Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen

13.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52085

⸱

21 december 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest University Health Sciences, 2The Ritchie Centre, Monash Institute of Medical Research, Monash University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol om humane amnion-epitheelcellen (hAEC's) te isoleren en te kweken met behulp van dierlijk productvrije reagentia in overeenstemming met de richtlijnen voor goede fabricagepraktijken (cGMP).

Samenvatting

Epifysaire cellen uit het menselijke amnion (hAECs) die zijn afgeleid van term of pre-term amnionmembranen hebben de aandacht getrokken van onderzoekers en clinici als een potentiële bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde. De reden voor deze interesse is het bewijs dat deze cellen een zeer multipotent differentiatie-vermogen, lage immunogeniciteit en ontstekingsremmende functies hebben. Deze eigenschappen hebben onderzoekers ertoe aangezet om het potentieel van hAECs te onderzoeken voor het behandelen van een verscheidenheid aan ziekten en aandoeningen in preklinische dierstudies met veel succes.

hAECs hebben een brede toepassing gevonden voor de behandeling van een reeks ziekten en aandoeningen. Potentiële klinische toepassingen van hAECs omvatten de behandeling van beroerte, multiple sclerose, leverziekte, diabetes en chronische en acute longziekten. Het doorgaan van preklinische dierstudies naar klinische onderzoeken vereist een hogere standaard van kwaliteitscontrole en veiligheid voor celtherapieproducten. Voor veiligheid en kwaliteitscontrole is het de voorkeur dat celisolatieprotocollen dierproefvrije reagentia gebruiken.

We hebben protocollen ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen hAECs te isoleren, cryobewaren en te kweken met behulp van dierproefvrije reagentia. Het voordeel van deze methode is dat deze cellen kunnen worden geïsoleerd, gekarakteriseerd, cryobewaard en gekweekt zonder het risico om potentieel schadelijke dierlijke pathogenen aan mensen te leveren, terwijl geschikte celopbrengsten, levensvatbaarheden en groeipotentieel worden gehandhaafd. Voor onderzoekers die overgaan van preklinische dierstudies naar klinische onderzoeken, zullen deze methodologieën de snellere goedkeuring door de regelgevende instanties aanzienlijk versnellen, de risico's verminderen en de kwaliteit van hun therapeutische celpopulatie verbeteren.

Inleiding

Cellen afkomstig van perinatale bronnen, zoals de placenta, placentamembranen, navelstreng en vruchtwater zijn aandacht van wetenschappers en artsen aangetrokken als een potentiële bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. De reden voor deze belangstelling is dat deze celtypen bezitten allemaal een zekere mate van plasticiteit en immunomodulerende capaciteit 3, eigenschappen die essentieel zijn voor de mogelijke therapeutische toepassingen.

hAECs zijn een heterogene populatie epitheliale die kunnen worden ontleend term of premature amnion membraan 4, die een rijke potentiële bron van regeneratieve celmateriaal. De eigenschappen die hAECs aantrekkelijk als een cellulaire therapie te maken onder hun multipotentie, lage immunogeniciteit, en anti-inflammatoire eigenschappen. hAECs gevonden zeer multipotente zowel in vitro als in vivo kunnen differentiëren tot mesodermale lineages is (cardiomyocytes, myocytes, osteocyten, adipocyten), endodermale geslachten (pancreas cellen, levercellen, longcellen) en ectodermale geslachten (haar, huid, neurale cellen en astrocyten) 5-10.

Geruststellend, ondanks hun multipotent hAECs lijken niet beide vormen tumoren of bevorderen de ontwikkeling van tumoren in vivo. Verder hAECs zijn ook immuun bevoorrecht, uiten lage niveaus van klasse II menselijke leukocyten antigenen (HLAs) 8. Deze eigenschap waarschijnlijk ten grondslag vertrouwde afstoting omzeilen na allogene en xenogene transplantatie, zoals aangetoond in onderzoeken met immuuncompetente apen, konijnen, cavia's, ratten en varkens 11-13. hAECs geven krachtige immunomodulerende en immunosuppressieve eigenschappen en bieden daarmee belangrijke praktische voordelen voor potentiële klinische toepassingen in de auto-immuunziekte therapie. hAECs worden verondersteld immunomodulerende functie uit te oefenen op zowel het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Ope van de mechanismen gesuggereerd is door de afscheiding van immunomodulerende factoren 14.

