In dit artikel tonen we een methode voor het bereiden van acute hersenslices bij fysiologische temperatuur, met behulp van een conventionele fysiologische oplossing zonder speciale aanpassingen voor het snijden (zoals het toevoegen van sucrose) en zonder intracardiale perfusie van het dier vóór de slice-voorbereiding.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Slice It Hot: Acute volwassen hersenen Snijden in Fysiologische Temperatuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van acute hersenen plakjes. Deze procedure is een essentieel element voor elektrofysiologische patch-clamp experimenten die in sterke mate de kwaliteit van de resultaten. Het is aangetoond dat het weglaten van de koelstap tijdens het snijden procedure voordelig verkrijgen gezonde segmenten en cellen, vooral dan wanneer het zeer myeline hersenstructuren van volwassen dieren. Hoewel het precieze mechanisme waarbij verhoogde temperatuur ondersteunt neurale gezondheid kan alleen worden gespeculeerd, is het logisch dat, waar mogelijk, de temperatuur waarbij het snijden wordt uitgevoerd moet dicht bij fysiologische omstandigheden voor temperatuur gerelateerde artefacten te voorkomen. Een ander belangrijk voordeel van deze methode is de eenvoud van de procedure en derhalve de korte bereidingstijd. In de aangetoonde werkwijze volwassen muizen worden gebruikt, maar dezelfde procedure kan worden toegepast jongere muizen en ratten. Ook de volgende patch clamp experiment wordt uitgevoerd op horizontale cerebellaire segmenten, maar dezelfde procedure kan ook worden gebruikt in andere vlakken en andere posterieure gebieden van de hersenen.
Inleiding
Doel van de gepresenteerde methode is om hoogwaardige acute hersencoupes verkrijgen voor in vitro elektrofysiologische experimenten, zeker bij volwassenen of oudere dieren.
De acute brain slicing methode, zoals beschreven door Skrede en Westgaard 1 in twee elegante zinnen, is uitgegroeid tot een van de fundamenten van de moderne neurowetenschappen onderzoek en wordt gebruikt in talloze variaties wereldwijd. De kwaliteit van de segmenten wordt weerspiegeld in aantal levende neuronen per segment, de periode gedurende welke de cellen behouden hun elektrofysiologische en morfologische eigenschappen en de integriteit van het weefsel. Bovendien is de maximale stabiele opnames afhankelijk van de kwaliteit van de segmenten. Aldus langs de decennia de oorspronkelijke snijden methode is verder ontwikkeld door afzonderlijke onderzoeksgroepen plak herstel verbeteren na het snijden 2-10, vaak door complexe veranderingen van de samenstelling van het snijden or recovery oplossingen (zoals het toevoegen ascorbaat, thioureum of H 2 O 2) en intra-cardiale pre-perfusie van de dieren met gekoelde fysiologische oplossingen.
Zoals onlangs aangetoond 11, fysiologische temperatuur tijdens snijden lijkt gunstiger dan afkoelen tot neuronale gezondheid zijn; de verbetering is het meest opvallend bij het werken met volwassen (2-8 maand) knaagdieren. Het vermijden dramatische veranderingen temperatuur staat artefacten vanwege temperatuurafhankelijke processen in de cellen, zoals plasticiteit 13 en ionkanalen kinetiek 13,14. Dergelijke veranderingen kunnen membraan spanning en intracellulaire calcium signalering, spike drempel beïnvloeden, en spike vorm.
De "hot" acute slice voorbereiding hier gepresenteerde methode is een algemene procedure voor het verkrijgen van hoogwaardige acute hersenen plakjes vanaf elke regio hersenen, waaronder de kleine hersenen, de cortex en de hippocampus, hersenstamkernen 16 </ Sup> en de bulbus olfactorius, zowel in ratten en muizen.
Met name de fysiologische temperatuur slicing procedure vereist dat het snijmes trilt bijna perfect horizontaal en is zonder enige structurele defecten. Zulke precisie is misschien niet haalbaar met oudere snijmachine modellen zijn; in dergelijke gevallen raadzaam uitvoeren van de slice preparaat ijskoude omstandigheden als lage temperaturen lijkt het weefsel beter bestand tegen mechanische beschadiging, zelfs indien de kosten van metabole afwijkingen maken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Hebrew University's Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van de oplossingen en tools voor het snijden
- Bereid 1 L standaard fysiologische oplossing (SPS) die de in tabel 1 beschreven ionen.
