Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Samenvatting

Gist-eiwitopathiemodellen zijn waardevolle instrumenten om de toxiciteit en aggregatie van eiwitten die betrokken zijn bij ziekten te beoordelen. Hier presenteren we methoden voor het screenen van Hsp104 variantenbibliotheken op toxiciteitsonderdrukkers. Dit protocol kan worden aangepast om elke eiwitbibliotheek te screenen op toxiciteitsonderdrukkers van elk eiwit dat toxisch is in gist.

Samenvatting

Veel eiwitmisvouwingaandoeningen kunnen worden gemodelleerd in de knopgistachtige Saccharomyces cerevisiae. Eiwitten zoals TDP-43 en FUS, geïmpliceerd in amyotrofe laterale sclerose, en α-synucleïne, geïmpliceerd in de ziekte van Parkinson, zijn toxisch en vormen cytoplasmatische aggregaten in gist. Deze kenmerken herhalen eiwitpathologieën die worden waargenomen bij patiënten met deze aandoeningen. Daarom zijn gisten een ideale platform voor het isoleren van toxiciteitssuppressoren uit bibliotheken van eiwitvarianten. We zijn geïnteresseerd in het toepassen van eiwitdisaggregases om misgevouwen toxische eiwitconformers te elimineren. Specifiek zijn we bezig met het ontwerpen van Hsp104, een hexameer AAA+ eiwit uit gist dat uniek in staat is om zowel ongeordende aggregaten als amyloïde stoffen op te lossen en de eiwitten terug te brengen naar hun native conformatie. Hoewel Hsp104 sterk geconserveerd is in eukaryoten en eubacteriën, heeft het geen bekende metazoan-homoloog. Hsp104 heeft slechts beperkte capaciteit om ongeordende aggregaten en amyloïde vezels, geïmpliceerd in menselijke ziekte, te elimineren. Daarom streven we ernaar Hsp104-varianten te ontwerpen om de eiwitmisvouwing geïmpliceerd in neurodegeneratieve aandoeningen om te keren. We hebben methoden ontwikkeld om grote bibliotheken van Hsp104-varianten te screenen op onderdrukking van proteotoxiciteit in gist. Aangezien gist vatbaar is voor spontane niet-specifieke onderdrukking van toxiciteit, is een tweedelige screeningsprocedure ontwikkeld om valse positieven te elimineren. Met behulp van deze methoden hebben we een reeks gepotentieerde Hsp104-varianten geïdentificeerd die de toxiciteit en aggregatie van TDP-43, FUS en α-synucleïne krachtig onderdrukken. Hier beschrijven we dit geoptimaliseerde protocol, dat kan worden aangepast om bibliotheken te screenen die zijn geconstrueerd met behulp van om het even welke eiwitbackbone voor onderdrukking van toxiciteit van om het even welke eiwit die toxisch is in gist.

Inleiding

Gist proteïnopathie modellen ontwikkeld voor eiwit misfolding aandoeningen zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS) en de ziekte (PD) ^1-3 Parkinson. Expressie van de eiwitten TDP-43 en FUS, die misfold bij ALS-patiënten, zijn giftig en mislocalize om cytoplasmatische aggregaten in gist ^1,2. Evenzo expressie van α-synucleïne (α-syn), die betrokken is bij PD, giftig en mislocalizes cytoplasmatische aggregaten in gist ^3. Deze functies recapituleren fenotypen bij patiënten met deze aandoeningen ^4,5. Zo gistmodellen een nuttig platform voor het screenen voor eiwitten of kleine moleculen die voorkomen of reverse deze fenotypes ^2,6-13. We geïnteresseerd in de ontwikkeling van eiwitten die in staat omkeren aggregatie en toxiciteit door TDP-43, FUS en α-syn zijn. Wij richten ons op Hsp104, een AAA + eiwit uit gist die uniek is in staat disaggregerende eiwitten zowel frOM amorfe aggregaten en amyloid in gist, maar het heeft geen menselijke homoloog ^14,15. Hsp104 is volledig afgestemd op endogene gist prionen disaggregeren en heeft slechts een beperkte capaciteit om substraten betrokken bij de menselijke neurodegeneratieve ziekten, die het nooit normaal tegenkomt ^16,17 disaggregeren. Zo streven we naar verbeterde versies van Hsp104 die in staat zijn om krachtdadig disaggregeren deze menselijke substraten zijn ingenieur. Om dit te doen, bouwen we grote bibliotheken van Hsp104 varianten met behulp van fouten gevoelige PCR; Deze bibliotheken kunnen worden gescreend met de gist proteïnopathie modellen ^17. We hebben een op een domein gerichte aanpak van de bouw en het screenen van bibliotheken aangenomen, als Hsp104 is zeer groot ^17. We richtte zich op de middelste domein (MD) van Hsp104 ^17, hoewel soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om andere domeinen screenen. Deze modellen stellen screening disaggregase activiteit direct tegenover alternatieve technieken zoals oppervlakte vertoning, die rustricted te gebruiken voor het bewaken binding ^18.

