De mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van intimale hyperplasie (IH) en bypass falen nog steeds slecht begrepen. Deze studie beschrijft een ex vivo-systeem voor de menselijke aderen onder gecontroleerde flow en druk perfuseren. Verder is de efficiëntie van het extern wapeningsnet beperken de ontwikkeling van IH werd geëvalueerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Procedure for Human aderen Ex Vivo Perfusie en Externe Reinforcement
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De steunpilaar van de hedendaagse therapieën voor uitgebreide occlusieve arteriële ziekte is veneuze bypass. Echter, is de duurzaamheid bedreigd door intimale hyperplasie (IH) die uiteindelijk leidt tot vatafsluiting en graft falen. Mechanische krachten, met name lage afschuifspanning en hoge wandspanning, worden verondersteld te initiëren en deze cellulaire en moleculaire veranderingen ondersteunen, maar hun precieze bijdrage nog worden ontrafeld. Om selectief de rol van de druk en schuifspanning op de biologie van IH evalueren, een ex vivo perfusie systeem (EVP's) is opgericht om segmenten van de menselijke aderen onder arteriële regime (high shear stress en hoge druk) doortrekken. Bijkomende technische innovaties mogelijk om tegelijkertijd perfusie van twee segmenten van dezelfde ader, een versterkt met een externe mesh. Aderen werden geoogst met behulp van een no-touch-techniek en onmiddellijk overgebracht naar het laboratorium voor de montage in de EVP. Een segment van de vers isoleerde ader werd niet doorbloed (controle, dag 0). De twee andere segmenten werden geperfundeerd gedurende maximaal 7 dagen, een volledig wordt afgeschermd met een 4 mm (diameter) externe mesh. De druk, stroomsnelheid, en hartslag werden continu bewaakt en aangepast aan de hemodynamische omstandigheden in de slagader na te bootsen. Na voltooiing van de perfusie werden aders gedemonteerd en gebruikt voor histologische en moleculaire analyse. Onder ex vivo omstandigheden, hoge druk perfusie (arterieel, gemiddelde = 100 mm Hg) voldoende om IH en hermodellering van menselijke aderen genereren. Deze veranderingen worden gereduceerd in de aanwezigheid van een externe polyester mesh.
Inleiding
Hart-en vaatziekten zijn de belangrijkste oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de westerse landen 1. Ondanks de vooruitgang in endovasculaire behandelingen, bypass-operatie blijft de steunpilaar van de moderne therapieën, dus meer dan een half miljoen vaatprothesen worden jaarlijks uitgevoerd in de Verenigde Staten. Echter, ondanks decennia van onderzoek, 30-60% van de onderste extremiteit veneuze transplantaten niet binnen de eerste jaren als gevolg van hyperplasie (IH) 2. Mechanische krachten, in het bijzonder lage shear stress (SS) en de hoge muur spanning, staan centraal in de initiatie en ontwikkeling van deze hyperplastische respons 3,4. Om dit probleem aan te pakken, een ex vivo aderen perfusiesysteem (EVP's) werd gegenereerd om te studeren, onder strikt gecontroleerde hemodynamische omstandigheden (druk en shear stress), het gedrag van de menselijke aderen. In deze studie, na insertie in de arteriële circulatie-achtige, hoge druk (gemiddelde = 100 mm Hg) was voldoende om Prolif stimulerenking en migratie van gladde spiercellen in de intimale laag (IH) 5.
Zoogdieren studies hebben gesuggereerd het gebruik van uitwendige wapening als een efficiënte methode om de "gearterialiseerde ader" ondersteunen en het tegengaan van de acute hemodynamische verandert de ader gezichten eenmaal geïmplanteerd in een arteriële milieu. Het gaas voorkomen over-uitzetting, verhoogde schuifspanning en verminderde wandspanning en dus IH 6-10. Echter, de onderliggende mechanismen en de toepasselijkheid ervan op de menselijke aderen in het verbeteren van de bypass doorgankelijkheid zijn niet volledig gekarakteriseerd. De EVP werd gebruikt voor het vergelijken, in staat nabootsen van de veranderingen een ader gezichten eenmaal ingebracht in een arteriële behandeling (high shear stress en druk), het gedrag van menselijke aderen in de afwezigheid en aanwezigheid externe macroporeuze polyester buisvormige mesh. Door het voorkomen van pathologische remodelling en IH, het gaas het bewijs geleverd van haar potentiële klinische efficiëntie 11 .