- Bereid een voorraadoplossing van de zouten op 10 maal de eindconcentratie vooraf een opslag glazen fles gevuld met 1000 ml gedeïoniseerd water (geleidbaarheid van 0,055 mS / cm). Zouten (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, en MgSO4) toe te voegen, en roer tot het volledig is opgelost. Bewaar de stockoplossing in 4 ° C.
- De uiteindelijke oplossing SPS op de dag van het experiment. Voeg 100 ml van de stockoplossing aan 700 ml gezuiverd water, los de glucose (3,6 g) en NaHCO3 (2,18 g) met magnetische roerstaaf en voeg vervolgens gezuiverd water tot 1 L.
- Equilibreer de solutidoor vergassing met 95% O2 / 5% CO2 gedurende ~ 20 minuten. Daarna, voeg 2 ml van 1 M CaCl2-oplossing.
- Monteer de volgende instrumenten (Figuur 1).
- Bereid grote schaar of ander gereedschap voor onthoofding, kleine chirurgische schaar voor het openen van de schedel, fijne punt tang voor het heffen van de schedel naar de hersenen bloot te leggen, scalpel met mes voor het ontleden van het gewenste deel van de hersenen om te worden gesneden en een kleine spatel voor het manipuleren van de ontleed hersendelen.
- Breng in kleine stukjes filtreerpapier voor het verwijderen van overtollige vloeistof van de hersenen, twee kleine petrischalen voor de hersenen ontleed in twee glazen 500 ml bekers voor met warm gezuiverd water en SPS en cyanoacrylaat lijm voor het lijmen van de hersenen naar de slicing podium.
- Bereid een kleine borstel voor het afhandelen van de plakken tijdens het snijden en een brede mond glazen Pasteur pipet voor het verplaatsen van de segmenten van de slicing bad aan het herstel chamber. Ontsmet de tools om de groei van bacteriën in de warme slice baden te voorkomen. Verder gebruik schone laboratorium handschoenen.
- Bereid een ondergedompeld slice recovery kamer zoals beschreven door Gibb en Edwards 15. Continu gas de SPS met 95% O2 / 5% CO2 en laten 36 ° C. Zorg ervoor dat de vergassing niet tot kleine bellen gevangen in het bad dat schijfjes kunnen beschadigen.
- Warm ~ 300 ml SPS tot 36 ° C op een verwarmingsplaat met magneetroerder of in een waterbad. Als een verwarmingsplaat wordt gebruikt, zorgen de oplossing tegen oververhitting, wat kan leiden tot precipitatie ion voorkomen. Indien namelijk warme nieuwe SPS plaats van koelen van het oude.
- Breng ~ 500 ml gezuiverd water aan de kook met behulp van een elektrische waterkoker en, in een bekerglas, combineer 300 ml van het met koud water om iets warmer water te verkrijgen dan het snijden temperatuur. Gebruik deze opgewarmd gezuiverd water tijdens de onthoofding en gebruik de Remaining van het gekookte water later voor het handhaven van de fysiologische temperatuur van de slicing bad.
- Verdoven de muis door het injecteren van 0,1 ml van pentobarbital (60 mg / ml) intraperitoneaal. Na een paar minuten controleren of het dier niet reageert op sterke teen of staart knijpt het ontbreken van gevoel vast te stellen.
2. Het ontleden van de hersenen
- Snel onthoofden de muis door het snijden van de hals met de grote schaar in de buurt van de achterkant van de schedel, en laat het hoofd vallen in het bekerglas met warm gezuiverd water af te spoelen overtollige bloed.
- Expose het foramen magnum in de schedel onder de nekspieren en de huid, eventueel verwijderen van meer van de hals met de kleine schaar.
- Trek de huid op de bovenkant van de schedel kunnen duidelijk de schedel hechtingen om geleidingsopening van de schedel.