Ons protocol is gebaseerd op twee stappen screening (figuur 1). Eerst, Hsp104 varianten die de toxiciteit van de ziekte substraat in gist onderdrukken geselecteerd. Om dit te doen, de Hsp104 varianten en de ziekte-geassocieerde substraat worden gecotransformeerd in Δ Hsp104 gist. We maken gebruik van Δ Hsp104 gist Hsp104 sequence ruimte verkennen in de afwezigheid van wild-type (WT) Hsp104 ^17. Belangrijk is, betekent verwijdering van Hsp104 geen invloed op α-syn, FUS, of TDP-43 toxiciteit in gist, en expressie van Hsp104 ^WT geeft minimaal rescue ^1,13,17. De gist wordt daarna uitgeplaat op media induceren van expressie van beide eiwitten te induceren. Gist herbergen Hsp104 varianten die toxiciteit van de ziekte-geassocieerde substraat conferentiedeelnemers groei van de kolonie te onderdrukken. Deze varianten worden geselecteerd voor verdere analyse, terwijl kolonies behoud varianten die geen toxiciteit sterven onderdrukken. Echter,valse positieven zijn een substantieel probleem in dit scherm. Expressie van TDP-43, FUS en α-syn zeer giftig, die een sterke selectieve druk voor het optreden van spontane genetische suppressors van toxiciteit verbonden aan de Hsp104 variant gemaakt worden uitgedrukt. Aldus hebben we een tweede scherm dat relatief hoge doorzet deze niet-specifieke toxiciteit suppressors ¹⁷ elimineren gebruikt. In dit tweede scherm, worden geselecteerd gist behandeld met 5-Fluorootic Acid (5-FOA) selecteren voor de Hsp104 plasmide ¹⁹ tegen te gaan. De stammen worden vervolgens beoordeeld op het substraat (TDP-43, FUS of α-syn) toxiciteit via spotten assay dat de toxiciteit van het substraat is hersteld na verlies van de Hsp104 plasmide. Zo gist waarbij toxiciteit wordt hersteld in de secundaire screening vermoedelijk oorspronkelijk weergegeven toxiciteit onderdrukking door de aanwezigheid van de Hsp104 variant. Deze gist zijn aangewezen als 'hits' en de Hsp104 plasmide moet danhersteld en gesequenced om de mutaties in het gen Hsp104 ¹⁷ (figuur 1) geeft. Eventuele treffers dan bevestigd door het construeren van de mutatie onafhankelijk Via plaatsgerichte mutagenese en vervolgens opnieuw testen op toxiciteit onderdrukking. De mogelijke toepassingen voor dit protocol zijn breed. Met deze methoden kunnen bibliotheken van elk type proteïne worden gescreend op varianten die toxiciteit van substraat eiwit dat giftig in gist onderdrukken.

Protocol

1. Bibliotheek Generation

1. Om bibliotheken van Hsp104 behulp domeinspecifieke fouten gevoelige PCR construeren, eerst het domein van belang met een foutgevoelige DNA polymerase ²⁰ versterken.
2. Zuiver het PCR product door gel extractie.
3. Voer een megaprimer extensie stap met een standaard plaatsgerichte mutagenese protocol: combineer 50 ng matrijs plasmide, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP's, en high-fidelity DNA polymerase in PCR buffer, en verdun tot 50 ui totaal volume met PCR kwaliteit water ²⁰ . Voer een standaard PCR-programma.
   OPMERKING: Specifieke primers zal variëren gebaseerd op de specifieke regio van het gen dat moet worden geamplificeerd.
   1. Na PCR, verteren ouderlijke matrijs DNA met 1 pi Dpn I restriction enzyme 2 uur bij 37 ° C.
4. Transformeer de bibliotheek door elektroporatie of andere middelen in ultracompetente E. coli en zuiveren door miniprep.
   OPMERKING: Bibliotheek generatievarieert in hoofdzaak gebaseerd op de doelen van een bepaald experiment. Hsp104 is een zeer grote eiwitten, dus het is niet praktisch om de hele gen, dat is waarom we gebruik maken van domeinspecifieke fouten gevoelige PCR willekeurig. Bovendien blijft de structuur van Hsp104 slecht begrepen, die het ontwerp van gerichte bibliotheken uitdagende ^21. Bibliotheken kunnen worden geconstrueerd onder toepassing gerichte of willekeurige mutagenese benaderingen, met als enige beperking dat het template plasmideskelet de URA3 gen om voor 5-FOA tegenselectie op dextrose media moeten bevatten.

