Methodenartikel

Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

DOI:

10.3791/52058

⸱

2 januari 2015

 ,  , 
1Abteilung Mikrobiologie, Fachbereich Biologie/Chemie, Universität Osnabrück

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TL-nanodeeltjes (NP) met de gewenste chemische, optische en mechanische eigenschappen zijn veelbelovend tools waarmee intracellulaire organellen te labelen. Hier introduceren we een methode met behulp van goud-BSA-rhodamine NP aan de endo-lysosomale systeem van eukaryote cellen te labelen en te monitoren manipulaties van gastheer cellulaire routes door de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica. De NP's waren direct geïnternaliseerd door HeLa-cellen en gelokaliseerd in de late endosomen / lysosomen. Salmonella-infectie veroorzaakte herschikking van de blaasjes en accumulatie van NP's in Salmonella geïnduceerde membraan structuren. We zetten de Imaris softwarepakket voor kwantitatieve analyses van confocale microscopie beelden. Het aantal objecten en hun grootteverdeling in niet-geïnfecteerde cellen werden verschillend van die in Salmonella geïnfecteerde cellen, wat aangeeft zeer remodelleren van de endo-lysosomale systeem WT Salmonella.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TL-nanodeeltjes (NP), inclusief metalen NP, quantum dots, polymeer NP, silica NP, koolstof stippen, enz., Hebben veel aandacht gekregen in de afgelopen decennia 1,2. Vergeleken met traditionele organische kleurstoffen, fluorescerende NP vertonen wenselijke chemische, optische en mechanische eigenschappen, zoals sterk signaal sterkte, weerstand tegen fotobleken en hoge biocompatibiliteit 3,4. Deze voordelen maken ze de methode van keuze voor intracellulaire sensing en live cell imaging. Verder is een groot aantal elektron-dichte NP's zijn zichtbaar door elektronenmicroscopie (EM), het gebruik ervan voor gecorreleerde microscopische analyse, welke combinatie van live-cell tracking met een lichtmicroscoop (LM) en hogere resolutie op Ultrastructureel met EM-5 kunt faciliteren. Zo hebben goud NP lange tijd efficiënt als biosensoren in levende cellen voor gevoelige diagnoses en op het gebied van immuno-labeling 6 geweest. Recente studies aan dat goud NPs met verschillende grootte en vorm gemakkelijk kan opname door diverse cellijnen en routinematig transporteren door de endosomale route, daarom groot potentiaal toegepast intracellulaire vesikel transport volgen en de endo-lysosomale systeem labeling 7,8 .

Microbiële ziekteverwekkers, zoals Salmonella enterica, Shigella flexneri en Listeria monocytogenes, hebben verschillende mechanismen ontwikkeld om niet-fagocyterende gastheercellen 9 binnenvallen. Na te zijn geïnternaliseerd, de ziekteverwekkers, ofwel gelokaliseerd in het cytosol of afgezonderd in membraangebonden compartimenten, interactie uitvoerig met hun gastheer omgevingen en moduleren deze om hun eigen overleving 10 bevoordelen. Bijvoorbeeld, Salmonella enterica woont en repliceert binnen een intracellulaire phagosomal compartiment aangeduid als de Salmonella bevattende vacuole (SCV) na infectie 11. De rijping SCVtrafieken naar het Golgi-apparaat, dat voortdurend interacties met de endocytische route en induceert vorming van grote buisvormige structuren zoals Salmonella geïnduceerde filamenten (SIF), sortering nexine tubuli, Salmonella geïnduceerde uitscheiding drager membraaneiwit 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Bestuderen hoe deze bacteriële ziekteverwekkers manipuleren gastheer-cel trajecten is essentieel om inzicht besmettelijke ziekte.