- Snijd de schedel geopend door het invoegen van de onderste punt van de kleine schaar door het foramen magnum en onmiddellijk draaien ze in de richting vande laterale zijde. Voorzichtig snijden langs de laterale rand van de pariëtale bot tot een locatie achter de ogen en de frontoparietal hechtdraad; Vervolgens schakelt naar het midden van de schedel en dwars door de middellijn aan de andere kant van de schedel (zie groene stippellijn in figuur 2A).
- Met behulp van fijne punt tang, til de schedel van de frontoparietal hoek en trek het schuin naar boven en zijwaarts naar de hersenen bloot te leggen (zie de gele gestippelde pijl in figuur 2A). Zorg ervoor dat de schedel niet is verbonden aan een bot of de huid van het hoofd, zodat de hersenen op zijn plaats blijft wanneer de schedel wordt opgeheven. In het geval dat de hersenen in beweging is met de schedel, gebruik maken van de kleine schaar om elke bindweefsel tussen de schedel en de hersenen te verwijderen.
- Wanneer de hersenen wordt blootgesteld, staan niet toe dat de hersenen te droog zijn. Zo voert u de volgende stappen terwijl de schedel en de hersenen in een petrischaal gevuld met opgewarmd, vergast SPS.
- Trek het deel van de hersenen voor eXperiment van de rest van de hersenen met behulp van een scalpel en een spatel. Bij gebruik van het cerebellum, los van de voorhersenen van een snede door de middenhersenen en pons (langs rode lijnen in figuren 2B-D) en het verplaatsen naar een kleine petrischaal die vers bevat vergast SPS.
- Verwijder de hersenstam een rechte en brede basis voor het lijmen van de hersenen snijstadium snijden wanneer het cerebellum in horizontaal vlak vormen. Kort plaats het cerebellum op een nat stuk filterpapier, zodat de kant die werd gesneden uit de voorhersenen naar beneden is gericht.
- Snijd de hersenstam met een scalpel om de basis te vormen (zoals aangegeven met de blauwe lijn in figuur 2B), en de terugkeer van de kleine hersenen naar de bedrijfstoeslagregeling. Wanneer andere vlakken van het snijden zijn nodig, trim het cerebellum blok dienovereenkomstig (blauwe lijnen in de figuren 2C & D).
3. Het snijden van de hersenen
- Bereid de cutting fase door na te gaan dat het is dry, voor het aanbrengen van een kleine druppel superlijm in het midden van het podium.
- Til de hersenen blok van de SPS met een spatel met de juiste kant naar boven en verwijder de overtollige vloeistof uit de hersenen met behulp van kleine stukjes filtreerpapier. Dan, met een enkele beweging, schuift u de hersenen van de spatel op de druppel lijm op het podium.
- De hersenen uitdrogen en de lijm worden uitgevoerd op de zijden van het weefsel te voorkomen, enkele druppels van SPS met een Pasteur pipet en plaats het uitsnijden in de ruimte snijden. Lijn de hersenen blokkeren, zodat de regio's van belang (bijvoorbeeld, cerebellaire schors) worden geconfronteerd met het mes en zal dus worden onderworpen aan minste hoeveelheid mechanische druk voordat het wordt gesneden.
- Snijd elk plakje volgens de instructies van de fabrikant onder voortdurend vergassen de SPS in de snijkamer en de temperatuur op 34-37 ° C. Houd de temperatuur van de maaikamer op deze afstand door het vullen van de externeal kamer van de snijmachine met verwarmd gezuiverd water en het vervangen van het water wanneer de temperatuur te laag wordt.
OPMERKING: Het snijden parameters moet proefondervindelijk worden gevonden voor elk type weefsel en neuronen die worden onderzocht. Bij het Campden SMZ 700 slicer met keramische bladen en cerebellaire Golgi elementen altijd 0,75 mm trillingsamplitude bij 65 Hz en voortbewegingssnelheid van 0,05 mm / sec; voor nucleaire cerebellaire neuronen hogere amplitude en frequentie (1 mm en 90 Hz, respectievelijk) en langzamere snelheid toevoer (0,01-0,02 mm / sec) aanbevolen. Voor zowel Golgi en cerebellaire nucleaire neuronen, moet plakdikte zijn 300 micrometer. - Tijdens het snijden, niet toestaan dat de schijfjes op te vouwen op zichzelf. Voorkom dit door ze zachtjes ondersteunen met een zachte borstel, bij voorkeur het aanraken van het schijfje alleen in regio's die niet van belang zijn voor het experiment. Zorg ervoor om te voorkomen dat de borstel uit het aanraken van de vibratome mes; vooral bij de keramische bladen, zelfs een licht contactkan het mes beschadigen.
