Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

Samenvatting

Plaque-assays zijn de gouden standaard voor virale kwantificering, waarbij overdekken met gevangenisoverlagen op hostcellulaire monolagen worden gebruikt om virale titers te bepalen. Hoewel traditioneel verschillende semi-solide overlagen zijn gebruikt, tonen we hier plaque-technieken die semi-solide overlagen vergelijken met een nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose onder verschillende families van virussen.

Samenvatting

Plaque assays blijven één van de meest accurate methode voor directe kwantificering van infectieuze vironen en antivirale stoffen door het tellen van afzonderlijke plaques (infectieuze eenheden en cellulaire dode zones) in celcultuur. Hier laten we zien hoe een eenvoudige plaque assay uitgevoerd en hoe uiteenlopende overlays en technieken kunnen beïnvloeden plaquevorming en productie. Typisch vaste of halfvaste overlay substraten, zoals agarose of carboxymethylcellulose zijn gebruikt om virale verspreiding te beperken, voorkomen willekeurige besmetting door het vloeibare groeimedium. Geïmmobiliseerd overlays beperken cellulaire infectie aan de direct omliggende monolaag, waardoor de vorming van discrete telbare brandpunten en de daaropvolgende vorming van tandplak. Om de problemen die inherent zijn aan traditionele overlays overwinnen, heeft een nieuw vloeibaar overlay gebruikmaking microkristallijne cellulose en carboxymethylcellulose natrium steeds meer gebruikt als een vervanger in de normplaque assay. Liquid overlay plaque assays kan gemakkelijk worden uitgevoerd in een van beide standaard 6 of 12 wells plaat formaten per traditionele technieken en vereisen geen speciale apparatuur. Door zijn vloeibare toestand en vervolgens gemakkelijk aanbrengen en verwijderen, kan microkweek plaatformaten ook worden gebruikt als een snelle, accurate en high throughput alternatief voor grootschalige virale titraties. Het gebruik van een niet-verwarmde viskeuze vloeistof polymeer biedt de mogelijkheid om werk te stroomlijnen, conserveert reagentia, incubator ruimte, en verhoogt de operationele veiligheid bij gebruik in traditionele of high containment labs als geen reagensverwarmingssysteem of glaswerk zijn vereist. Liquid overlays kan ook blijken gevoeliger dan traditionele overlays voor bepaalde hitte labiel virussen.

Inleiding

De accurate isolatie en kwantificering van levensvatbare virale monsters heeft consequent geweest van een lopend onderzoek doel in virologie. Het was niet tot de komst van de plaque-test in 1952, dat een middel om kwantitatief en kwalitatief te berekenen dierlijke virale titers werd voor het eerst ontwikkeld ^1,2. Deze techniek werd voor het eerst aangepast en gewijzigd uit faag assays, die eerder was gebruikt om titers voorraad bacteriofagen berekenen in plant biology ^1,2. Terwijl alternatieve middelen voor virale kwantificering zijn inmiddels ontwikkeld en aangepast, zoals immunoassays, fluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie, afstembare resistieve puls sensing (TRPS), flowcytometrie, recombinant reportersystemen en kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) , deze methoden niet replicatiecompetente vironen ^1,3 identificeren en te kwantificeren. Terwijl de vooruitgang in technologieën en technieken verder te verfijnen en het landschap te veranderen; plaque assays steeds de gouden standaard vertegenwoordigen bepalen virale lytische concentraties infectieuze vironen ^1,4.

Tijdens een plaque assay is een confluente monolaag van gastheercellen geïnfecteerd met een lytisch virus van een onbekende concentratie die werd serieel verdund tot een telbare bereik, typisch tussen 5-100 virions. Geïnfecteerde monolagen worden vervolgens bedekt met een overlay immobiliserende medium te voorkomen virale infectie willekeurig verspreid door zowel de mechanische of convectional stroming van het vloeibare medium bij virale propagatie. Hoewel vaste of halfvaste Bekleding zoals agarose, methylcellulose en carboxymethylcellulose (CMC) van oudsher gebruikt, zijn vloeibare bekledingen steeds aantrekkelijk alternatief met de ontwikkeling van nieuwe vloeibare bekledingen worden bijvoorbeeld Avicel ^{5- 7.} Plaque assays met behulp van vloeibare versus traditionele overlays hebben een aantal voordelen zoals de overlay kan applied bij kamertemperatuur en toepassing en verwijdering aanzienlijk eenvoudiger. Als vloeibare overlays geen opwarming vereist, kan delicate en warmte labiel virussen ook blijken makkelijker te plaque.