Deze studie 1) introduceert een model van ex vivo humane aderen perfusie onder gecontroleerde druk en schuifspanning 2) toont aan dat de externe macro-poreuze polyester gaas vermindert IH en geeft cruciale informatie voor de potentiële klinische toepassing.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De Ethische Commissie van de Universiteit van Lausanne ingestemd met de experimenten, die in overeenstemming zijn met de in de Verklaring van Helsinki van 1975 principes, zoals herzien in 1983 voor het gebruik van menselijke weefsels.
1 Human Grote vene Harvest
- Verkrijgen overschot segmenten van niet-menselijke spataderen aderen van patiënten die de onderste ledematen bypass operatie voor ischemie. In de operatiekamer, desinfecteer de hele been met een jodium-oplossing en drapeer de patiënt aan het been bloot van de lies tot aan de voet.
- Maak een mediane incisie vanaf de lies tot de knie (het verlaten van de onderbroken huid gedeelte).
- Oogst de grote vene met een uitloper van de omgevende weefsels (no-touch-techniek). Secure zijtakken van de aderen met 4-0 zijden dassen. Onmiddellijk slaan minimaal 9 cm lang surplus segment van de grotere saphena, met een uitwendige diameter van 2,5-4 mm bij 4 ° C in een RPMI-1640 Glutamax medium, aangevuld met 12,5% foetaal kalfsserum en brengen het naar het laboratorium.
2 EVPs Ontwerp
- Monteer de algemene uitrusting getoond in figuur 1. Autoclaaf alle apparatuur en onder steriele omstandigheden te houden alle componenten. Daarnaast is ervoor te zorgen dat het systeem waterdicht is en geen chemicaliën lekken in het medium. Gebruik polymethacrylaat methyl (PMMA-GS) voor de cover. Staal (X5 Cr Ni 18 10) en polyoxymethyleen kunststof (POM) als de ader ondersteuning.
- Ontwerp de perfusie kamer naar de gewenste geometrie voor de plaatsing van de ader en de verbinding mogelijk. Zorg ervoor dat de diepte (of radius bij gebruik cilindrische constructie) ten minste 2,5 cm, zodat het mogelijk minimale buiging en dilatatie van het vat, samen met een constante dekking van het kweekmedium (figuur 1). Afdichting is een groot probleem en is de reden rechthoekige PMMA-GS bouw wordt gebruikt.
- Ontwerp de ader ondersteuning van de gewenste geometry. Om ader knikken of meer distensie voorkomen, moet lengteverstelling door duwen of trekken (schroef kan niet worden gebruikt voor dit doel, aangezien de ader worden gedraaid samen met de schroef).
OPMERKING: Een volledig stalen stang met elkaar verbonden door 2 schuifdeuren L-vormige stukken die de 2 ader cilinders ondersteunen (5 mm diameter om het schip te passen) en de ader (Figuur 1B en figuur 2) wordt hier gebruikt. - Ontwerp de kolom druk, zodat het "rustende druk" toegepast op het systeem: p = 0-10 = hx ρ xg, waarbij p = druk (N / m 2 Pa) h = hoogte van de vloeistofkolom (m) ρ = massa vloeistof (kg / m 3) en g = de gravitatieconstante (9.81 m / s 2). Ontwerp vier verbinding kanalen, van boven naar beneden: druk uitoefenen voor de uitstroom (van de ader), de instroom (de ader) en mediumverversing mogelijk.
- Bereid het medium. Op basis van eerdere studies 5,11-14, kiest RPMI- 1640, aangevuld met Glutamax, 12,5% Foetaal kalfsserum en 1% antibioticum-antimycotische oplossing (10.000 E / ml penicilline G, plus 10 mg / ml streptomycine sulfaat, plus 25 mg / ml amfotericine B, plus 0,5 ug / ml: gentamycine). Shear stress (SS) wordt gegeven door SS = 4 μQ / π * r 3 Q de stroomsnelheid (ml / sec), r de straal (cm) van de ader segment en μ de viscositeit van de perfusie medium.