- Beweeg elke plak van de slicing kamer naar een herstel / nerkamer behulp van een brede mond, brand gepolijst glas Pasteur pipet.
- Laat de plakjes rusten in de kamer gedurende ten minste 1 uur voor de proef begon. Dit maakt afbraak van beschadigde of stervende weefsels en cellen en derhalve resulteert in een schonere slice oppervlak. Tijdens het eerste uur, houdt de temperatuur van de SPS in de kamer in het gebied van 34-36 ° C; ervoor te zorgen dat de schijfjes niet worden aangeraakt door luchtbellen die de schijfjes kunnen beschadigen of ze zweven.
4. Experiment
- Na 1 uur, laat het herstel kamertemperatuur afkoelen tot kamertemperatuur (17-25 ° C).
Opmerking: Dit zou de periode waarin de plakjes kunnen worden gebruikt door het vertragen van de groei van bacteriën en cellulair metabolisme verlengen. Deze periode is afhankelijk van het gebied in de hersenen en het type cel. Zo kunnen bepaalde typen Golgi cellen gevonden in gezonde segmenten zijn8 uur na het snijden, terwijl andere soorten laatste slechts 6 uur. - Na 1 uur is verstreken vanaf het in plakken snijden, gebruik maken van de schijfjes van verschillende elektrofysiologische experimenten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Plakjes bereid op de beschreven wijze kan worden gebruikt voor verschillende elektrofysiologische en optogenetic experimenten. In figuur 3A en 3C tonen wij een representatief voorbeeld van een horizontale cerebellaire slice en coronale cerebrale corticale plak respectievelijk bekeken onder differentiële interferentie (DIC) optiek. In de cerebellaire slice, kan verschillende soorten cerebellaire neuronen gemakkelijk herkend worden door hun locatie en mobiele vorm van het lichaam, waardoo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We tonen een werkwijze voor het bereiden van acute hersencoupes van muizen in fysiologische plaats ijskoude temperatuur.
Aangetoond is 11 dat de kwaliteit van de verkregen schijfjes warm blijft superieur vergeleken met die bereid met koude omstandigheden, mits de snijmachine mes heeft minimale verticale trillingen. Slicing in fysiologische temperatuur kunnen fysiologische artefacten veroorzaakt door de lage temperatuur, zoals die met betrekking tot veranderingen in de metabole pro...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We willen de belangrijke bijdrage van Dr. Shiwei Huang (Australian National University) bij het valideren van de methode erkennen. Verder willen we mevrouw Kasia Pietrajtis bedanken voor haar nuttige opmerkingen over Golgi-cellen en de heer Vitaly Lerner voor de experimentele cortexgegevens. Dit werk werd ondersteund door PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC en ISF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentratie: 60 mg/ml in fysiologische zoutoplossing. |
| Grote schaar | FST | 14001-16 | Elke grote schaar of een guillotine met voldoende scherpe randen kan worden gebruikt voor onthoofding |
| Iris schaar | Prestige medical | 48,148 | Elke schaar met fijne punt kan worden gebruikt, mits de schaarbladen niet langer zijn dan 1,5–2 cm |
| Fijne pincet | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpelmes #11 | FST | 10011-00 | |
| Kleine spatel | Fisher | 2350 | |
| Filterpapier | Elk laboratoriummerk kan worden gebruikt. | ||
| Petrischalen | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glazen bekers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteurpipet | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Superlijm | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Snijder | Campden | 7000-smz | |
| Keramische snijmes | Campden | 7550-1-C | |
| Magneetverwarming/roerder | Voor het verwarmen van de SPS voor de procedure | ||
| Electrische waterkoker | Voor het verwarmen van water voor temperatuurregeling | ||
| Snijwersterkselkamer + verwarmingseenheid | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Zelfgebouwde modellen kunnen ook worden gebruikt. |
| Thermometer | Voor het bewaken van de SPS-temperatuur tijdens dissectie en snijden |
Referenties
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
