In dit artikel tonen we een methode voor het bereiden van acute hersenslices bij fysiologische temperatuur, met behulp van een conventionele fysiologische oplossing zonder speciale aanpassingen voor het snijden (zoals het toevoegen van sucrose) en zonder intracardiale perfusie van het dier vóór de slice-voorbereiding.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Slice It Hot: Acute volwassen hersenen Snijden in Fysiologische Temperatuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van acute hersenen plakjes. Deze procedure is een essentieel element voor elektrofysiologische patch-clamp experimenten die in sterke mate de kwaliteit van de resultaten. Het is aangetoond dat het weglaten van de koelstap tijdens het snijden procedure voordelig verkrijgen gezonde segmenten en cellen, vooral dan wanneer het zeer myeline hersenstructuren van volwassen dieren. Hoewel het precieze mechanisme waarbij verhoogde temperatuur ondersteunt neurale gezondheid kan alleen worden gespeculeerd, is het logisch dat, waar mogelijk, de temperatuur waarbij het snijden wordt uitgevoerd moet dicht bij fysiologische omstandigheden voor temperatuur gerelateerde artefacten te voorkomen. Een ander belangrijk voordeel van deze methode is de eenvoud van de procedure en derhalve de korte bereidingstijd. In de aangetoonde werkwijze volwassen muizen worden gebruikt, maar dezelfde procedure kan worden toegepast jongere muizen en ratten. Ook de volgende patch clamp experiment wordt uitgevoerd op horizontale cerebellaire segmenten, maar dezelfde procedure kan ook worden gebruikt in andere vlakken en andere posterieure gebieden van de hersenen.
Inleiding
Doel van de gepresenteerde methode is om hoogwaardige acute hersencoupes verkrijgen voor in vitro elektrofysiologische experimenten, zeker bij volwassenen of oudere dieren.
De acute brain slicing methode, zoals beschreven door Skrede en Westgaard 1 in twee elegante zinnen, is uitgegroeid tot een van de fundamenten van de moderne neurowetenschappen onderzoek en wordt gebruikt in talloze variaties wereldwijd. De kwaliteit van de segmenten wordt weerspiegeld in aantal levende neuronen per segment, de periode gedurende welke de cellen behouden hun elektrofysiologische en morfologische eigenschappen en de integriteit van he....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle in dit protocol beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door de Hebrew University's Animal Care en gebruik Comite.
1. Voorbereiding van de oplossingen en tools voor het snijden
- Bereid 1 L standaard fysiologische oplossing (SPS) die de in tabel 1 beschreven ionen.
- Bereid een voorraadoplossing van de zouten op 10 maal de eindconcentratie vooraf een opslag glazen fles gevuld met 1000 ml gedeïoniseerd water (geleidbaarheid van 0,055 mS / cm). Zouten (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, en MgSO4) toe te voegen, en roer tot het volledig is opgelost. Bewaar de stocko....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Plakjes bereid op de beschreven wijze kan worden gebruikt voor verschillende elektrofysiologische en optogenetic experimenten. In figuur 3A en 3C tonen wij een representatief voorbeeld van een horizontale cerebellaire slice en coronale cerebrale corticale plak respectievelijk bekeken onder differentiële interferentie (DIC) optiek. In de cerebellaire slice, kan verschillende soorten cerebellaire neuronen gemakkelijk herkend worden door hun locatie en mobiele vorm van het lichaam, waardoo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We tonen een werkwijze voor het bereiden van acute hersencoupes van muizen in fysiologische plaats ijskoude temperatuur.
Aangetoond is 11 dat de kwaliteit van de verkregen schijfjes warm blijft superieur vergeleken met die bereid met koude omstandigheden, mits de snijmachine mes heeft minimale verticale trillingen. Slicing in fysiologische temperatuur kunnen fysiologische artefacten veroorzaakt door de lage temperatuur, zoals die met betrekking tot veranderingen in de metabole pro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
We willen de belangrijke bijdrage van Dr. Shiwei Huang (Australian National University) bij het valideren van de methode erkennen. Verder willen we mevrouw Kasia Pietrajtis bedanken voor haar nuttige opmerkingen over Golgi-cellen en de heer Vitaly Lerner voor de experimentele cortexgegevens. Dit werk werd ondersteund door PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC en ISF.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentratie: 60 mg/ml in fysiologische zoutoplossing. |
| Grote schaar | FST | 14001-16 | Elke grote schaar of een guillotine met voldoende scherpe randen kan worden gebruikt voor onthoofding |
| Iris schaar | Prestige medical | 48,148 | Elke schaar met fijne punt kan worden gebruikt, mits de schaarbladen niet langer zijn dan 1,5–2 cm |
| Fijne pincet | FST | 11254-20 | |
| Scalpel | FST | 91003-12 | |
| Scalpelmes #11 | FST | 10011-00 | |
| Kleine spatel | Fisher | 2350 | |
| Filterpapier | Elk laboratoriummerk kan worden gebruikt. | ||
| Petrischalen | Duroplan | Z231509-1 | |
| Glazen bekers | SCHOT | 10022846 | |
| Pasteurpipet | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
| Superlijm | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Snijder | Campden | 7000-smz | |
| Keramische snijmes | Campden | 7550-1-C | |
| Magneetverwarming/roerder | Voor het verwarmen van de SPS voor de procedure | ||
| Electrische waterkoker | Voor het verwarmen van water voor temperatuurregeling | ||
| Snijwersterkselkamer + verwarmingseenheid | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Zelfgebouwde modellen kunnen ook worden gebruikt. |
| Thermometer | Voor het bewaken van de SPS-temperatuur tijdens dissectie en snijden |
Referenties
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular s....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
