We presenteren een werkwijze voor het bereiden mica ondersteunde lipide bilagen voor hoge resolutie microscopie. Mica is transparant en plat op atomaire schaal, maar zelden gebruikt in de beeldvorming als gevolg van de behandeling van problemen; onze voorbereiding leidt zelfs afzetting van het mica plaat, en vermindert de gebruikte bilaag bereiding materiaal.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van Mica Ondersteunde lipidendubbellagen voor hoge resolutie optische microscopie Imaging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ondersteunde lipidendubbellagen (SLBs) worden op grote schaal gebruikt als een model voor het bestuderen membraaneigenschappen (fasescheiding, clustering, dynamiek) en de interactie met andere verbindingen, zoals drugs of peptiden. Echter SLB kenmerken verschillen afhankelijk van de gebruikte drager.
Gewoonlijk gebruikte technieken voor SLB beeldvorming en metingen single molecule fluorescentie microscopie, FCS en atomic force microscopie (AFM). Omdat de meeste optische imaging studies worden uitgevoerd op een glazen drager, terwijl AFM vereist een uiterst vlakke ondergrond (meestal mica), de resultaten van deze technieken kan niet direct worden vergeleken, omdat de lading en gladheid eigenschappen van deze materialen sterk beïnvloeden diffusie. Helaas, de hoge mate van handvaardigheid vereist voor het snijden en verlijmen dunne plakjes van mica om het glaasje presenteert een hindernis om routinematig gebruik van mica voor SLB voorbereiding. Hoewel de voorkeursmethode, zoals bereid mica zouoppervlakken vaak uiteindelijk op een oneffen (golvend) en moeilijk om de afbeelding, met name met kleine werkafstand, hoge numerieke diafragma. Hier presenteren we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het bereiden van dunne, platte mica ondergrond voor lipide bolletjes depositie en SLB voorbereiding. Bovendien, onze op maat gemaakte kamer maakt slechts zeer kleine hoeveelheden van blaasjes voor SLB-vorming. De algemene procedure resulteert in een efficiënte, eenvoudige en goedkope productie van hoogwaardige lipide bilaag oppervlakken die rechtstreeks vergelijkbaar met die in AFM studies.
Inleiding
Het algemene doel van dit protocol is om een methode te laten zien voor het bereiden van mica oppervlakken voor hoge resolutie beeldvorming van mica ondersteund lipidendubbellagen (SLBs) met behulp van optische totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) of confocale microscopie, die ook kan worden gecombineerd met een atomic force microscopie (AFM).
SLBs is een veel gebruikt model voor talrijke studies van lipide clustering, fasescheiding, dynamiek bilaag componenten of hun interacties met peptiden, eiwitten of andere verbindingen 1-5. Verschillende substraten kunnen worden voor SLB samenstelling (bijvoorb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Mica en Slides Voorbereiding
- Plaats nummer 1 ½ (0.17 mm) coverslips in kleuring rack.
- Sonificeer 30 min in 2% detergent bij 60 ° C.
- Was 20 keer met gedemineraliseerd water.
- Dia's te verwijderen met een tang en föhnen met behulp van perslucht of stikstof.
- Snijd mica vel in 10 x 10 mm vierkante stukjes met een schaar of scheermesje.
- Snijd elke mica stuk in 2-3 dunnere folders behulp scheermesje.
OPMERKING: Deze stap vereist het gebruik van scherp mes.
2. Mica Montage en Chamber Montage
- Clean microscopische glasplaatje met ethanol.
- Lijm fold....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het diffusiegedrag van fluorescerende probes in lipide SLBs verschilt afhankelijk van de ondergrond. TIRFM gecombineerd met SMT techniek is een waardevolle werkwijze voor het visualiseren deeltje bewegingen en extraheren van de diffusiecoëfficiënten. Enkel molecuul signalen van een Sfingomyeline-ATTO647N probe verspreiden in een DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine) bilaag ondersteund op glas en mica worden op de bijgevoegde geanimeerde figuur. Het mica oppervlak werd bereid volgens het protocol hier ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden soepel en dun mica oppervlakken lipide bilaag depositie en hoge resolutie beeldvorming. De techniek vereist minimale handvaardigheid beperkt vooral de zorgvuldige demontage van de glas-mica-glas sandwich (stap 2.8), wat essentieel is voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit mica oppervlak. Inspectie van de vers gekloofd mica steeds vereist op dit punt, aangezien het mogelijk dat de mica los te maken van de optische lijm zonder splitsen, waardoor blootgestelde opt.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen bevestigingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | FB15051 | |
| Dekglasjes 24 x 50 mm - Geen H1.5 | Marienfeld | 102222 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850357 | |
| Hellmanex III (detergent) | Hellma Analytics | 320.003 | |
| Mica V-1 Grade | SPI Suppliers | 1872-CA | |
| Optische lijm (hoge viscositeit) | Norland Products | NOA63 | |
| Optische lijm (lage viscositeit) | Norland Products | NOA60 | |
| Sphingomyeline-ATTO647N | AttoTec | AD 647N-171 | |
| UV-lamp | Synoptics Ltd. | GelVue GVM20 | De lamp was ingesteld op 100% vermogen |
Referenties
- Giocondi, M. -C., et al. Surface topography of membrane domains. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Surface analysis of membrane dynamics. Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
