijd !!)
  6. Voeg 1 pl 25 mM EDTA (moleculaire biologie rang) aan elke buis en incubeer bij 65 ° C gedurende 10 min inactivatie van het DNAse-I.
  7. Bereid retrotranscription (RT) mix als volgt (1 reactie): 1 pl willekeurige hexameerprimers voorraad 0,2 mg / ml, 1 ui dNTP voorraad 10 mM, 4 ui 5X M-MLV-RT buffer, 2 ui 0,1 M DTT, 1 ui RNAse OUT voorraad 40 U / ul, en 1 pi M-MLV retrotranscriptase voorraad 200 U / ul.
  8. Voeg 10 ul van RT-PCR mixen om de 10 ul DNAse I-reactiebuis.
  9. Voer de PCR-reactie in een thermische cycler volgens het volgende programma:
    1X cyclus: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 min, 70 ° C
  10. Verdun het cDNA 1: 5 door toevoeging van 80 ul van ultrazuiver water. Bewaren bij -20 ° C.

4.2) Real time PCR (qPCR).

  1. Bereid qPCR reactiemengsel als volgt (1 reactie): 5 pi Master Mix met Taq DNA Polymerase, SYBR Green kleurstof, PCR buffer, dNTP mix en MgCl2 (zie 4.2.2 hieronder); 0,9 pi van een 10 pM voorraadoplossing van de voorwaartse primer, 0,9 pl van een 10 uM voorraadoplossing van de reverse primer, 1,2 pl ultrazuiver water, en 2 ui cDNA template eerder verdund zoals aangegeven in stap 4.1.10.
    OPMERKING: reagens concentratie en fietsen protocollen die worden gebruikt in deze sectie werden geoptimaliseerd om specifiek met de reagentia en instrumenten in "Tabel van materialen en reagentia" beschreven worden uitgevoerd, andere merken kunnen worden gebruikt, maar de reactie volumes, kan reagens concentratie en fietsen protocol afwijken. Controleer uw instructies van de fabrikant voor het uitvoeren van RT-qPCR.
  2. Het opzetten van de qPCR instrument als volgt:
    1X cyclus: 15 min, 95 ° C
    40X cycli: 15 sec, 95 ° C gevolgd door 1 min, 60 ° C (op dit punt acquire fluorescentie).
    OPMERKING: Voor de relatieve kwantificatie van mRNA volgens de Ct-methode 30 een reference gen worden geselecteerd voor normalisatie van de Ct waarden. Referentie gen keuzemogelijkheid onder specifieke testcondities getest als expressie kan variëren, ACTB, GAPDH en 18S zijn enkele van de genen gewoonlijk geselecteerd gevonden.
  3. Stel de drempelwaarde en de gegevens te analyseren.

Resultaten

Sublinguale immunotherapie succes kan worden gebruikt immuunrespons longen moduleren. We toonden aan dat een enkele dosis van flagelline, de TLR5 en NLRC4 agonist kunnen aanzienlijke opwaartse regulatie van het mRNA dat codeert voor het induceren chemokines CXCL1, CCL20 en het cytokine IL-6 vergeleken met zoutoplossing behandelde controles. Voudige inductie van mRNA niveaus piek van 8 uur na SLIT en terug naar basale niveaus na 20 uur (figuur 1). Wanneer SLIT werd toegepast 2 uur vóór intranasale infectie met S. Pneumoniae, niveaus van CXCL1 en IL6 mRNA bleef aanzienlijk opgereguleerd zelfs 24 uur na SLIT vergelijking met niet behandelde dieren (figuur 2).

Analyse van de celpopulaties in BAL en longweefsel door FACS gebleken dat dieren behandeld met FliC door sublinguale route aantal neutrofielen was toegenomen in de luchtwegen, maar niet in de longen weefsel (Figuur 3).