Na de eerste infectie en toepassing van het immobiliserende overlay individuele plaques of zones van celdood, zal beginnen te ontwikkelen virale infectie en replicatie beperkt zijn tot de omringende monolaag. Geïnfecteerde cellen de replicatie-lysis-infectiecyclus voortgezet verder verspreiding van de infectie, resulterend in steeds verschillende en discrete plaques. Afhankelijk van de virale groeikinetiek en gastheercel wordt een zichtbare plaque vormen normaal binnen 2-14 dagen. Cellulaire monolagen kan dan worden geteld met een standaard helderveld microscoop of typischer gefixeerd en tegengekleurd met neutraal rood of kristal gewelddadige om gemakkelijk plaques identificeren met het blote oog. Er is een grote verscheidenheid van plaque tegen vlekken voorzien, elk met their specifieke voor- en nadelen. Kristalviolet wordt kenmerkend toegevoegd op het verzamelpunt en na de fixatie / verwijdering van de bekleding, die een snelle en duidelijke teller vlek die zorgt voor de identificatie van kleine plaques wanneer gemengd morfologie aanwezig is. Neutraal rood heeft het voordeel van vroegtijdige toepassing en voortdurend contact met de overlay, waardoor de levende bewaking ontwikkelen plaquevorming, wat vooral nuttig bij het werken met een onbekend virus of replicatie kinetiek. Wij hebben echter ontdekt dat vlekken is meestal niet als onderscheiden bij het gebruik van neutraal rood. 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) biedt verschillende voordelen, zoals de gele kleurstof vlekken levende cellen donkerblauw en virale plaques te tellen zonder verwijdering van de overlay met neutraal rood. Het hoge contrast tussen levende en dode cellen wordt geboden door MTT maakt ook de detectie van kleine plaques op een eerder tijdstip na infectieHoewel opslag nog verwijdering van de overlay ⁸ vereist. Als kristal violet eenvoudig worden gemaakt in een oplossing van water en alcohol, en zorgt voor een hoge mate van gevoeligheid voor gemengd plaque morfologie, hebben we gekozen als geprefereerde en vereenvoudigde teller kleuring voor het protocol aangetoond dat we gebruik meerdere families goed gekarakteriseerde virussen.

Na de vaststelling van en het kleuren van de geïnfecteerde cel monolaag, worden plaques geteld om virale voorraadmonsters titreren in termen van plaque-vormende eenheden (pve) per milliliter. Een log druppel opgemerkt tussen seriële verdunningen en afhankelijk plaatformaat tussen 5-100 plaques geteld, met een negatieve controle gebruikt als referentie. Statistisch monsters zullen variëren met 10% voor elke 100 plaques geteld bij het ​​vergelijken van sample repliceert ^3. Het voordeel van plaque assays voor virale titers vast ligt in hun vermogen om het werkelijke aantal infectieuze virusdeeltjes kwantificeren wedurende het monster. Als meerdere virusdeeltjes zou kunnen infecteren van een enkele cel, wordt de terminologie van eenheden versus vironen gebruikt tijdens plaque titraties ^1,2.

Plaque morfologie kan variëren sterk onder verschillende groeiomstandigheden en tussen virale soorten. Plaque grootte, helderheid, grens definitie en distributie moet worden opgemerkt zij waardevolle gegevens over de groei en virulentie factoren van het virus in kwestie verschaffen.

Basic plaque assay principes kunnen worden aangepast en gemodificeerd op een aantal verschillende manieren, zoals het gebruik focus vormende assays (FFA). FFAs vertrouw niet op cellysis en tegenkleuring om plaquevorming te detecteren, maar eerder in dienst immunokleuren technieken om intracellulaire virale eiwitten direct te detecteren door middel van tag antilichamen. Verhoogde gevoeligheid, verlaagd incubatietijden na infectie, en vooral de mogelijkheid kwantificeerbaar niet-lytische virussen allemaal verschillendvoordelen bij toepassing FFA. Alom gebruikte, de kritische beperkende factoren in FFA versus een traditionele plaque assay ligt in de noodzaak van passende antilichamen en het vermogen om enige probe virale eiwit subeenheden en werkelijke infectieuze vironen ^4.

