Visualiseren Non-lytische Exocytosis van Cryptococcus neoformans Van Macrofagen behulp Digital Light Microscopy

Summary

We beschrijven hoe om te visualiseren macrophage- C. neoformans (Cn) interacties in real time, met bijzondere nadruk op het proces van niet-lytische exocytose middels digitale lichtmicroscopie. Met deze techniek individueel geïnfecteerde macrofagen kunnen worden bestudeerd om verschillende aspecten van dit verschijnsel bepalen.

Abstract

Veel aspecten van de infectie van macrofagen door Cryptococcus neoformans zijn uitgebreid onderzocht en goed gedefinieerd. Echter, een specifieke interactie die niet duidelijk wordt begrepen non-lytische exocytose. In dit proces worden gistcellen in de extracellulaire ruimte vrijgemaakt door een slecht begrepen mechanisme dat zowel de macrofaag en Cn levensvatbare bladeren. Hier beschrijven we hoe een groot aantal individueel geïnfecteerde macrofagen volgen een 24 uur infectie periode van tijd verstreken microscopie. Geïnfecteerde macrofagen zijn ondergebracht in een droogstoof met een CO ₂ atmosfeer bevestigd aan een microscoop die onder dezelfde voorwaarden als een celcultuur incubator biedt. Levende digitale microscopie kan informatie over de dynamische interacties tussen een gastheer en ziekteverwekker die niet beschikbaar is in statische beelden te leveren. Het kunnen elke geïnfecteerde cel visualiseren kan aanwijzingen geven hoe macrofagen behandelen schimmelinfecties, en vice versa. Deze techniek isa krachtig instrument in de dynamiek die achter een complex fenomeen te bestuderen.

Introduction

De fasen van een schimmelinfectie tussen cryptococcal cellen en macrofagen zijn goed gedocumenteerd ^1-3. Na gistcellen worden opgenomen door macrofagen, kan een verscheidenheid aan interacties optreden: de macrofaag kan lyseren vrijgeven zijn fungale lading in de extracellulaire ruimte, of het kan de besmetting te bestrijden door hem de gistcellen binnen de grenzen van de cellulaire membraan ^4. Echter, enkele jaren geleden een nieuwe resultaat is beschreven onafhankelijk door twee groepen: niet-lytische exocytose, een werkwijze waarbij een macrofaag uitgewist sommige of alle cryptokokkeninfecties cellen in het omringende milieu of een naburige cel en zowel de gastheer en pathogeen blijven levensvatbaar ^{5 -8.} Verschillende studies hebben geprobeerd om de moleculaire mechanismen achter deze interactie te begrijpen, maar we nog steeds hebben niet een volledige greep op wat drijft dit fenomeen.

De mogelijkheid om beelden in real-time vastleggen en dan vervolgens meerdere infecteren analyserened macrofagen maakt het mogelijk om veel vragen over de fysische eigenschappen omringende niet-lytische exocytose met betrekking tot de timing, de ruimtelijke capaciteit, veranderingen in morfologie en zelfs stress van macrofagen tijdens een schimmelinfectie te beantwoorden. Doordat de cellen worden gehuisvest in een omgeving die vergelijkbaar is met die van een incubator, kunnen we de dynamische aard van macrofaag-schimmel cel interacties blik. Onderzoekers hebben deze techniek gebruikt om diverse onderdelen van dit proces te bestuderen. De rol van de phagosome hierbij is duidelijk gemaakt met fluorescerende kleuring en actine blokkers ^9, terwijl een andere groep gebruikt deze methode aan te tonen dat de niet-lytische exocytose werd geblokkeerd in cellen die had WASH kiemvormende eiwitdomeinen geschrapt ^10. Het effect van cytokine signalering is ook vastgesteld met behulp van real-time microscopie ^11. Deze werkwijze is niet beperkt tot C. neoformans zoals ook werd waargenomen met Candida albicans, another schimmelpathogeen dat de mogelijkheid om macrofagen infecteren ¹² heeft. Deze bevindingen zijn voorbeelden van hoe deze methode een schat aan informatie kan verstrekken aan een gebied dat we zo weinig weten.