Tenslotte overleving na pneumococcal challenge vergeleken bij dieren die eerder met FliC behandeld met sublinguale route of met zoutoplossing als controle. Zoals getoond in figuur 4, SLIT met flagelline bevorderde verhoogde overleving en bescherming tegen acute pneumokokkenpneumonie.

figure-results-1
Figuur 1 Kinetiek van transcriptionele profiel de longen na sublinguale immunotherapie met flagelline. Acht tot 10 weken oude BALB / c muizen (n = 4) werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld door sublinguale route onder verdoving. De longen werden op verschillende tijdstippen verzameld en in nucleïnezuur conserveermiddel. Totaal RNA extractie werd uitgevoerd en cDNA werd gesynthetiseerd. mRNA niveaus werden geëvalueerd door real time PCR gebruikt in Tabl vermelde specifieke primerse 1 Relatieve kwantificatie werd uitgevoerd volgens ACt methode met ACTB mRNA niveaus voor normalisatie. Resultaten worden weergegeven als voudige toename vergeleken met zoutoplossing behandelde groep mediaan ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) berekend volgens Mann-Whitney test. De resultaten zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten.

figure-results-2
Transcriptionele profiel Figuur 2 longen tijdens pneumococcen pneumonie na sublinguale immunotherapie met flagelline (n n = 4 voor controlegroep en = 7 voor behandelde groep). Acht tot 10 weken oude BALB / c muizen werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld met sublinguale route onder narcose. 2 uur later werden de muizen uitgedaagd door intranasale route met de minimale dodelijke dosis (MLD), waardoor 100% mortaliteit van een klinisch isolaat van S. pneumoniae serotype 1 E1585, overeenkomend met 4x10 5 CFU / 50 pl. De longen werden 24 uur na prikkeling verzameld en opgeslagen in nucleïnezuur stoffen tot RNA-extractie en cDNA-synthese werden uitgevoerd. Real time PCR werd uitgevoerd (zie primer lijst in tabel 1) en relatieve kwantificatie werd uitgevoerd volgens ACt met gebruik ACTB mRNA niveaus voor normalisatie. Resultaten worden weergegeven als voudige toename vergeleken met zoutoplossing behandelde groep mediaan ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) berekend volgens Mann-Whitney test.

figure-results-3
Figuur 3 Analyse van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) werving in het weefsel en de luchtwegen de longen 'na SLIT. Acht tot10 weken oude BALB / c muizen (n = 4) werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld door sublinguale route onder verdoving. 2 uur later werden de muizen uitgedaagd door intranasale route met de MLD van S. pneumoniae serotype 1 E1585. 24 uur na provocatie, BAL werd uitgevoerd en de longen werden verwerkt voor FACS-analyse. PMN werden geïdentificeerd als Ly6G hoog / CD11b hoog / CD11c negatieve cellen en van de FCS-SSC profiel. Resultaten worden uitgedrukt als percentage van PMN ten opzichte van de totale celaantallen in BAL of longen. Balken geven mediaan ± SEM. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) berekend volgens eenrichtingsverkeer Mann-Whitney test.

figure-results-4
Figuur 4 SLIT met flagelline muizen beschermt tegen acute pneumokokkenpneumonie. Acht tot 10 weken oude BALB / c muizen (n = 8) werden met 10 ug van flagelline of zoutoplossing behandeld door sublinguale route onder verdoving. 2 uur later werden de muizen uitgedaagd door intranasale route met de MLD van S. pneumoniae serotype 1 E1585. Overleving werd beoordeeld op een dagelijkse basis. Kaplan-Meier curves werden met elkaar vergeleken op basis Log-rank (Mantel-Cox) test. Sterretjes geven significante verschillen (p <0,05) .Results zijn representatief voor 2 onafhankelijke experimenten.

Naam Sequentie 5'-3 ' PCR-product lengte (bp)
mB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68
mB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG
mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69
mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC
mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84
mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT
mIL-6_F GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78
mIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA
mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63
mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT
mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72
mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC

Tabel 1 Primer lijst gebruikt voor real-time PCR analyse. Specifieke primer sequenties gebruikt voor qPCR analyse. Forward en reverse primers voor muis ACTB, Cccl20, CXCL1, IL6, TNFA en CXCL1 worden gepresenteerd als 5'-3'-sequenties en de verwachte duur product staat in basenparen (bp).