Voor het doel van deze studie, zullen we onze discussie beperken tot de klassieke plaque assays en beschrijven het gebruik van traditionele solide en halfvaste overlays (agarose en CMC), samen met nieuwe vloeistof microkristallijne cellulose overlays.

Protocol

1. Bereiding van Cellen en reagentia

1. De dag voor de test plaat geschikte gastheercellen voor het virus betrokken (tabel 1 en 2) bij 90-100% confluentie.
2. Bereid bevestiging oplossing van 10% formaldehyde in dH ₂ O. Bij voorbeeld, meng 5,56 ml van 36% voorraad formaldehyde met 14,44 ml gedestilleerd _H2 O (dH ₂ O).
   OPMERKING: Gebruik de juiste veilige werkmethoden en ventilatie bij het gebruik van formaldehyde.
3. Bereid crystal violet vlek: 1% Crystal Violet (CV) in 20% ethanol en dH ₂ O.
4. Bereid 2x plaque media (celtype afhankelijk 2x concentratie; zie tabel 2). Filteren met behulp van een 0,2 um filter eventuele reagentia zijn niet steriel.
5. Bereiding van geïmmobiliseerd overlays (tabel 3)
   1. Voor vloeibare overlays, maak een steriele 2,4% oplossing van Avicel in dH ₂ O. Om klonteren te voorkomen, het poeder toevoegen aan een kolf die water thbij wordt snel mengen met een roerstaafje, giet Avicel in langzaam en roer snel bij kamertemperatuur (RT). Wanneer de oplossing blijkt te stroperig voor een roerstaafje te homogeniseren, schakelen naar een fles shaker voor> 30 min met zware agitatie om nog homogenisering verzekeren.
      Opmerking: De oplossingen kunnen worden bij lagere concentraties, maar de oplossing kan gescheiden en moet opnieuw worden gemengd tot homogenisatie garanderen. Werkoplossingen Avicel kunnen worden gaande 0,6-3%.
   2. Na homogenisatie autoclaaf de oplossing en bewaar afgedicht bij KT.
   3. Voor agarose en carboxymethylcellulose (CMC) overlays, bereiden een stockoplossing in dH ₂ O 2% CMC of 0,6% agarose. Meng met een roerstaafje en autoclaaf of magnetron in oplossing te brengen.

2. Verdunningen en Infecties

1. De dag na plating, visueel de confluentie en levensvatbaarheid van de cellen voorafgaand aan het starten van de test. Zorgen voor standaard cellulaire morfologie eennd een ~ 90% confluent monolaag is aanwezig.
2. Voer een tienvoudige seriële verdunning van de besmettelijke monsters. Gebruik de cellulaire groeimedia voor virale propagatie als verdunningsmiddel (Tabel 2). Varieert het aantal benodigde verdunningen op basis van de verwachte titer van het virus betrokken, en altijd een geïnfecteerde controlemonster om zelfstandig waarborgen cellulaire levensvatbaarheid en steun plaque identificatie.
3. Van de seriële verdunningen, infecteren de cellen gedurende 45 min tot 1 uur (Tabel 1). Gebruik een voldoende hoeveelheid inoculum dekking van de cellen, terwijl het volume zo laag mogelijk virale contact met de monolaag (tabel 4) te maximaliseren. Zachtjes rots platen om de 20 min om te verzekeren gelijkmatige dekking en het voorkomen van de cellulaire monolaag uitdroogt.
4. Na de infectie, overlay een geschikt volume immobiliseren medium direct naar inocula in de put (tabel 2) met een 1: 1 mengsel van 2 x plaque media en de immobilizing overlay keuze (CMC, agarose of Avicel). Schud om te mengen.
   1. Voor vloeibare overlays, meng 1: 1 met verwarmd 2x plaque media en 1,2-2,4% RT voorraad Avicel om een ​​werkende oplossing van 0,6-1,2% Avicel overlay medium te verkrijgen.
   2. Voor een agarose overlay gebruikt een 1: 1 mengsel van verwarmd 2x plaque media en een voorraadoplossing van verwarmde 0.6% agarose af in een 56 ° C waterbad gedurende 30 minuten om de temperatuur verkrijgen van een uiteindelijke agarose / overlay concentratie van 0,3 equilibreren %.
   3. Voor CMC Bereid een 2% voorraadoplossing en behandeld zoals beschreven voor de agarose overlay.
   4. Bij toepassing van de overlay de monolaag, altijd in evenwicht hete agarose of CMC in een 56 ° C water om schade aan de monolaag te voorkomen. Zorg ervoor dat de oplossing is warm, maar niet heet om aan te raken tot celdood en verminderde virale titers voorkomen. Meest agarose overlays zal beginnen te stollen onder 42 ° C, snel te werken en / of te bereiden kleine partijen om stolling te voorkomen tijdens het hanteren.
5. Na toevoeging van de overlay, incubeer platen afzonderlijke plaques die duidelijk telbare produceren. Plakvorming kunnen nemen 2-14 dagen afhankelijk van de virus geanalyseerd, tabel 1.
   OPMERKING: Zodra vloeistof bedekt platen in de incubator worden geplaatst, mag u ze niet bewegen. Beweging van de vloeistof overlays gedurende de incubatieperiode zal resulteren in vlekkerig plaques. Agarose en CMC overlays zijn halfvaste en kan worden verplaatst of periodiek gecontroleerd onder een lichtmicroscoop te plaque ontwikkeling te monitoren.