2. Transformatie van de Hsp104 Bibliotheek

1. Integreer de ziekte-geassocieerde substraat in W303aΔ Hsp104 gist met een standaard lithium acetaat / PEG transformatieprotocol ^22. Selecteer enkele kolonies en screenen voor toxiciteit voor een stam met een hoge toxiciteit van de ziekte geassocieerde substraat ²³ te isoleren.
   OPMERKING: Gebruik een geïntegreerd rek en isolaTé één kolonie op gelijke meningsuiting te waarborgen in alle cellen. Kloon de ziekte substraat in een plasmide die integratie van het gen onder andere omstandigheden dan uracil marker (we gebruiken histidine) en de Hsp104 bibliotheek in de pAG416GAL plasmide (uracil marker) ^24. Om voor 5-FOA counterselection, ervoor zorgen dat de bibliotheek wordt uitgedrukt vanuit een plasmide met de uracil marker. Andere giststammen kunnen worden toegepast. We hebben nota genomen van een soortgelijke toxiciteit onderdrukking fenotype behulp W303a en BY4741 giststammen in zowel WT en Δ Hsp104 achtergronden (MEJ en JS, ongepubliceerde waarnemingen).
2. Transformeer de Hsp104 bibliotheek in deze stam met dezelfde lithiumacetaat / PEG transformatieprotocol ^22. Schaal van de transformatie behoren tot de volgnummers van de bibliotheek behouden en de voorspelde bibliotheek formaat behouden.
3. Plate de transformatie mengsel op noninducing, selectieve platen (bijvoorbeeld SD-His-Ura) met genoeg borden omzorgen groei van een groot aantal kolonies. Gebruik grote petrischalen (150 mm) naar het aantal platen nodig minimaliseren. Herstellen transformanten behulp platen maakt een transformatie-efficiëntie worden beoordeeld.
4. Transformeer Hsp104 ^WT en vector negatieve controles in parallel.

3. Screening voor Onderdrukking van Proteotoxicity

1. Was de kolonies van de platen met behulp van raffinosesynthetase aangevuld dropout media (bijvoorbeeld sraff-His-Ura). Gebruik een serologische pipet en steriele houten applicators naar de koloniën los te maken van de platen. Breng de vloeistof wast in een 50 ml conische buis en vortex grondig om eventuele klonten van cellen te scheiden. Verdun tot een licht bewolkt cultuur, OD ₆₀₀ ~ 0.025.
   LET OP: Hier raffinose- dient om te verlichten de cellen van glucose-gemedieerde repressie van inductie, waardoor het vullen van de cellen voor-galactose gemedieerde inductie.
2. Groeien de verdunde cultuur overnachting in raffinose uitval media schudden bij 30 ºC. Groeien de Hsp104 ^WT en vector controles in parallel.
3. De volgende ochtend plaat een reeks concentraties op afzonderlijke galactose (bv SGal-His-Ura) platen (1 pi tot 2 ml geconcentreerd kweek in 400 ui totaal volume). Plating een breed bereik van concentraties zorgt dat een plaat enkele kolonies hebben. De feitelijke concentratie vereist hangt af van de toxiciteit van de ziekte substraat van belang.
4. Normaliseren van de vector en Hsp104 ^WT culturen de OD ₆₀₀ van de bibliotheek en de plaat gelijke volumes groei van de bibliotheek ten opzichte van de controle te vergelijken.
5. Om selectie strengheid te beoordelen, het bord van de bibliotheek op glucose (onderdrukken) media. Incubeer de platen gedurende 2-3 dagen bij 30 ° C tot kolonies verschijnen (figuur 2). Beoordeel de resulterende kolonies en te vergelijken met de controles.
   OPMERKING: vaak grote en kleine kolonies verkregen, maar geen correlatie tussen koloniegrootte en handelentiviteit wordt waargenomen. Scherm deze mogelijke treffers met een 5-FOA tegenselectie techniek (stap 4) om valse positieven naar sequencing uitgevoerd minimaliseren.