Discussie

Sublinguale toediening van therapeutische middelen is bewezen als een nuttig middel om de immuunreactie in de luchtwegen moduleren. Het belangrijkste voordeel van SLIT voor de behandeling van luchtwegaandoeningen is dat het niet een rechtstreekse afgifte van verbindingen in de longen of neus, die veiliger dan behandelingen gebaseerd op intranasale toediening 31.

Sublinguale immunotherapie worden gebruikt om de immuunrespons op verschillende manieren moduleren, hetzij voor inductie van regulatoire reacties die kan verlichten de symptomen van allergische ontsteking en astma 32 of tijdelijke activering van het aangeboren immuun mechanismen induceren van acute longinfecties behandelen zijn.

Het muismodel in deze video is een geschikte werkwijze voor het screenen van verschillende verbindingen als therapeutische middelen voor SLIT.

Dit diermodel een nuttig middel om de impact te bepalenvan SLIT immuunrespons de longen alsmede in andere organen (bijvoorbeeld., afvoerende lymfeknopen of distale mucosale sites) die niet kan worden nagebootst door het gebruik van in vitro modellen. Hoewel er verschillende kranten dat de resultaten verkregen met behulp van sublinguale immunotherapie beschrijven, gedetailleerde methoden voor de procedures van sublinguale toediening niet beschikbaar zijn nog niet gemaakt. Bovendien kan het model worden gebruikt voor de evaluatie van sublinguale vaccins gericht op systemische en lokale bescherming te verlenen in de luchtwegen.

Zoals getoond in de bijgaande video, sublinguale toediening van verbindingen is een eenvoudige procedure die snel kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van uitgebreide training. Doorgaans zal een persoon die bedreven zijn in de behandeling van dieren 1 uur nodig om SLIT presteren in een groep van 10 muizen met behulp van injecteerbare anesthetica zoals beschreven in dit protocol. Als pneumokokken uitdaging ook is uitgevoerd, zal 90 extra min voorbereiden moetende bacteriële suspensie en voer intranasale uitdaging van de dieren.

De FACS protocollen hier gepresenteerde bieden eenvoudig karakterisering van het effect van SLIT bij de lokale plaats van toediening, drainerende lymfeknopen en hun effecten op celdynamiek de longen.

Afzonderlijke analyse van de broncho inhoud en longparenchym is belangrijk om immuun inwoner van de luchtwegen en het infiltreren van celtypen van degenen die in het weefsel blijven discrimineren. Analyse van de BAL inhoud maakt de studie van alveolaire macrofaag omzet en de dynamiek van cellen rekrutering bij alveolaire ruimten geïnduceerd door verschillende behandelingen, bijvoorbeeld. PMN's, eosinofielen, monocyten. BAL kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van uitgescheiden cytokines en chemokines beoordelen door Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of detectie van uitgescheiden IgA antilichamen opgewekt na sublinguale vaccinatie. Studie van weefsel de longenzal karakterisatie van andere celtypes, klassieke dendritische cellen, T-cellen en B-cellen mogelijk.

Bereiding van BAL monsters en lymfeknopen, voor FACS-analyse is eenvoudig. Na monstername, worden normaal gesproken 60 minuten nodig om de kleuringsprotocol voltooien voor 10-20 monsters. Daarentegen zal isolatie van cellen van de longen of sublinguale weefsel meer tijd nodig omdat digestie van de extracellulaire matrix vereist. De absorptie van het therapeutische middel door sublinguaal toegediend worden kunnen worden aangepakt door het volgen van fluorescent of radioactief gelabelde moleculen via in vivo beeldvormende systemen.