Momenteel houdt hAECs in preklinische dierlijke ziektemodellen omvatten de behandeling van een beroerte, multiple sclerose, leverziekte, diabetes en chronische en acute longziekten. Onderzoekers hebben interesse getoond in het gebruik hAECs om na een beroerte ontsteking van de hersenen te behandelen vanwege hun unieke eigenschappen. Er is bewijs dat hAECs de bloed-hersenbarrière, waar ze kunnen engraft kunnen oversteken, overleven voor maximaal 60 dagen, differentiëren in neuronen, ontsteking te verminderen en het bevorderen van de regeneratie van beschadigde centrale zenuwstelsel weefsel in diermodellen van neurologische aandoeningen 15.

hAECs bieden de mogelijkheid te richten en reverse meerdere pathologische trajecten die bijdragen aan de ontwikkeling en progressie van multiple sclerose. Bijvoorbeeld, het gevolg is van preklinische dierstudies suggereren dat hAECs sterk immunosuppressieve enkan mogelijk perifere immuun tolerantie induceren en achteruit lopend ontstekingsreacties. hAECs hebben ook aangetoond dat het vermogen om te differentiëren tot neurale cellen in vivo en versterken endogene neuroregeneratie door de afscheiding van een breed scala van neurotrofe factoren 16 hebben.

Menselijke en knaagdieren amnion epitheelcellen hebben hun therapeutische werkzaamheid aangetoond voor de behandeling van leverziekte bij diermodellen. In een tetrachloorkoolstof schade inductie model van leverziekte, HAEC transplantatie leiden tot innesteling van levensvatbare hAECs in de lever, gepaard met verminderde hepatocyt apoptose en verminderde hepatische inflammatie en fibrose 17.

hAECs kunnen worden gestimuleerd om uitgedrukt alvleesklier factoren, waaronder insuline en glucose-transporters. Verschillende studies hebben het potentieel onderzocht voor hAECs om de bloedsuikerspiegel te herstellen in diabetische muizen 18. In muizen diehAECs zowel dierlijk lichaamsgewicht en bloedsuikerspiegel daalde tot normale niveaus na injectie van cellen. Deze studies vormen een krachtig argument voor het gebruik van hAECs voor de behandeling van diabetes mellitus.

hAECs een bewezen rol bij het ​​voorkomen en herstellen van experimentele acute en chronische longschade in zowel volwassen en neonatale modellen 19. Deze studies gevonden dat hAECs differentiëren in vitro in functionele longepitheelcellen expressie meerdere long geassocieerde eiwitten, waaronder Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), het ionkanaal dat mutaties in patiënten met cystische fibrose 20. Bovendien, wanneer hAECs worden geleverd aan de gewonde volwassen en neonatale long-, ze oefenen hun herstellende effecten via de modulatie van gastheer immuuncellen, het verminderen van pulmonale leukocyten werving, waaronder neutrofielen, macrofagen en lymfocyten 21-23.

Gezien hun overvloed,veiligheid record, en bewezen klinische toepassingen voor meerdere ziekten, klinische studies met behulp van hAECs is onvermijdelijk. Met als doel het versnellen van de vertaling van HAEC therapieën in de klinische-trials, ontwikkelden we methoden om te isoleren, cryopreserve en cultuur hAECs op een wijze die geschikt is voor klinische studies, met behulp van dierlijk product-vrije reagentia in overeenstemming met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) richtlijnen .

Dit protocol is gebaseerd een eerder gepubliceerde protocol dat we met succes werden gebruikt om hAECs te isoleren met behulp van dierlijke reagentia 6. We veranderde de oorspronkelijke protocol om dierlijke producten te vervangen door dierlijk product-vrije reagentia, en de daaropvolgende optimalisatie werd uitgevoerd om celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid te optimaliseren. Ons doel was om een ​​protocol dat zou voldoen aan de wettelijke normen voor mobiele productie voor menselijke klinische proeven te ontwikkelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: placenta moet worden verzameld van singleton gezonde zwangerschappen, met een voorkeur voor de term electieve keizersneden. Geschreven, moet toestemming worden gegeven voor het verzamelen van de placenta. Uw relevante menselijke ethische toetsingscommissie moet goedkeuring hele verzameling en het gebruik van menselijke weefsels.