- Moduleren SS door het aanpassen van de viscositeit door middel van toevoeging van 70 kDa dextran. Meet de viscositeit met een viscometer. Hier, voeg 8% 70 kDa dextran SS op 9-15 dyn / cm 2.
- Stel de gearing pomp een pulsvormige signaal nier van 60 pulsen / min en constante amplitude genereren van een unidirectionele stroming van 150 ± 15 ml / min, onafhankelijk van de in het systeem bestuurd door een computer druk veroorzaken. Zorg ervoor dat het besturen van software integreert constante acquisitie en monitoring van de druk, stroomsnelheid, hartslag en het signaal. Indien gewenst, gebruik maken van een tweede pomp (niet synchroonhronized) een niet-laminaire, turbulente stroming produceren.
3 EVP's Assembly (figuur 1)
- Voordat u begint, zorg ervoor dat alle apparatuur is steriel. Voer alle volgende stappen onder steriliteit in een laminaire stroming kap.
- Plaats de ader in een petrischaal gevuld met medium. Gebruik een chirurgisch mes en verdeel de ader in 3 gelijke segmenten.
- Spoel een segment in PBS. Verdeel het segment in 3 delen, lossen een in formaline voor morfometrie. Bevries de andere twee voor kwantitatieve transcript (RT-PCR) en eiwitten (western blot) analyse. Beschouw deze segmenten als een controle, niet-geperfundeerde ader.
- Gebruik de 2 resterende segmenten voor perfusie.
- Heel voorzichtig te injecteren medium in de ader en het bepalen van de normale stroomrichting; in aanwezigheid van de kleppen van de ader wordt teruggedraaid.
- Het afdichten van de aderen is van het grootste belang voor experimentele succes. Controleer op lekkage door middel van zekerheden. Bevestig eventuele lekken met 6-0 zijde hechtingen.
- Verbind de ader segment tussen twee metalen cilinders, een uiteinde tegelijk (2.3, figuur 1). Zet de cilinders met Ethibon 3-0 rond de inkepingen (Figuur 1A en B).
- Leg de hele veneuze segment in de perfusie kamer eerder gevuld met medium. Herhaal dezelfde procedure voor het tweede segment.
OPMERKING: Het niet goed af van de ader aan de cilinder zal een bron van lekkage zijn, vereisen reintervention, en een aanzienlijke verhoging van het risico van infectie en experimentele mislukking.
- Leg de hele veneuze segment in de perfusie kamer eerder gevuld met medium. Herhaal dezelfde procedure voor het tweede segment.
- De tweede segment versterken (mesh), laat de twee cilinders (met de ader bijgevoegde) van de L-vormige stukken (2.3 en figuur 1).
- Wees voorzichtig en raak de ader niet aan met welke instrumenten. Schuif het gaas eerste op de cilinder vervolgens op de ader. Een push / pull gedrang zal het gaas op de ader te krijgen.
- Zodra het gaas bedekt het gehele oppervlak van de ader te verzekeren de jacketed ader naar de cilinders met Ethibon 3-0.
- Monteer de ader / cylinder verbinding aan de L-vormige steun en overbrengen naar de perfusie kamer, vooraf gevuld met medium.
- Sluit elke metalen cilinder (in-en uitstroom) een Y-splitser met-peroxide behandelde siliconen buis met een inwendige diameter van 3,2 mm.
- Sluit de uitstroom splitser een tweede Y-splitser met hetzelfde type buis. Vanaf deze Y-splitter Gebruik een buis naar de perfusie druk door beide schepen te meten. Sluit de andere naar de kolom tot gesloten lus (figuur 2) te vormen.
- In de couveuse, gebruik dan een lange (een meter lengte) buis naar de kolom druk aan te sluiten op de kop van de pomp.
- Voltooi het instellen door het aansluiten van de pomp hoofd om de instroom Y-splitter met een andere lange lengte buis (figuur 1).