Hier werden goud-BSA-rhodamine NP als vloeistof tracers aan de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem label en de menselijke maag pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) werd gebruikt als model bacterie om de interacties van de pathogeen het bestuderen hosten endocytose. Intracellulaire gold-BSA-rhodamine NPs in niet-geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met WT of mutante Salmonella stammen werden afgebeeld door confocale laser scanning microscoop (CLSM).Vervolgens werd Imaris software waarmee de verdeling van NP kwantificeren, wat aangeeft dat Salmonella infectie veroorzaakte extreme herschikking van de endosomen / lysosomen. Na de beschrijving van deze werkwijze kan analoog experimenten ontworpen lot op lange termijn van de geïnternaliseerde NP te volgen en om de invloed van verschillende exogene stoffen of endogene factoren op de endocytische route van eukaryotische cellen te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synthese van 10 nm Gold Nanodeeltjes (Gold NP) 15

  1. Maak een oplossing A: voeg 2 ml 1% waterige goudchloride in 160 ml Milli-Q, of dubbel gedestilleerd water.
  2. Maak een oplossing B: voeg 8 ml 1% tri-natriumcitraat x 2 H 2 O en 160 pi 1% tannine in 32 ml Milli-Q, of dubbel gedestilleerd water.
  3. Warm oplossing A en B tot 60 ° C en mengen onder roeren. Observeer een donkerblauwe kleur onmiddellijk. Observeren rode kleur na ongeveer 15 minuten. Verwarmen daarna tot 95 ° C, houdt 5 min en koel de oplossing tot kamertemperatuur.
  4. Voeg een druppel van de NP suspensie op een rooster koolstof beklede en laten drogen aan de lucht. Controleer de grootte en morfologie van NP's door transmissie elektronenmicroscopie.

2. Coating van Gold NP's met BSA en Labeling met Rhodamine N-hydroxysuccinimidylester (NHS) 16

  1. Voeg 900 ul goud NP in een 1,5 ml Eppendorf buis centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min. Opnaal, bereiden meerdere buizen kunnen in een keer.
  2. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 900 ul gesteriliseerd Milli-Q water en voeg 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, mengen op een Vortex bij 800 rpm gedurende 30 min.
  3. Om overtollig BSA verwijderen, centrifuge de voorbereiding bij 15.000 xg gedurende 60 min.
  4. Verwijder het supernatant, en opnieuw op te schorten de goud-BSA NP's in 125 pi PBS, voeg 12,5 ul van 1 M bicarbonaat.
  5. Onmiddellijk vóór gebruik bereid een 10 mg / ml oplossing van rhodamine NHS / DMSO, voeg 30 ul van rhodamine NHS / DMSO oplossing 1 ml van de goud-BSA NP suspensie. Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur (of O / N) bij kamertemperatuur gedurende 800 tpm mengen, vermijden van blootstelling aan licht.
  6. Zuiveren het goud-BSA-rhodamine NP's door dialyse tegen PBS bij 4 ° C met 5 buffer veranderingen in de periode van 36-48 uur.
  7. Om NP stabiliseren, voeg 10 ul 200 mg / ml BSA / PBS in elk 1 ml gold-BSA-rhodamine NP. Om het gratis of vrijgegeven BSA-rhodamine, centrifuge bij 15 te verwijderen,000 xg gedurende 60 min. Resuspendeer de pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, gemeten OD 520 en bewaar bij 4 ° C, vermijden van blootstelling aan licht.
  8. Verdunnen de NPS 10 keer met Milli-Q of dubbel gedestilleerd water, voeg een druppel op een koolstof beklede raster, en laten drogen aan de lucht. Controleer de grootte en morfologie van NP's door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
    Opmerking: Alle materialen die voor NP bereiding werden gesteriliseerd en de operatie werd uitgevoerd in een celkweek kap of op een bank naast een vlam.

3. Culture of HeLa Cells

  1. HeLa-cellen permanent expressie LAMP1-GFP gekweekt in DMEM met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en gekweekt bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO2.
  2. Zaad de cellen bij een dichtheid van 50.000 per putje in een 8-well kamer schuif (IBIDI) en geïncubeerd O / N.

4. Cultuur van Bacteriën

  1. Gebruik Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT) stam. Ter vergelijking, gebruiken mutantstammen Δ ssaV defect in de SPI2-T3SS en Δ Sifa ontbreekt belangrijke effector Sifa voor SIF. Gebruik stammen die plasmide pFPV25.1 voor constitutieve expressie van verbeterde GFP.
    OPMERKING: Bacteriële stammen worden routinematig gekweekt in Luria-Bertani bouillon (LB) met toevoeging van 50 ug / ml carbenicilline (WT) en LB met toevoeging van 50 ug / ml carbenicilline en / of 50 ug / ml kanamycine (Δ ssaV, Δ SIFA ) van de vereiste plasmiden te handhaven.
  2. Inoculeer een enkele kolonie van bacteriën in 3 ml LB met geschikte antibiotica en te groeien O / N bij 37 ° C onder schudden voorwaarden voor beluchting, dan verdunnen 1:31 in vers LB en verder groei van 3,5 uur. Op dit moment-point, de culturen bereikt de late log-fase en bacteriën zijn zeer invasieve. Een 'roller drum' is handig om reageerbuis culturen incubeer met beluchting.