Sublinguale immunotherapie is een aantrekkelijke manier om immuunreacties van de luchtwegen en systemisch die kan worden gebruikt voor het behandelen of voorkomen van ademhalingsaandoeningen effectief induceren. Opheldering van de mechanismen die ten grondslag activatie vs tolerantie van de immuunreactie in de luchtwegen na SLIT is cruciaal rationele ontwerp van nieuwe therapeutische strategieën die alleen of in combinatie kunnen worden gebruikt met beschikbare behandelingen tegen verschillende respiratoire toelaat.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We acknowledge Dr. Jean-Claude Sirard from the Center for Infection and Immunity of Lille, Institute Pasteur de Lille-France, voor het vriendelijk verstrekken van de gezuiverde flagelline en Dr. Teresa Camou, directeur van het National Reference Laboratory, Ministerie van Gezondheid van Uruguay voor het vriendelijk verstrekken van de pneumokokkenstam.

De auteurs willen hun dank betuigen aan de heer Diego Acosta en de heer Ignacio Turel form BichoFeo Producciones-Uruguay voor hun toewijding en harde werk tijdens de gehele videoproductie en -bewerking.

Dit werk werd ondersteund door de subsidies PR_FCE_2009_1_2783 en BE_POS_2010_1_2544 van de Nationale Agentschap voor Onderzoek en Innovatie, ANII van Uruguay, het Programma voor Ontwikkeling van de Fundamentele Wetenschappen, PEDECIBA van Uruguay en de Sectorale Commissie voor Wetenschappelijk Onderzoek, CSIC-Universidad de la República, Uruguay.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ketamine-oplossing (50 mg/ml)Pharma Service, Uruguay
Xilacine-oplossing (2 %)Portinco S.A., Uruguay
Steriele 1 ml-spuitModern, Uruguay
Steriele 27 G-naaldModern, Uruguay
RPMI 1640General Electric Health CareE15885
Foetaal runderserumATCC302020
Penicilline/Streptomycine-oplossingSIGMAP4333
Steriele PBS zonder Ca2+/Mg2+PAAH21002
Type-I CollageenaseLife Technologies/Gibco17100017
Deoxyribonuclease I (DNAse-I)SIGMAD4513
DispaseLife Technologies/Gibco17105041
PerCP-Cy5.5 geconjugeerd rat anti muis IgG2b anti CD11bBD550993Clone M1/70
APC geconjugeerd hamster anti muis IgG1 anti CD11cBD550261Clone HL3 
APC-Cy7 geconjugeerd rat anti muis IgG2a anti Ly6GBD560600Clone 1A8
Steriele zoutoplossingLaboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay
Tryptic Soy AgarBD Difco, France236950
Defibrinerend schapenbloedBiokey, Uruguay
Steriele Petri-schalenGreiner633180
p10 PipetGilsonF144802
p20 PipetEppendorf3120000097
p200 PipetGilsonF123601
p200 PipetCappC200
p200 PipetEppendorf3120000054
p1000 PipetEppendorf3120000062
Steriele filtertips p10Greiner771288
Steriele filtertips p200Greiner739288
Steriele filtertips p1000Greiner750288
VortexBIOSANV1-plus
Roestvrijstalen pincet met fijne punt SIGMAZ168785/Z168777Gebogen en recht
Bindweefsel pincetSIGMAF4392Lengte 8 inches
Microdissectie pincetSIGMAF4017Recht 
Microdissectie pincetSIGMAF4142 Gebogen
Mayo schaarSIGMAZ265993 
ScalparelSAKIRA MEDICAL
Steriele Biopsie Punch Ø 3mmStiefel Laboratories Ltd.2079D5 mm diameter kan ook worden gebruikt
Steriele 1.5 ml-buisjesDeltalab200400P
Steriele 15 ml-buisjesGreiner188271
Steriele 50 ml-buisjesGreiner227261
Steriele serologische pipetten 5 mlGreiner606160
Steriele serologische pipetten 10 mlGreiner607160
Steriele serologische pipetten 25 mlGreiner760180
Biologische veiligheidskast, klasse IIThermo Scientific1300 series, type A2
Micro-Isolator RackRAIR IsoSystem 76144WSuper Mouse 1800 AllerZone 
Gekoelde microcentrifugeEppendorfLegend Micro 21R
MicrocentrifugeHeraeusBiofuge-pico
CentrifugeThermo ScientificSorval ST40R
CO2 Incubator Thermo ScientificModel  3111
Steriele dunne punt pasteur pipettenDeltalabD210022
Steriele pasteur pipettenDeltalab200007
Steriele 24-well plateGreiner662160
Trypan Blue-oplossing Life TechnologiesT10282
Automatische Celteller - CountessLife TechnologiesC10227 
Countess Celtellingkamer SlidesLife TechnologiesC10312
Flow Cytometry TubesBD343675
Flow Cytometer - FACS Canto-IIBD
Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q of ABI 7900Qiagen / Applied Biosystems
Trizol ReagentLife Technologies15596-026Moleculair Biologie Grad
DNAse-ILife Technologies18068-015Moleculair Biologie Grad
DNAse-I Buffer 10XLife Technologies18068015Moleculair Biologie Grad
EDTA 25 mMLife Technologies18068015Moleculair Biologie Grad
Ultra-Pure WaterLife Technologies10977Moleculair Biologie Grad
RNAse OutLife Technologies100000840Moleculair Biologie Grad
Random Hexamer PrimersLife TechnologiesN8080127Moleculair Biologie Grad
M-MLV-RT bufferLife Technologies18057-018Moleculair Biologie Grad
M-MLV-RT enzymLife Technologies28025-021Moleculair Biologie Grad
QuantiTect Syber Green PCR KitQiagen204143Moleculair Biologie Grad
Specifieke primers Life TechnologiesMoleculair Biologie Grad