1. Isolatie van Amnion epitheelcellen

  1. Leg de placenta op een steriel oppervlak binnen een klasse II bioveiligheidskast.
  2. Met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), wassen zoveel mogelijk bloed uit de placenta oppervlak en membranen.
  3. Met de placenta geplaatst met de navelstreng omhoog mechanisch scheiden de buitenrand van het amnion en chorion membranen.
  4. Eenmaal gescheiden, handmatig amnion membraan strippen van het chorion membraan van de placenta, werken rond de rand van het membraan, naar de navelstreng.
    LET OP: Wees careful om alle stukken van vervuilende chorion membraan van het amnion te verwijderen.
  5. Met behulp van een steriele schaar, knip de amnion membraan ongeveer 2 cm vanaf de basis van de navelstreng en plaats in een 500 ml verzegelde container met 250 ml HBSS.
  6. Grondig wassen door het schudden van de verzegelde fles met het amnion membraan.
  7. Verwijder de amnion membraan uit de collectie container met behulp van een steriel pincet, en plaats in een 15 cm petrischaal.
  8. Snijd de amnion membraan in stukken van ongeveer 5 cm lang (als verticaal wordt gehouden met een pincet), waarbij bloederige of gescheurde stukken.
  9. Plaats in een 500 ml verzegelde container en wassen met 250 ml HBSS ongeveer 3-5 keer of totdat de amnion membraan wordt doorzichtig zonder vervuilende bloed.
    OPMERKING: Als er bloed aanwezig is kan de efficiëntie van de enzymatische verminderen verteren oplossing.
  10. Transfer alle stukken van amnion membraan in een container met 50 ml van de enzymatische verteren oplossing, en zorg ervoor datminimaliseren overdracht van HBSS.
  11. Incubeer de amnion stukken op enzymatische vertering oplossing in een waterbad of warme kamer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden om alle resterende bloed te verwijderen.
  12. Verwijder de amnion membraan stukken uit de enzymatische verteren oplossing in een nieuwe steriele container.
  13. Voeg 100 ml vers enzymatische verteren oplossing voor het amnion membraan en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten in een waterbad of een warme kamer met zacht schudden (eerste spijsvertering).
  14. Verwijder de amnion membraan stukken en plaats in de nieuwe container verzorgen zodat de enzymatische verteren oplossing kan afvloeien van elk stuk membraan.
    Opmerking: Dit kan worden bereikt door te slepen amnion stukken langs de binnenrand van de houder.
  15. Voeg 100 ml vers enzymatische verteren oplossing voor het amnion membraan stukken en incubeer 60 minuten in een waterbad of een warme kamer bij 37 ° C onder zacht schudden (tweede spijsvertering).
  16. Passeer de cel suspensiverder vanaf stap 1.14 door een 70 urn filter en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min.
  17. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in 4 ml HBSS dat 1 mg / ml soja gebaseerde remmer. Voorzichtig pipet herhaaldelijk met een pipet 1 ml om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen.
    Opmerking: In dit stadium kunnen de cellen worden op ijs gelaten totdat de cellen van de tweede digest zijn in hetzelfde stadium van bewerking.
  18. Verwijder de amnion membraan stukken en plaats in de nieuwe container verzorgen zodat de enzymatische verteren oplossing kan afvloeien van elk stuk membraan.
    Opmerking: Dit kan worden bereikt door te slepen amnion stukken langs de binnenrand van de houder.
  19. Leid de celsuspensie uit stap 1.18 door een 70 urn filter en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min.
  20. Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in 4 ml HBSS dat 1 mg / ml soja gebaseerde remmer. Zachtjes pipet herhaaldelijk met een 1 ml pipette een enkele celsuspensie te verkrijgen.
  21. Pool cellen van de twee verteert of als alternatief te houden cel verteert gescheiden tot na-tellingen.
    LET OP: Dit voorkomt het mengen van potentieel lage levensvatbaarheid van cellen met hoge levensvatbaarheid cellen.
  22. Voeg HBSS tot een eindvolume van 10-20 ml en uitvoeren celtellingen met trypan blauw levensvatbaarheid meten.
  23. Bevestig de epitheelcellen fenotype door flowcytometrie. Vul geschikte antilichaam cocktail met anti-EpCAM-PE (1: 2 verdunning) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) en anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS.
  24. Resuspendeer een subset van cellen van een of beide digesten in het antilichaam cocktail in een concentratie van 25 x 10 6 cellen / ml.
  25. Voor flowcytometrie, beits 1 x 10 6 cellen met antilichaam cocktails met isotypecontroles (bijv. IgG 1 isotypecontrole-PE + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Houd ~ 1 x 10 6 cellen ongekleurd voor doorstroomcytometer set-up.
  26. Incubeer cellen in antilichaamcocktails bij 4 ° C gedurende 60 min.
  27. Was de cellen 3x in HBSS en resuspendeer in 5-10.000.000 cellen per ml voor flowcytometrie.
  28. Voeren flowcytometrie en noot resultaten. De zuiverheid van de cel isolaat (het percentage positieve EpCAM en CD90 / CD105 negatieve cellen) zou 90-95% en <1% respectievelijk.
  29. Vernietiging van een geschikt aantal cellen voor het testen voor een passende kwaliteitscontrole of vrijlating criteria zoals bepaald door de uiteindelijke toepassing.
    LET OP: Dit kan onder meer de ziekte / virale screening, of andere veiligheid of biologische criteria.
  30. Voor de resterende cellen, volg de cryopreservatieprotocol, of als alternatief te plaatsen rechtstreeks in de cultuur (direct naar de cultuur stap 3.6).