3. Vaststelling en kleurende cellen

1. Om de cellen te repareren, giet af of zuig het Avicel overlay, en zet de cellen met behulp van de 10% formaldehyde-oplossing gedurende 30 minuten tot de volgende ochtend (<1 ml per putje voor een 6 wells plaat).
   1. Voor agarose of CMC, direct de formaldehyde oplossing voor de overlay toevoegen 1 uur overnacht.
      OPMERKING: Monsters kunnen gedurende langere tijd worden bewaard in het fixeermiddel verschaft doetniet verdampen en uitdrogen, omdat dit de monolaag kan vervormen.
2. Voorafgaand aan kleuring na fixatie, gooi de formaldehyde en verwijder de halfvaste pluggen voor de agarose en CMC met ofwel stromend water of handmatig met een spatel. Spoel Avicel plaques met water om de resterende overlay / fixatief voorafgaand aan vlekken te verwijderen.
3. Voor kleuring, bedekken de cellen met een minimale hoeveelheid kristalvioletoplossing ~ 15 min. Rock platen indien nodig zelfs dekking te garanderen.
4. Wassen zachtjes het kristal violet vlek met water. Eenmaal gefixeerd, gekleurd en gedroogd, winkel plaques voor onbepaalde tijd voor toekomstige analyse.

4. Bepalen Virale titers

1. Tel de plaques in elk putje, waarbij het gemiddelde voor elk technisch herhalingen van dezelfde verdunning. Voor grote plaat formaten, korting putten met minder dan 5 of groter dan 100 plaques. Kennis te nemen van plaque grootte en morfologie. De negatieve controle moet uniform monolaag hebben enkan worden gebruikt als een referentie controle.
2. Bepaal de virale titer van de voorraad monster door het gemiddelde aantal plaques voor verdunning en de inverse van de totale verdunningsfactor.

Opmerking: Als voorbeeld, 30 en 32 plaques geteld herhalingen van de 1 x 10 ^-7 verdunning [31 (gemiddeld) / 10 ^-7 (verdunning) x 0,4 ml (inoculum)] zou een titer van 7,75 verkregen x 10 ⁸ pfu / ml.

Resultaten

Het vermogen van plaque assays virale titers nauwkeurig te beoordelen steunt op talrijke factoren: geschikte gastheercel selectie, goede media en groeiomstandigheden voor cellulaire en virale levensvatbaarheid geïmmobiliseerd virale propagatie en een nauwkeurige bepaling van de virale incubatieperiode om voldoende verschillende toestaan en telbare plaquevorming.

Voor deze studie werden virussen van drie representatieve families gekozen verschillen tonen: overlay selectie, incubatietijd en plaque morfologie in verschillende soorten monsters. Venezolaans Equine Encefalitis (VEEV) werd geselecteerd als (+) ssRNA virale model dat significante ziekte in paarden en mensen kunnen veroorzaken, en vertegenwoordigt de familie Togaviridae. Influenza B Taiwan stam, een gesegmenteerd (-) ssRNA virus voornamelijk infecteert mensen, vertegenwoordigt de familie Orthomyxoviridae. Rift Valley fever virus (RVFV), een (-) ssRNA geleedpotigen geboren virus voornamelijk infecteren geleedpotigen,herkauwers en mensen, werd geselecteerd als een vertegenwoordiger van de familie Bunyaviridae.