5. Infectie van HeLa cellen doorSalmonella en Gold-BSA-Rhodamine NP Pulse Chase-etikettering (zie figuur 1 voor de regeling)

  1. Meet OD 600 van de sub-gekweekte bacteriën en verdun tot OD 600 = 0,2 in 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 kve / ml), voeg juiste hoeveelheden bacteriën om HeLa-cellen in 8-goed kamer dia's een veelvoud van bereiken infectie (MOI) van 100.
  2. Incubeer gedurende 30 min in celincubator, was 3 maal met PBS om niet-geïnternaliseerde bacteriën te verwijderen (dit tijdstip is ingesteld op 0 uur na infectie of 0 uur pi). Voeg 300 ul vers kweekmedium dat 100 ug / ml gentamicine en handhaven gedurende 1 uur. Plaats vervolgens het medium met vers medium dat 10 ug / ml gentamicine voor de rest van de incubatietijd.
  3. Na incubatie met kweekmedium dat 100 ug / ml gentamicine gedurende 1 uur wordt het medium vervangen door beeldmedium (Eagles MEM zonder FCS, L-glutamine, fenolrood en natriumbicarbonaat, met 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml gentamicine. Goud-BSA-rhodamine NP toegevoegd aan HeLa-cellen tot een uiteindelijke concentratie van OD 520 = 0,1 verkregen.
    OPMERKING: Gold-BSA-rhodamine NPs kunnen ook worden toegevoegd aan de cellen voordat infectie, of op verschillende tijdstippen pi
  4. Na 1 uur incubatie, verwijder het medium was 3 maal met PBS en voeg 300 ul vers beeldvormende medium dat 10% FCS en 10 ug / ml gentamicine voor de rest van de incubatietijd.
    OPMERKING: Duur van de incubatietijd kan variëren naargelang van de concentratie van de NP en cellijnen gebruikt. Voor RAW264.7 macrofagen, waargenomen dat 30 min incubatie met NP in een concentratie van OD 520 = 0,05 toegelaten voldoende internalisatie.

6. Imaging

  1. Gebruik een confocale beeldvormingssysteem zoals een confocale laser-scanning (CLSM) of draaiende schijf (SD) microscoop met een vochtige omgeving kamer voor hoge resolutie beeldvorming op verschillende tijdstippen.
  2. Schakel de temperatuur control systeem en wacht tot hij is stabiel. Optimaliseer de imaging-instellingen, zoals vergroting, scansnelheid, resolutie, Z-stack etc. Gebruik de juiste excitatie / emissie-instellingen voor GFP en goud-BSA-rhodamine NP. Voor dit protocol, gebruik maken van een 400 Hz scanning snelheid, resolutie van 512 x 512 pixels en Z-stapgrootte van 0,25 micrometer. Excite GFP en goud-BSA-rhodamine met een Ar laser (488 nm) en een HeNe laser (543 nm), respectievelijk. Neem een ​​helder-veld (BF) kanaal voor het waarnemen van de vorm van de cellen. Voor andere microscopie systemen en infectie voorwaarden, de instelling moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
    OPMERKING: Gebruik dezelfde Ar laser als lichtbron van BF-kanaal en het signaal werd gedetecteerd met een foto multiplier (PMT) detector.
  3. Bij bepaalde tijdstippen pi, monteer de 8-well kamer dia's met besmette cellen op de microscoop podium en beelden opnemen.

