Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Samenvatting

Gist-eiwitopathiemodellen zijn waardevolle instrumenten om de toxiciteit en aggregatie van eiwitten die betrokken zijn bij ziekten te beoordelen. Hier presenteren we methoden voor het screenen van Hsp104 variantenbibliotheken op toxiciteitsonderdrukkers. Dit protocol kan worden aangepast om elke eiwitbibliotheek te screenen op toxiciteitsonderdrukkers van elk eiwit dat toxisch is in gist.

Samenvatting

Veel eiwitmisvouwingaandoeningen kunnen worden gemodelleerd in de knopgistachtige Saccharomyces cerevisiae. Eiwitten zoals TDP-43 en FUS, geïmpliceerd in amyotrofe laterale sclerose, en α-synucleïne, geïmpliceerd in de ziekte van Parkinson, zijn toxisch en vormen cytoplasmatische aggregaten in gist. Deze kenmerken herhalen eiwitpathologieën die worden waargenomen bij patiënten met deze aandoeningen. Daarom zijn gisten een ideale platform voor het isoleren van toxiciteitssuppressoren uit bibliotheken van eiwitvarianten. We zijn geïnteresseerd in het toepassen van eiwitdisaggregases om misgevouwen toxische eiwitconformers te elimineren. Specifiek zijn we bezig met het ontwerpen van Hsp104, een hexameer AAA+ eiwit uit gist dat uniek in staat is om zowel ongeordende aggregaten als amyloïde stoffen op te lossen en de eiwitten terug te brengen naar hun native conformatie. Hoewel Hsp104 sterk geconserveerd is in eukaryoten en eubacteriën, heeft het geen bekende metazoan-homoloog. Hsp104 heeft slechts beperkte capaciteit om ongeordende aggregaten en amyloïde vezels, geïmpliceerd in menselijke ziekte, te elimineren. Daarom streven we ernaar Hsp104-varianten te ontwerpen om de eiwitmisvouwing geïmpliceerd in neurodegeneratieve aandoeningen om te keren. We hebben methoden ontwikkeld om grote bibliotheken van Hsp104-varianten te screenen op onderdrukking van proteotoxiciteit in gist. Aangezien gist vatbaar is voor spontane niet-specifieke onderdrukking van toxiciteit, is een tweedelige screeningsprocedure ontwikkeld om valse positieven te elimineren. Met behulp van deze methoden hebben we een reeks gepotentieerde Hsp104-varianten geïdentificeerd die de toxiciteit en aggregatie van TDP-43, FUS en α-synucleïne krachtig onderdrukken. Hier beschrijven we dit geoptimaliseerde protocol, dat kan worden aangepast om bibliotheken te screenen die zijn geconstrueerd met behulp van om het even welke eiwitbackbone voor onderdrukking van toxiciteit van om het even welke eiwit die toxisch is in gist.

Inleiding

Gist proteïnopathie modellen ontwikkeld voor eiwit misfolding aandoeningen zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS) en de ziekte (PD) ^1-3 Parkinson. Expressie van de eiwitten TDP-43 en FUS, die misfold bij ALS-patiënten, zijn giftig en mislocalize om cytoplasmatische aggregaten in gist ^1,2. Evenzo expressie van α-synucleïne (α-syn), die betrokken is bij PD, giftig en mislocalizes cytoplasmatische aggregaten in gist ^3. Deze functies recapituleren fenotypen bij patiënten met deze aandoeningen ^4,5. Zo gistmodellen een nuttig platform voor het screenen voor eiwitten of kleine moleculen die voorkomen of reverse deze fenotypes

Protocol

1. Bibliotheek Generation

1. Om bibliotheken van Hsp104 behulp domeinspecifieke fouten gevoelige PCR construeren, eerst het domein van belang met een foutgevoelige DNA polymerase ²⁰ versterken.
2. Zuiver het PCR product door gel extractie.
3. Voer een megaprimer extensie stap met een standaard plaatsgerichte mutagenese protocol: combineer 50 ng matrijs plasmide, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP's, en high-fidelity DNA polymerase in PCR buffer, en verdun tot 50 ui totaal volume met PCR kwaliteit water ²⁰ . Voer een standaard PCR-programma.
   OPMERKING: Specifieke primers zal variëren gebaseerd op de specifieke regio v....

Resultaten

We hebben een bibliotheek van Hsp104 varianten gerandomiseerd in het midden domein geconstrueerd en gescreend is voor onderdrukking van TDP-43 toxiciteit. De bibliotheek werd getransformeerd en uitgeplaat op glucose en galactose platen (figuur 2) om de stringentie van het scherm beoordelen. Enkele kolonies werden geselecteerd en de stammen werden geselecteerd teller met 5-FOA de Hsp104 plasmide elimineren. Deze stammen werden vervolgens beoordeeld dat citeit was door TDP-43 alleen, zonder Hsp104 variant.......

Discussie

Hier presenteren we onze benadering isoleren gepotentieerd Hsp104 varianten die de toxiciteit van ziekte- geassocieerde substraten met gist proteïnopathie modellen onderdrukken. Met deze benadering kunnen grote bibliotheken van varianten worden gescreend in high throughput, met als enige beperking dat het aantal varianten dat het secundaire scherm 5-FOA passen. Door deze stappen in 96 putjes, routinematig screenen we tot 200 treffers tegelijk in de 5-FOA stappen in de loop van 1-2 weken. Het aantal hits verkregen bij de.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Petri schotels	Falcon	351058
5-Fluorootzuur	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Platen	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200