Voor RVFV (figuur 1), werden titers bepaald uit een voorraadoplossing van een recombinant levend verzwakte stam MP12 van RVFV in een 12 well plaat formaat gebruik CMC, agarose of Avicel bekledingen die zijn geïncubeerd side-by-side voor 72 uur na infectie (HPI). Een representatieve plaat toont verdunningen variërend van 10 ^-4 tot 10 ^-7 te zien in paneel A. Plaques met CMC en agarose overlays vertoonden kleine, heldere en duidelijke plaques met een goed gedefinieerde cirkelgrens. Plaques met een vloeistof overlay waren iets meer overvloedig en groter in vergelijking met agarose en CMC plaques, en gaven een minder duidelijke grens. Virale titers werden vergeleken in paneel B met alle overlays uitvoeren vergelijkbaar.

Om een ​​duidelijker visuele vergelijking tussen overlays voor MP12 samen met een grotere steekproef te reproduc bepalen verkrijgenbaarheid, een plaat met 6 putjes werd uitgetest in drievoud (figuur 2). In de plaat met 6 putjes format, het gebruik van een CMC overlay toonde plaques kleiner dan hetzij agarose of vloeibare bekledingen, die in omvang vergelijkbaar met elkaar zijn. Hoewel virale titers waren vergelijkbaar tussen de drie overlays (Panel D), plaques gevormd in agarose en vloeibare overlays bleken kan worden gerekend vanwege hun toegenomen omvang.

In tegenstelling RVFV, VEEV titers en plaque morfologie tussen de verschillende overlays varieerde sterk (figuur 3A). Gevormde plaques in CMC overlays toonden een heldere en duidelijke morfologie bij gebruik van een 12 well plaat formaat, ten koste van plaque grootte en gevoeligheid (Panel B). In tegenstelling tot CMC, het gebruik van agarose en vloeibare bekledingen in significant grotere plaques, wat aangeeft lagere virale remming en verhoogde gevoeligheid voor VEEV replicatie. Dit werd eerder bevestigd toen alleen het vergelijken van agarose versus CMC in apaper gepubliceerd door Juarez et al. ^4. Terwijl agarose en vloeibare overlays geproduceerd grotere plaques dan CMC, had de plaques slecht gedefinieerde grenzen en waren moeilijk te tellen in een 12 well formaat, met vloeibare overlays verstrekken van de grootste grens diffusie. Wanneer plaques werden uitgetest in 6 well platen (figuur 4), de grotere 6 putjes ontkend de afgifte van openlijk grote plaques die moeilijk te onderscheiden in de 12 putjes waren met agarose en vloeibare overlays bewijzen boven de CMC overlays qua plaque definitie en met gevoel (Figuur 4D).

In vergelijking met RVFV of VEEV, influenza allerlei unieke uitdagingen bij plaquing, zoals het vereiste van een externe protease. De gevoeligheid van influenzavirus verschillende overlay selecties is ook goed gedocumenteerd in het verleden belangrijke wijzigingen zijn opgemerkt bij wijzigingen zo gering als verschillende merken van agarose te hebbenen gebruikt ^9.

Interessant voor de Influenza B Taiwan stam, het gebruik van CMC als overlay resulteerde in aanzienlijk kleinere plaques die moeilijk te tellen waren en bleek moeilijk betrouwbaar te scoren (Figuur 5A). Het gebruik van een agarose overlay verschaft de beste plaques (Panel C) en resulteerde in een donkere achtergrond kleuring (waarschijnlijk door verhoogde levensvatbaarheid monolaag) en liet duidelijkere en scherper plaques in directe vergelijking met het gebruik van de vloeibare bekleding (Panel B ).