Protocol

Alle dierlijke werk werd gedaan in overeenstemming met de voorschriften en richtlijnen van het Institute for Animal Studies aan Albert Einstein College of Medicine.

1 Groei Voorwaarden van C. neoformans H99 (serotype A)

1. Grow individuele C. neoformans (Cn) kolonies op Sabouraud agar platen.
2. Een dag voorafgaand aan het experiment, selecteer een kolonie en te enten 10 ml Sabouraudvloeistof.
3. Laat kweek overnacht groeien bij 37 ° C schudden met een snelheid van 250 rpm.

2 Isolatie en vervaardiging van primaire Bone macrofagen van C57 / Bl6 Muizen

1. Euthanaseren muizen door het plaatsen van dieren in een CO ₂ kamer totdat niet meer ademen. Als tweede maatregel, cervicaal ontwrichten de nek voor het begin van dissectie. Steriliseren hele lichaam met 70% ethanol.
2. Verwijder beide dijbenen en scheenbeen en plaats botten in steriele DMEM.
3. Verwijder overtollig weefsel en spieren met behulp van devoud doekjes totdat botten zijn volledig schoon.
4. Plaats alleen intacte botten in een petrischaal met 70% ethylalcohol en incubeer gedurende 3 min voor geassocieerde micro-organismen te doden. Verwijder de botten en plaats in petrischaal met steriele DMEM.
5. Gesneden uiteinden van de botten voorzichtig. Houd bot over een lege 50 ml conische buis op ijs geplaatst en zorgvuldig spoelen 10 ml koud DMEM met een 25 G naald door elk been.
   OPMERKING: Elke muis zal 4 botten (2 dijbenen, scheenbenen 2) opleveren. Daarom moet men muis ongeveer 40 ml celsuspensie verkregen.
6. Centrifugeer celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 10 min bij 650 x g.
7. Gedurende deze centrifugatie bereiden en filter gesteriliseerd beenmerg macrofagen toevoeren media bestaande uit DMEM gesupplementeerd met 20% L929, 10% foetaal kalfsserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-Glutamine , 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% 2-Mercaptoethanol.
8. Hersuspendeer resulterende pellet met 10 ml van het voeden van de media. Pass cel suspension door een 70 micrometer cel zeef om celklonten verstoren en verwijder grof vuil.
9. Plaat 1 ml celsuspensie in 10 ml van het voeden van de media in Petri-schalen die zijn opgegeven voor weefselkweek gebruik (voor een totaal van 10 platen).
10. Laat cellen hechten bij 37 ° C met 10% _CO2. Voeg 5 ml verse voeding media op dag 3 Op dag 7, volledig vervangen van de voeding media en macrofagen zijn klaar om te worden gebruikt.
11. De dag voorafgaand aan het experiment, los macrofagen uit plaat door het verwijderen van het voeden van de media en voeg 5 ml van een zachte cel strippen reagens tot het bord.
12. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C en macrofagen schaffen voorzichtig pipetteren.
13. Pellet cellen door centrifugatie bij 650 xg gedurende 10 minuten.
14. Resuspendeer pellet in 1 ml van het voeden van de media. Met een 1:20 verdunning, bereken de concentratie van macrofagen door pipetteren 10 ui celsuspensie op een hemocytometer.
15. Met behulp van 14 mm glazen bodem petrischaaltjes, plaat eenconcentratie van 1 x 10 ⁵ macrofagen rechtstreeks op het binnenoppervlak vormt waarvan maximaal 200 gl houdt, zodat voorzichtigheid om deze hoeveelheid niet overschrijden zoals getoond in figuur 4.
16. Laat de cellen hechten aan de glazen petrischaal door het plaatsen van de vaat in een 37 ° C incubator gedurende 1 uur.
17. Voeg 1-2 ml voeden medium aangevuld met LPS op 1 mg / ml en IFNg bij 500 u / ml en laat cellen overnacht geïncubeerd.