2. cryopreservatie van hAECs

  1. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid behulp van flowcytometrie gegevens of handmatige telling met trypanblauwexclusie.
  2. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten.
  3. Resuspendeer cels in de klasse 1-10 miljoen cellen per ml in dierlijk product-vrije cryopreservatie media.
  4. Pipetteer een geschikte hoeveelheid van cellen in O-ringen cryopreservatie flacons en plaats in een geregelde snelheid invriesapparaat wanneer afkoeling plaatsvindt bij ongeveer 1 ° C / min tot -80 ° C wordt bereikt.
  5. Transfer flacons in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

3. Ontdooien en Cultuur van Cyropreserved hAECs

  1. Verwijder cryopreservatie flacons uit vloeibare stikstof en plaats op ijs.
    OPMERKING: Voor de overdracht alleen - ga snel naar de volgende stap.
  2. Ontdooi de cryopreservatie flesjes snel bij 37 ° C totdat er slechts een klein stukje (~ 5 mm x 5 mm) ijs blijft.
    Opmerking: Het is belangrijk dat de celoplossing niet warm in de cryopreservatie media de toxische effecten van DMSO verminderen.
  3. Verdun cryopreservatie medium 10-voudig met koude (~ 4 ° C) serumvrij medium, druppelsgewijs toegevoegd in een geschikte grootted buis of container.
  4. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Resuspendeer in serumvrij medium, met een geschatte concentratie van 1 miljoen cellen per ml. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van geautomatiseerde of handmatige telling met trypanblauwexclusie. Verwachte levensvatbaarheid post-dooi zal 5-10% minder dan vooraf cryopreservatie levensvatbaarheid zijn.
  6. Plaat cellen op standaard celcultuur behandeld plastic waren, of als alternatief te gebruiken type I collageen om de vacht van cultuur oppervlakken.
  7. Type I collageen coating volg onderstaande protocol
    1. Bereid zuur oplosbaar type I collageen uit humane placenta (15 mg collageen met 25 ml gedeïoniseerd water en 50 ul ijsazijn).
    2. Dek bekerglas met Parafilm en roer matig bij 37 ° C totdat collageenvezels worden opgelost.
    3. Filtreer steriel collageenoplossing met een 0,22 urn filter.
    4. Verdun de gefilterde collageen voorraad 01:10 met gedemineraliseerd water. Deze verdunde voorraad is de werkende concentration oplossing voor het coaten van kunststof en membraanoppervlakken.
    5. Collageen laag plastic, glas en membraanoppervlakken 2 uur bij kamertemperatuur bij 37 ° C of O / N bij 2-8 ° C.
    6. Verwijder overtollig vocht uit het gecoate oppervlak, en laat ze drogen O / N.
    7. Spoelen met steriele weefselkweek kwaliteit water of HBSS vóór de invoering van de cellen en medium.
  8. Plate hAECs bij een dichtheid van 25.000 cellen / cm2 in serumvrij medium, en laat bevestiging optreden 72-96 uur.
  9. Na bevestiging, veranderen media door voorzichtig opzuigen en vervangen met een geschikt volume van serumvrij medium elke 2-3 dagen.
  10. Passage cellen met behulp van de onderstaande protocol
    1. Zuig celcultuurmedia en wassen met 1x volume van steriele HBSS
    2. Voeg 1x volume enzymatische analyseoplossing en incubeer gedurende 5-15 min of totdat cellen waargenomen loskomen van de celkweek oppervlak.
    3. Verzamel enzymatische verteren oplossing bevattende cellen, zorgen cells worden losgemaakt van de celkweek oppervlak door herhaaldelijk pipetteren de enzymatische analyseoplossing tegen de celkweek oppervlak
    4. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten.
    5. Resuspendeer de celpellet in een geschikt volume van HBSS dat 1 mg / ml soja gebaseerde remmer. Voorzichtig pipet herhaaldelijk met een 1 ml pipet om een ​​enkele celsuspensie te verkrijgen.
    6. Voeg serumvrij medium tot een concentratie van ongeveer 1.000.000 cellen / ml. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van geautomatiseerde of handmatige telling met trypanblauwexclusie.