Een duidelijk voordeel van vloeibare polymeren in vaste en halfvaste overlays, zoals agarose en CMC, ligt in het gemak van verwijdering en toepassing. Halfvaste overlays nodig verwarming, en stolling kan problematisch blijken bij het hanteren en het verwijderen. Om te profiteren van deze voordelen en aan de uitvoerbaarheid van het gebruik van Avicel in een high-throughput manier voor RVFV bepalen, werd een 96 well plaat formaat uitgetest op verschillende overlay concentratiuitbreidingen (Figuur 6). Voor RVFV MP-12, werden verdunningen uitgevoerd in viervoud zowel 0,6 en 1,2% eindconcentraties van Avicel. Overlay aanbrengen en verwijderen bewezen eenvoudige, zonder duidelijke verschillen tussen replicaten of tussen concentraties opgemerkt blijk van een hoge mate van reproduceerbaarheid. Bij het scoren, plaques werden gescheiden en telbare het blote oog laten de haalbaarheid zien van het gebruik van vloeibare bekledingen op een high throughput wijze voor RVFV.

Figuur 1:. RVFV plaque overlay vergelijkingen gebruik 12 putjes Veros werden uitgeplaat bij 2,5 x 10 ⁵ cellen in platen met 12 putjes en geïnfecteerd met 200 ul met hetzelfde serieel verdund vanaf monster MP12. Na infectie 1,5 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC (final concentrations), werden toegepast om de overlays directe vergelijking zoals getoond in paneel A. plaques werden geteld en getitreerd in paneel B.

Figuur 2:. RVFV plaque overlay vergelijkingen behulp 6 putjes Veros werden met 5 x 10 ⁵ cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 ul met hetzelfde serieel verdund vanaf monster MP12. Drie ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC, werd toegepast om de overlays directe vergelijking zoals getoond in paneel A, werden B en C. Afzonderlijke experimenten uitgevoerd identiek zoals beschreven voor Panelen AC, met plaques geteld en getitreerd in paneel D (N = 3).

Figuur 3: VEEV plaque overlay vergelijkingen gebruik 12 putjes. Veros werden uitgeplaat bij 2,5 x 10 ⁵ cellen in platen met 12 putjes en geïnfecteerd met 200 ul met hetzelfde serieel verdunde monster starten van de VEEV TC-83 vaccinstam. Na infectie van 1,5 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC, werd toegepast om de overlays directe vergelijking zoals getoond in paneel A. plaques werden geteld en getitreerd in paneel B.

Figuur 4:. V EEV plaque overlay vergelijkingen behulp 6 putjes Veros werden met 5 x 10 ⁵ cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 ul met hetzelfde serieel verdund vanaf monster VEEV TC-83. Na infectie, 3 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC, werd toegepast om de overlays rechtstreeks te vergelijken zoals aangetoondin panelen A, B en C werden aparte experimenten uitgevoerd identiek zoals beschreven voor Panelen A - C, met plaques geteld en getitreerd in paneel D (N = 3).

Figuur 5: Influenza plaque overlay vergelijkingen MDCK-cellen werden met 5 x 10 ⁵ cellen in platen met 6 putjes en geïnfecteerd met 400 ul inoculum met dezelfde serieel verdunde monster starten van Influenza B Taiwan.. Geen foetaal runderserum (FBS) werd gebruikt in de groeimedia of bekledingen, zoals FBS Influenza voortplanting kunnen remmen door remming van bepaalde proteasen die nodig zijn voor virale fusie. TPCK-trypsine om alle overlays voor aanbrengen toegevoegd om virale fusie en toegang met de gastheercellen vergemakkelijken. Na infectie werden 3 ml overlays van 0,3% agarose, 0,6% Avicel, of 1% CMC om direct vergelijken toegepastde overlays zoals aangetoond in paneel A, B en C. Afzonderlijke experimenten werden uitgevoerd identiek zoals beschreven in Panels A - C, met plaques geteld en getitreerd in paneel D (N = 3). Terwijl een gemiddelde werd genomen voor CMC plaques ze bleken niet betrouwbaar te tellen als ze aangetoond diffuse grenzen en zeer kleine plaquette maten.

Figuur 6:. High throughput plaque overlays Een 96 putjes van Veros uitgeplaat bij 3 x 10 ⁴ cellen per putje, werden geïnfecteerd met 50 pi inoculum met dezelfde serieel verdund vanaf monster RVFV MP12 gedurende 1 uur in viervoud. Voor de overlays, 0,6 en 1,2% eindconcentraties van Avicel uitgetest om de haalbaarheid en de reproduceerbaarheid van het gebruik van vloeibare bekledingen in een high-throughput wijze, Panelen A en B vast.