Referenties

  1. Pneumococcal vaccines WHO position paper--2012. Weekly Epidemiological Record. 14, 129-144 (2012).
  2. Pneumonia - Facts Sheet N°331. , WHO. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/en (2013).
  3. Appelbaum, P. C., et al. Carriage of antibiotic-resistant Streptococcus pneumoniae by children in eastern and central Europe-a multicenter study with use of standardized methods. Clin Infect Dis. 23, 712-717 (1996).
  4. Ramirez, J. A., Anzueto, A. R. Changing needs of community-acquired pneumonia. J Antimicrob Chemother. 66, 3-9 (2011).
  5. Cuburu, N., et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice. Vaccine. 25, 8598-8610 (2007).
  6. Pedersen, G. K., et al. Evaluation of the sublingual route for administration of influenza H5N1 virosomes in combination with the bacterial second messenger c-di-GMP. PLoS One. 25, 1-12 (2011).
  7. Song, J. H., et al. Sublingual vaccination with influenza virus protects mice against lethal viral infection. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 1644-1649 (2008).
  8. Cogo, R., Ramponi, A., Scivoletto, G., Rippoli, R. Prophylaxis for acute exacerbations of chronic bronchitis using an antibacterial sublingual vaccine obtained through mechanical lysis: a clinical and pharmacoeconomic study. Acta Biomed. 74, 76-87 (2003).
  9. Rosaschino, F., Cattaneo, L. Strategies for optimizing compliance of paediatric patients for seasonal antibacterial vaccination with sublingually administered Polyvalent Mechanical Bacterial Lysates (PMBL). Acta Biomed. 75, 171-178 (2004).
  10. Senna, G., Caminati, M., Canonica, G. W. Safety and tolerability of sublingual immunotherapy in clinical trials and real life. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 13, 656-662 (2013).
  11. Mascarell, L., et al. Oral dendritic cells mediate antigen-specific tolerance by stimulating TH1 and regulatory CD4+ T cells. J Allergy Clin Immunol. 122, 603-609 (2008).
  12. Mascarell, L., et al. Mapping of the lingual immune system reveals the presence of both regulatory and effector CD4+ T cells. Clin Exp Allergy. 39, 1910-1919 (2009).
  13. Mascarell, L., et al. Oral macrophage-like cells play a key role in tolerance induction following sublingual immunotherapy of asthmatic mice. Mucosal Immunology. 4, 638-647 (2011).
  14. Hervouet, C., et al. Antigen-bearing dendritic cells from the sublingual mucosa recirculate to distant systemic lymphoid organs to prime mucosal CD8 T cells. Mucosal Immunology. 7, 280-291 (2014).
  15. Munoz, N., et al. Mucosal administration of flagellin protects mice from Streptococcus pneumoniae lung infection. Infect Immun. 78, 4226-4233 (2010).
  16. Hayashi, F., et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature. 410, 1099-1103 (2001).
  17. Lightfield, K. L., et al. Critical function for Naip5 in inflammasome activation by a conserved carboxy-terminal domain of flagellin. Nature Immunology. 9, 1171-1178 (2008).