    7. Plate hAECs bij een dichtheid van 25.000 cellen / cm2 in serumvrij medium, en verder met standaard kweekmethoden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wanneer deze procedure correct wordt nageleefd, moet een gemiddelde opbrengst van 120 miljoen hAECs worden verwacht, met een typische reeks 80-160,000,000 cellen. Uit deze rendementen kan een gemiddelde levensvatbaarheid van 83 ± 4% worden verwacht. De toegenomen gemiddelde opbrengst en iets lager levensvatbaarheid klinische methode kan door hogere trypsine activiteit dan de dierlijke producten, en misschien ook door het ontbreken van serumeiwitten. Geïsoleerde hAECs hebben een gemiddelde celoppervlak profiel van 92% Ep...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn een aantal kritische parameters die een aanzienlijke invloed op het succes van deze methode kan hebben. Opslag van de placenta of amnion tot 3 uur voor isolatie van hAECs wenselijk logistieke planning of doeleinden, maar het wordt aanbevolen dat de weefsels zo snel mogelijk verwerkt. Als weefsel moet worden opgeslagen, is het raadzaam dat de opslag worden uitgevoerd na dissectie en wassen van de amnion membraan. Amnion kunnen worden opgeslagen in steriele HBSS dat antibiotica bij 4 ° C, maar cellevensvatbaarheid...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de financiële steun van het Operational Infrastructure Support Program van de regering van Victoria.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Collectiekit
SchilladebakjeFisher Scientific13-361B
Liberty Dressingtang, puntig 13 cmFisher ScientificS17329 
Schaar - Scherp/Blunt RechtstreeksFisher ScientificNC0562592 
Steriele latexhandschoenen Fisher Scientific19-014-643 
Beschermende kleding
Beschermende kleding (jas)U-lineS-15374-M
IsolatiejazenU-lineS-15374-M
Steriele latexhandschoenen Fisher Scientific19-014-643 
GebruiksmaskerCardinal HealthAT7511
BonnetjesMedlineCRI1001
SchoenovertrekkenU-lineS-7873W
Media en reagentia
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)Life Technologies14175095zonder calcium of magnesium
TrypZean (dierlijk product-vrij recombinant trypsine)Sigma AldrichT3449
Sojaboon Trypsine Inhibitor  1g/50mLSigma AldrichT6522
Cryostor CS5BioLife Solutions205102
Trypan blauw reagensLife Technologies15250-061
Anti-EpCam-PEMiltenyi Biotec130 - 091-253
PE-isotype controlMiltenyi Biotec130-098-845
Anti-CD90-PeCy5BD Pharmingen555597
PeCy5-isotype controlBD Pharmingen557224
Anti-CD105-APCBD Pharmingen562408
APC-isotype controlBD Pharmingen340754
Collageen Type VISigma AldrichC7521
Verbruiksartikelen
50 ml graduele pipetBD/Falcon356550
10 ml graduele pipetBD/Falcon356551
5 ml graduele pipetBD/Falcon356543
50 ml Falcon buizenBD/Falcon352070
15 ml Falcon buizenBD/Falcon352096
15 cm Petri schotelsCorning351058
70 μm filtersBD/Falcon352350
0.22 μm filtersMilliporeSLGV033RS
1 ml PipetpuntenFisherbrand02-707-401
200 μl PipetpuntenFisherbrand02-707-409
20 ml SpuitBD/Medical309661
Kunststof spatelFisher Scientific14-245-97 
Kunststof weegschaalFisher Scientific02-202-102 
Cryo vialsNunc377267
Apparatuur
Mr FrostyFisher ScientificA451-4 
Biogevaarkas

Referenties

  1. Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
  2. Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
  3. Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
  4. Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
  5. Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
  6. Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3(2007).
  7. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6(2010).
  8. Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
  9. Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
  10. Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
  11. Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
  12. Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
  13. Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
  14. Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
  15. Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
  16. Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
  17. Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631(2012).
  18. Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
  19. Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
  20. Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533(2012).
  21. Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
  22. Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763(2012).
  23. Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
  24. Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
  25. Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
  26. Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
  27. Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Isolatie van het vliezige vliesdierproductvrije reagentiaflowcytometrische analysecryopreservatieprotocolcelkweektechniekenzymatische digestiemethodefiltratie van weefselsuspensielevensvatbaarheidsbeoordeling
Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.