	RVFV	VEEV	Influenza B
Celtype	Vero	Vero	MDCK
Infectie periode	1 hr	1 hr	45 min
Incubatietijd	3 dagen	2 dagen	3 dagen

Tabel 1: Plaque Assay Inenting Voorwaarden en Cell Types

	RVFV	VEEV	Influenza B
Cell Type	Vero	Vero	MDCK
Groei Type	DMEM 1	DMEM 1	DMEM 2
Plaque Media	2xEMEM A	2xEMEM A	2xEMEM B

1. Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1% L-glutamine, 1% Penicllin / Streptomycine.
2. Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 1% L-glutamine, 1% Penicllin / streptomycine, 0,2% runderserumalbumine, 0.025% HEPES, DEAE-Dextran 50 ug / ml.
A. 2x Minimal Essential Media (500 ml) aangevuld met 5% FBS (25 ml), 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 1% natriumpyruvaat (5 ml), 1% L-Glutamine (5 ml), 2% Pen / Strep (10 ml).
B. 2x Minimal Essential Media (500 ml) aangevuld met 0,2% runderserumalbumine, 1% Minimum Essential Amino Acids (5 ml), 50 ug / ml, 0,025% HEPES, DEAE-Dextran, trypsine-TPCK *
* Net voor de voorbereiding, voeg 1 ui per 25ml van 2 pg / ml voorraad van TPCK-trypsine om de hoeveelheid die u gaat gebruiken om te mengen met agarose voor plaques.

Tabel 2: Plaque en Viral / cellulaire groei Medias

	RVFV	VEEV	Influenza B
Celtype	Vero	Vero	MDCK
Infectie periode	1 hr	1 hr	45 min
Incubatietijd	3 dagen	2 dagen	3 dagen

Overlay oplossingen zullen niet ophouden te bestaan ​​wanneer zolang steriliteit wordt gehandhaafd gemaakt.

Tabel 3: Overlays Stock

	6 goed	12 goed	96 putjes
# Van cellen / putje	5 x 10 5	2,5 x 10 5	3 x 10 4
Volume van innoculum (pl)	400	200	50
volume van de overlay (ml)	3	1.5	0.100

Tabel 4: Plaat Formats

Discussie

De belangrijkste factor voor een succesvolle plaque assay ligt in het optimaliseren van het protocol voor de betreffende virale cultuur vraag omstandigheden sterk kunnen verschillen. Belangrijke punten rekening zijn: gastheer cellulaire verenigbaarheid met het virus betrokken geschikte virale groei omstandigheden voldoende verdunningsgebieden om duidelijk onderscheid plaques en correct overlay selectie en kleuring van de cellen en virus in kwestie.

Terwijl VEEV en RVFV beide groeien onder zeer vergelijkbare omstandigheden gebruikmaking veel van dezelfde gastheercel soorten verschillen in morfologie plaque en groeikinetiek variëren aanzienlijk. Bij het ​​gebruik van Vero-cellen voor plaque assays, die traditioneel worden gebruikt als een vermeerdering en indicator cellijn voor hemorragische koorts virussen en alfavirussen, VEEV groeit meestal tot hogere titers dan RVFV en demonstreert verhoogde replicatie kinetiek, het ontwikkelen van grote uniforme plaques op 48 hpi ^{4, 10-12.} In tegenstelling tot VEEV, RVFV vereist 72 HPI en toont plaques die kenmerkend veel kleiner en variabele grootte.

Tegenover RVFV en VEEV, het influenzavirus zeer specifieke gastheercel en kan moeilijk te verspreiden via weefselkweek. Voor het influenza virus, is virale binnenkomst en fusie gewoonlijk geïnitieerd door de binding van het celoppervlak receptor met het virale glycoproteïne hamagglutinin (HA), welke men de doelcel via binding medieert de gastheercel α-siaalzuur oppervlak receptor. HA is een trimeer glycoproteïne die in de membraanenvelop alle Influenza virussen en vereist splitsing in de subeenheden HA1 en HA2 door een specifieke gastheercel protease. Om de kwestie verder te compliceren, kan deze klievingsplaatsen vaak variëren tussen virusstammen ^13. Aangezien de expressie van proteasen kunnen splitsen HA is beperkt tot specifieke weefsels, proteasen are vaak toegevoegd aan celkweek media om virale fusie en de toegang tot de geselecteerde gastheercel ¹³ te vergemakkelijken. TPCK-trypsine is een voorbeeld van een algemeen gebruikte protease die wordt gebruikt in celkweek met zowel MDCK en Vero-cellen: multicyclische replicatie (in de afwezigheid van trypsine te inactiveren serum) vergemakkelijkt door de proteolytische activatie van virale HA ^14,15.