3 co-incubatie van Primaire muizenmacrofagen en C. neoformans

1. Op de dag van het experiment, verwijdert 1 ml overnacht kweek geïnoculeerd en pellet gistcellen door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 420 x g.
2. Was de cellen 3 maal met steriel PBS tot media-en extracellulaire cryptococcal producten te verwijderen, zoals de polysaccharide glucuronoxylomannan (GXM) met de snelheid en de tijd hierboven vermeld.
3. Resuspendeer celpellet in 1 ml steriel PBS en een 1: 100 verdunning. Pipetteer 10 ul tverdunning hij op een hemocytometer en tel cellen. Voeg gistcellen een MOI van 1: 5. Bijvoorbeeld, als er 1 x 10 ⁵ macrofagen / putje, maak een celsuspensie van 5 x 10 ⁶ / ml Cn en voeg 100 ul van deze oplossing voor een totaal van 5 x 10 ⁵ Cn.
4. Voeg berekende volume cryptococcus celsuspensie 1 ml voeden media met de mAb 18B7 antilichaam bij een concentratie van 10 ug / ml. Incubeer celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
5. Verwijder invoeren vanuit glazen bodem petrischaal en was 1x met steriele PBS. Voeg 100 ul van opsonized Cn direct goed.
6. Laat cellen geïncubeerd gedurende 2 uur bij 37 ° C met 10% _CO2.
7. Na co-incubatie, controleren door de microscoop dat macrofagen Cn hebben geïnternaliseerd. Om in aanmerking geïnternaliseerd moeten cryptococcal cellen duidelijk te zien binnen de grenzen van de macrofaag.
8. Was de petrischaal 3x met steriel PBS om alle extracellula verwijderenr Cn.
9. Voeg 1-2 ml van het voeden van de media, zonder de toevoeging van mAb 18B7, en het opzetten van de microscoop.

4 Visualiseren Non-lytische Exocytosis in Real-time gebruik te maken van Digital Light Microscopy

OPMERKING: Om deze experimenten uit te voeren, een microscoop die wordt geleverd met een bijgevoegd incubatie kamer die CO ₂ levering en de verwarming is vereist omvat.

1. Voorafgaand aan het experiment, pre-warm het incuberen kamer gedurende ten minste 30 min tot 37 ° C. Controleer of de CO ₂ uitleest 5% bij aanvang van de proef.
2. Plaats glazen bodem petrischaal op microscoop platform, dek af met CO ₂ deksel, en sluit alle deuren om geen warmte ontsnapt verzekeren.
3. Met behulp van de 10x doelstelling met de microscoop in fase contrast, focus op een duidelijk gebied van geïnfecteerde macrofagen. Op basis van het experiment, bepalen de doelstelling door het aantal macrofagen moeten worden bestudeerd.
4. Opgezet microscoop software om take een afbeelding om de 4 min voor een 24-uurs periode.
5. Na 24 uur wordt het experiment voltooiing hebben bereikt en een totaal van 361 beelden zullen zijn verzameld. Deze beelden exporteren als .jpegs op een 5% compressie. Met behulp Afbeelding J software, beelden bekijken als een Visual Stack op 5 beelden per sec. Als de film moet worden bekeken voor publicatie of een presentatie, sla het op als ofwel een AVI of MOV-bestand, afhankelijk van welk formaat het beste werkt voor de kijker.

Results

De beelden die deze techniek levert kan op verschillende manieren informatie omringende wat er na cellen C. hebben gefagocyteerd verzamelen geanalyseerd neoformans. Zoals te zien in figuur 1, zijn er ongeveer 100 macrofagen die ofwel of geen infectie. Elk van deze macrofagen geeft de kijker de kans om gastheer-pathogeen interacties te bestuderen op een zeer microscopisch niveau. Zoals figuren 2 en 3 tonen, zijn er verschillende uitkomsten die kan voork...

Discussion

Hier hebben wij een werkwijze waarmee schimmel-macrofaag interacties kunnen worden opgenomen en in real time geanalyseerd gedurende een periode van 24 uur beschreven. Ons laboratorium heeft dit protocol gebruikt om veel van de temporele aspecten van niet-lytische exocytose bestuderen en blijft real-time microscopie om de morfologische componenten die dit proces omringen bepalen.

Voor deze techniek om ideale resultaten op, moet speciale aandacht worden besteed aan bepaalde stappen in het prot...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum (FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxisch
3003 Tissue Culture Petri Dishes	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commercieel antilichaam geproduceerd in ons lab
Axiovert 200M Microscoop met incubatiekamer	Zeiss