  18. Lightfield, K. L., et al. Differential requirements for NAIP5 in activation of the NLRC4 inflammasome. Infect Immun. 79, 1606-1614 (2011).
  19. Honko, A. N., Mizel, S. B. Mucosal administration of flagellin induces innate immunity in the mouse lung. Infect Immun. 72, 6676-6679 (2004).
  20. Janot, L., et al. Radioresistant cells expressing TLR5 control the respiratory epithelium's innate immune responses to flagellin. Eur J Immunol. 39 (6), 1587-1596 (2009).
  21. Van Maele, L., et al. TLR5 signaling stimulates the innate production of IL-17 and IL-22 by CD3(neg)CD127+ immune cells in spleen and mucosa. J Immunol. 185, 1177-1185 (2010).
  22. Lee, S. J., et al. Neurologic adverse events following influenza A (H1N1) vaccinations in children. Pediatrics international: official journal of the Japan Pediatric Society. 54, 325-330 (2012).
  23. Lewis, D. J., et al. Transient facial nerve paralysis (Bell's palsy) following intranasal delivery of a genetically detoxified mutant of Escherichia coli heat labile toxin. PLoS One. 4, e6999(2009).
  24. Mutsch, M., et al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med. 350, 896-903 (2004).
  25. Kuo, C. H., Wang, W. L., Chu, Y. T., Lee, M. S., Hung, C. H. Sublingual immunotherapy in children: an updated review. Pediatr Neonatol. 50, 44-49 (2009).
  26. Nempont, C., Cavet, D., Rumbo, M., Bompard, C., Villeret, V., Sirard, J. C. Deletion of flagellin's hypervariable region abrogates antibody-mediated neutralization and systemic activation of TLR5-dependent immunity. J. Immunol. 181, 2036-2043 (2008).
  27. Pathogen Regulation Directorate, Public Health Agency of Canada . Streptococcus pneumoniae: Pathogen Safety Data Sheet - Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/lab-bio/res/psds-ftss/streptococcus-pneumoniae-eng.php (2011).
  28. Marques, J. M., et al. Protection against Streptococcus pneumoniae serotype 1 acute infection shows a signature of Th17- and IFN-gamma-mediated immunity. Immunobiology. 217, 420-429 (2012).
  29. Stewart, C. C., Stewart, S. J., et al. Titering antibodies. Current Protocols in Cytometry. 4, Unit 4.1(2001).
  30. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27, 95-125 (2006).
  31. Pedersen, G., Cox, R. The mucosal vaccine quandary: intranasal vs. sublingual immunization against influenza. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 8, 689-693 (2012).
  32. Vitaliti, G., et al. Mucosal immunity and sublingual immunotherapy in respiratory disorders. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 26, S85-S93 (2012).

Herprints en machtigingen

Tags

Pneumokokkenpneumoniemuismodelflowcytometriebronchoalveolaire lavagesingle cell suspensieStreptococcus pneumoniaeTLR agonistenimmuunresponsisolatie van lymfeklieren
Sublinguale immunotherapie als een alternatief voor bescherming tegen acute luchtwegeninfecties Induce
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.