Zoals aangetoond in deze studie en anderen, kunnen verschillen in virale levenscycli overlay selecties, plaat formaten en collectie tijden, met aanzienlijke verschillen invloed onder verschillende klassen en soorten van virussen. In onze studie, agarose overlay aangetoond duidelijker plaques hogere titers dan zowel CMC of vloeibaar overlays voor zowel RVFV en Influenza B virus, versterkt het nut onder diverse virussen en celtypen. Met behulp van een lage uiteindelijke concentratie van agarose enorm geholpen bij het verwijderen van de vaste stekkers en vereenvoudigde vlekken. CMC algemeen toonde de poorest werkzaamheid als een overlay voor alle drie virussen getest en geproduceerd zeer klein en onduidelijk plaques voor Influenza B-virus. Hoewel de totale CMC toonde de minst gewenste eigenschappen, het gebruik ervan in snel groeiende en zeer virulente virussen kan voordelig blijken, zoals zij lijken plaque verkleinen met slechts een minimale afname in titer. De vloeistof overlay bleek de meest veelzijdige doordat zijn het zeer eenvoudig te bereiden, toegenomen gebruiksgemak, en was vergelijkbaar met agarose in alle geselecteerde virussen. In een hogere doorvoer 96-well plaat formaat, toepassing en verwijdering niet geremd door stollen als traditionele overlays en ontvangen accurate en consistente resultaten. Een overweging bij het gebruik van vloeibare overlays ligt in de ondoorzichtige kleur en onvermogen om plaquevorming te monitoren als de platen niet kan worden verplaatst, totdat de punt van verzameling, het beperken van deze aanpassing aan virussen met eerder gekarakteriseerd replicatie kinetiek.

Kleine aanpassingen in plaque assay omstandigheden kunnen de resultaten aanzienlijk te veranderen, en de evaluatie en de uitvoering van een nieuw systeem of techniek altijd nodig is. Terwijl een geoptimaliseerde en gestandaardiseerde plaquetest protocol bestaat niet voor iedere situatie, ons rapport tonen de veelzijdigheid en gebruiksgemak in zowel traditionele als nieuwe vloeibare overlays voor plaque assays, terwijl het verstrekken van een voldoende achtergrond voor verdere gebruiker wijzigingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
6-well CellStar plate for tissue culture	Greiner Bio-One	658 160
12-well CellStar plate for tissue culture	Greiner Bio-One	665 180
96-well CellStar plate for tissue culture	Greiner Bio-One	655 180
96-2ml deep well plate	USA Scientific	C15046314	Voor seriële verdunningen
DMEM	Quality Biologicals	112 013 101	Cell Media/Diluent
2x EMEM for plaques	Quality Biologicals	115 073 101	Opwarmen tot 37 °C
MEM 100x	Cellgro	25 025 Cl
Sodium Pyruvate	Cellgro	25 000 Cl
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140 122
L-Glutamine	Gibco	25030 081
HyClone FBS	Thermo Scientific	SH30910.03	Voor gebruik gedurende 30 min bij 62 °C verwarmen
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldritch	A7030-50G
Trypsin TPCK	Sigma Aldritch	T1426-50mg	Maak aliquots/Vermijd bevriezen en ontdooien
HEPES	Gibco	15630-080
DEAE-Dextran	Sigma Aldritch	D9885-10G
Crystal Violet	Sigma Aldritch	C3886-25G
Formaldehyde Solution	Sigma Aldritch	F8775-500ml
Ethanol denatured Reagent Grade	Sigma Aldritch	362808-1L
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer USA	RC-591 NF	Krachtig schudden bij het oplossen  gedurende >30 min om te homogeniseren
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-100
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity	Sigma Aldrich	C4888