4 Aders Perfusie
- Na de EVP's assemblage co is geweestmpleted, vul de kolom met medium (verblijf onder de ader uitstroom buis aan het opnieuw vullen toelaten). Voeg meer medium in de kolom totdat het systeem vol. Verplaats alle systeem in de incubator op 37 ± 0,1 ° C met een pH constant gehouden op 7.40 ± 0.01 (met een CO 2 / pH algoritme gebaseerd op de Henderson-Hasselbach vergelijking).
- Breng de tandwielpomp hoofd buiten de couveuse en sluit deze aan op de tandwielpomp rijden. Schroef de stangen aan de vast te zetten.
- Schakel de stroom in de pomp, zorg ervoor dat deze is geactiveerd op de driving-software en laat 5 min voor het medium gelijkmatig worden verdeeld in elk compartiment.
- Om de druk te controleren, maken gebruik van een arteriële lijn monitoring. Sluit de EVP uitgangsdruk (het correspondeert met de arteriële catheter) op de drukomvormer gekoppeld aan de computer.
- Zorg ervoor dat de buis wordt volledig gevuld met medium en geen luchtbellen bevat. De-bubble van de cultuur-systeem via de "arteriële line "buis (figuur 2). Besteed aandacht aan de weergave en zoek een pulserende nier signaal van 60 pulsen / min van constante amplitude. Op dit punt is de gemiddelde druk tussen 0-10 mm Hg. Als de druk <0 en de kolom geleidelijk leegt zoeken naar een lek (ader onderpand of onvoldoende afdichting tussen de ader en de buis).
- Stel de minimale druk tot 6 mm Hg voor een veneuze proef of 90 mm Hg voor een arteriële test. Onder deze omstandigheden is een luchtinjector zijn de vereiste druk om de kolom en systeem.
- Vervang het medium elke 2 dagen met de buis verbonden met de kolomdruk. Om de druk verandering schade te voorkomen, opent de kolom stekker eerste.
5 Afronding van de perfusie
- Na 3 of 7 dagen van de perfusie: neem de EVP's uit de couveuse en demonteer de aderen. Gooi de 5 mm proximale en distale einden ader aan de apparatuur. Snijd een centrale, 5 mm dik rings van het resterende segment en zet in formaline (morfometrie). Bevries de overgebleven fragmenten en reduceren tot poeder voor verdere moleculaire analyses.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De EVP's biedt een waardevol hulpmiddel om zelfstandig de hemodynamische krachten te beoordelen op de menselijke saphena ent remodeling en IH.
Figuur 1 toont de perfusie kamer en de ader support. In figuren 1A en B, de ader steun before (figuur 1A) en na (figuur 1B) samenstel respectievelijk afgebeeld. Het is samengesteld (van boven naar beneden) van 1 plain roestvrij staal meten 9 cm, die dient als drag...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie onthult een ex vivo ader perfusiesysteem (EVP's) tot uitgebreide hemodynamische studies uit te voeren in de menselijke aderen. Dit systeem maakt aderen perfusie onder gedefinieerde hemodynamische parameters bij afwezigheid van verzwarende inflammatoire en groeifactoren vrijgegeven door circulerende cellen in vivo. Zo een beter begrip van de onderliggende routes betrokken bij de controle van IH in menselijke aderen grafts 5,11,12,15.