7. Analyse van Beelden

  1. Gebruik microscopie beeldanalyse software (zie Materialen en uitrusting's Table) op de verbouwing van de endo-lysosomale systeem te analyseren door intracellulaire Salmonella. Open de gegevens door te klikken op 'Open' en het kiezen van het bestand.
    OPMERKING: Als alternatief kan open source software pakketten zoals ImageJ of FIDJI gebruikt worden om kwantitatieve afbeelding analyses.
  2. In de objecten werkbalk van de klik Overtref uitzicht op het icoon figure-protocol-1 om een ​​nieuw oppervlak item wilt toevoegen. Klik op figure-protocol-2 (Next).
  3. Om een ​​Regio of Interest (ROI), selecteert segment een ROI te analyseren. In een weergavegebied, wordt een rechthoek begrensd gedeelte overlay op afbeelding van de ROI. Voer de waarden in de overeenkomstige X-, Y- en Z-velden, of klik direct op de pijlen in de voorvertoning rechthoek om de grootte en de positie van de ROI te wijzigen. Klik vervolgens op figure-protocol-3 = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (volgende).
  4. Als bron kanaal, selecteert u Kanaal 3 (signaal voor Gold-BSA-Rhodamine NP). Controleer de goede optie om de gladheid van de resulterende gebied. Definieer een waarde handmatig of accepteer de automatisch gegenereerde waarde. Voor Drempel selecteert u de Absolute Intensity optie.
  5. Voor de drempel aanpassing, selecteert u de handmatige optie en stel een waarde. In het weergavegebied, wordt een oppervlak drempel voorvertoning in het grijs weergegeven.
  6. Op het tabblad classificeren Surfaces de resulterende oppervlak kan worden gefilterd door verschillende criteria. Een standaard filter is 'aantal voxels> 10', en andere filters kunnen ook opgenomen worden door te klikken op 'toevoegen'. Als een filtering niet nodig is en verwijder vervolgens alle filters door te klikken op de knop verwijderen. Klik figure-protocol-4 (Next).
  7. Tot het scheppen van Surface voltooien, klikt u op/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). In de lijst Object, nu het vinkje uit het vakje voor het item Volume en nieuwe aangemaakt oppervlak wordt weergegeven in het bekijken gebied.
  8. De statistieken exporteren. Nu, in het overtreffen oog de kleur van de proefpersonen varieert van paars naar rood naar hun omgeving. En de 'Plot Numbers Area' tabel toont de statistieken informatie (bijvoorbeeld, ID-nummer en het gebied van objecten). Alle statistieken van het oppervlak 1 exporteren naar een Excel-bestand door te klikken op figure-protocol-5 (Save).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goud NP werden gegenereerd door een bekende methode om via vermindering chlorogoudzuur door citraat en looizuur. Zoals getoond in figuur 2A, de gesynthetiseerde goud NPs waren quasi-bolvormig met een grootte van ongeveer 10 nm. BSA-coating en rhodamine-etikettering leverde hun morfologie of grootte (Figuur 2B) niet beïnvloeden.

Vermeld is dat goud NP gemakkelijk kunnen worden opgenomen door verschillende zoogdiercellen en uiteindelijk in de endocytische syst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De endo-lysosomale systeem van zoogdiercellen controleert belangrijke fysiologische processen, waaronder de opname van voedingsstoffen, hormoon-gemedieerde signaaltransductie, immuunsurveillance, en antigeen presentatie 17. Tot nu verschillende merkers zijn gebruikt voor het labelen van de endocytische route en tracking studies. Bijvoorbeeld, Lysotracker probes acidotropic fluorescerende probes ontwikkeld door Molecular Probes (Life Technologies, USA) lysosoom etikettering, die selectief kan ophopen in cellul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten zijn verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft door subsidie Z binnen Sonderforschungsbereich 944 ‘Fysiologie en Dynamica van Cellulaire Microcompartimenten’ en HE1964/18 binnen het prioriteitsprogramma 1580.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gold chlorideSigma-Aldrich520918
TanninezuurSigma-Aldrich403040
Tri-natriumcitraatSigmaC8532
Bovine serumalbumineSigmaA2153
NHS-RhodaminePierce46406
DMSOSigmaD8418
HEPESSigmaH3375
GentamicineApplichemA1492
KanamycineRothT832
CarbenicillineRoth6344
8-well kamer slidesIbidi80826voor weefselkweek behandeld, steriel
Imaris SoftwareBitplaneversie 7.6diverse configuraties beschikbaar

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125(2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. , (2007).
  18. LysoTracker and LysoSensor Probes. , Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Salmonellainfectieconfocale microscopiegoud BSA nanodeeltjesHeLa cellenvesicle remodelleringbeeldanalysenanodeeltjeslabeling

Gerelateerde artikelen