Reproduceerbar...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de SNF [31003A-138528], de Octav en Marcella Botnar Foundation, de Novartis Foundation en de Emma Muschamp Foundation. Wij danken Martine Lambelet, en Jean-Christophe Stehle voor hun uitstekende technische bijstand.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 - Glutamax | Life Technologies | 61870-010 | |
| Penicilline/Streptomycine/Fungizone | Bioconcept | 4-02F00-H | |
| Dextran van Leuconostoc spp. 500 g | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L | Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG | 100 0 324 00 | |
| Cryosectionering inbeddingsmedium - Tissue-Tek OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Siliconen slang (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m | Idex Health & Science GMBH | MF0037ST | |
| Y-splitter | Idex Health & Science GMBH | Y-connector | |
| 35 mm kweekschaal | Sigma-Aldrich | CLS430165-100EA | |
| 15 ml Falcon buis | BD Bioscence | 352096 | |
| 50 ml Falcon buis | BD Bioscence | 352098 | |
| Gearing pomp - Reglo-Z | Idex Health & Science GMBH | SM 895 | App-Nr 03736-00194 |
| Pompkop | Idex Health & Science GMBH | MI0008 | |
| Monitoring Kit TRANSPAC IV | icumedical | 011-0J736-01 | |
| 20 ml Spuit | B. Braun Medical SA | 4612041-02 | |
| Etibon 3-0 FS-2 | Ethicon- Johnson&Johnson | EH7346H | |
| Mesh ProVena 6-8mm | B. Braun Medical SA | 1105012-14 | |
| NaCl: natriumchloride oplossing perfusie 0.9% (100 ml) | B. Braun Medical SA | 534534 | |
| Masterflex L/S Standard Drive | Cole-Parmer Instrument Co | 7521-10 | |
| Acquisitiekaart | National Instruments | PCI-6024 E | |
| Flowmeter module | Transonic Systems Inc. | TS410 and T402 | |
| Stopkraan met 3-weg | BD Connexta Luerlock | 394600 | |
| Millex Filter | Milian | SE2M229I04 |
Referenties
- Sal Go, A., et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association. Circulation. 129, 399-410 (2014).
- Sal Conte, M., et al. Results of PREVENT III: a multicenter, randomized trial of edifoligide for the prevention of vein graft failure in lower extremity bypass surgery. Journal of Vascular Surgery. 43, 742-751 (2006).
- Yu, P., Nguyen, B. T., Tao, M., Bai, Y., Ozaki, C. K. Mouse vein graft hemodynamic manipulations to enhance experimental utility. The American Journal of Pathology. 178, 2910-2919 (2011).
- Davies, M. G., Hagen, P. O. Reprinted article "Pathophysiology of vein graft failure: a review". European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 42, Suppl 1. S19-S29 (2011).
- Berard, X., et al. Role of hemodynamic forces in the ex vivo arterialization of human saphenous veins. Journal of Vascular Surgery. 57, 1371-1382 (2013).
- Vijayan, V., et al. Long-term reduction of medial and intimal thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable external sheath. Journal of Vascular Surgery. 40, 1011-1019 (2004).
- Jeremy, J. Y., et al. On the biology of saphenous vein grafts fitted with external synthetic sheaths and stents. Biomaterials. 28, 895-908 (2007).
- Zilla, P., et al. Constrictive external nitinol meshes inhibit vein graft intimal hyperplasia in nonhuman primates. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, 717-725 (2008).
- Zilla, P., et al. Utilization of shape memory in external vein-graft meshes allows extreme diameter constriction for suppressing intimal hyperplasia: a non-human primate study. Journal of Vascular Surgery. 49, 1532-1542 (2009).
- Yeoman, M. S., et al. A constitutive model for the warp-weft coupled non-linear behavior of knitted biomedical textiles. Biomaterials. 31, 8484-8493 (2010).
- Longchamp, A., et al. The use of external mesh reinforcement to reduce intimal hyperplasia and preserve the structure of human saphenous veins. Biomaterials. 35, 2588-2599 (2014).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 45, 50-59 (2010).
- Dubuis, C., et al. Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins. The Journal of pharmacology and experimental. 347, 574-581 (2013).
- Deglise, S., et al. Increased connexin43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia. Journal of Vascular Surgery. 41, 1043-1052 (2005).
- Muto, A., Model, L., Ziegler, K., Eghbalieh, S. D., Dardik, A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circulation Journal : Official Journal of the Japanese Circulation Society. 74, 1501-1512 (2010).
- Tao, M., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. The American Journal of Pathology. 182, 277-287 (2013).
- Berard, X., et al. Salvage treatment for venous aneurysm complicating vascular access arteriovenous fistula: use of an exoprosthesis to reinforce the vein after aneurysmorrhaphy. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery : the Official Journal of the European Society for Vascular Surgery. 40, 100-106 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