4. 5-FOA Counterselection en Spotting om valse meldingen te elimineren

1. Streak uit enkele kolonies in tweevoud op dubbele en enkele dropout media (bijvoorbeeld SD-Zijn-Ura en SD-Zijn platen) en groeien 's nachts bij 30 ºC. Herhaal dit met vector en Hsp104 ^WT controles. Uitplaten op SD-His vóór 5-FOA verhoogt de efficiëntie van de 5-FOA stap verhogen de waarschijnlijkheid dat cellen het plasmide Hsp104 zullen verloren wanneer ze worden uitgeplaat op 5-FOA.
2. Om platen niet uitdrogen, wikkel de SD-Zijn-Ura platen in parafilm en bewaar bij 4 ºC tijdens het uitvoeren van het scherm 5-FOA. Deze platen zullen uiteindelijk worden gebruikt voor sequencing.
3. Streak de kolonies van de SD-His platen enkele kolonies op 5-FOA platen (YPD medium + 1 g / l 5-FOA) en incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 &# 186; C tot enkele kolonies verschijnen. Hier, 5-FOA wordt omgezet in een toxisch product (5-fluordeoxyuridine) in cellen die de URA3 gen bevatten. Derhalve zal alle cellen nog huisvesten de Hsp104 plasmide sterven.
4. Streak de enkele kolonies van de 5-FOA platen in tweevoud op SD-Ura en SD-Zijn platen. Test 3 kolonies per raken om de waarschijnlijkheid dat ten minste één kolonie voor elke slag de Hsp104 plasmide zal verloren toenemen. Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C. Kolonies die de Hsp104 plasmide zal groeien op SD-Zijn platen maar niet SD-Ura platen hebben verloren.
5. Groeien de stammen die de Hsp104 plasmiden voor het spotten van assays hebben verloren. Groeien de stammen tot verzadiging in raffinose dropout media (bv sraff-Zijn) in 96 Deepwell 2 ml platen overnacht bij 30 ºC met schudden. Zorg ervoor dat de 5-FOA behandelde controle stammen omvatten.
6. Bereid platen voor spotten assay. Met behulp van een multichannel pipet, aliquot 200 ul raffinose dropout media (bijvoorbeeld sraff-His) perputje van een plaat met 96 putjes, reserveren kolommen 1 en 7 voor de nette kweken. Aliquot 250 ui van elk van de 16 verzadigde kweken in kolommen 1 en 7 van de plaat.
7. Serieel verdunnen culturen 5 maal in elke kolom van de plaat grondig mengen met een multichannel pipet. Verwijderen 50 ul van de verdunde kweek van de kolommen 6 en 12 tot het eindvolume van elk putje 200 pl waarborgen. Dit is essentieel om ervoor te zorgen zelfs spotten.
8. Met behulp van een 96-bout replicator gereedschap (Frogger), ter plaatse van de culturen in tweevoud op SD-Zijn en SGal-Zijn platen. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.
9. Selecteer voor sequencing stammen die toxiciteit vertonen op de SGal-His platen vergelijkbaar met die van de controles. Gooi als false positives stammen die niet zo giftig als de controles. 5-FOA is vaak giftig op zich, zodat gooi stammen die een groei defect bij SD-His platen of vertonen die aanzienlijk groter toxiciteit vertonen dan de ziekte substraat alleen ( Figuur 3).

5. Sequencing de Hsp104 Varianten door Kolonie PCR

1. Schraap ~ 10 ul gist van de SD-His-Ura platen in 3 pl 20 mM NaOH in PCR strip buizen en lyseren de cellen door vries-dooi. Plaats de strip buizen in een -80 ° C vriezer gedurende 10 minuten of in vloeibare stikstof en vervolgens incuberen bij 99 ° C in een thermocycler gedurende 10 min. Verdun de stammen tot 100 ul met PCR kwaliteit water.
2. Bereid PCR-reacties: 5 pi PCR sjabloon, 0,5 pi 100 uM van elke primer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,25 ul DNA polymerase in PCR-buffer, en vul aan tot 25 ul totaal volume met PCR kwaliteit water. Ontwerp primers aan de gerandomiseerde regio plus ongeveer 100 bp aan beide zijden versterken. Minimaliseren van de grootte van het geamplificeerde gebied om de kans op succesvolle amplificatie te verhogen. Voer een standaard PCR-programma.
3. Analyseer de monsters door agarose gelelektroforese om amplificatie van een PCR-product van de juiste Siz bevestigene. Herhaal PCR als er geen product aanwezig is.
   OPMERKING: PCR mislukking is meestal te wijten aan te veel gist wordt gebruikt in stap 5.1.
4. Bereiden monsters voor DNA sequentiebepaling. Verwijderen PCR primers hetzij door PCR zuivering of met een PCR product schoonmaakbeurt reagens zoals exonuclease I en Garnalen alkalische fosfatase enzym (ExoSAP-IT) enkelstrengs DNA afbreken. Dit reagens enzymatisch degradeert zonder rechtspersoonlijkheid primers en dNTPs, zodat een hogere doorvoersnelheid.
5. Sequentie van de PCR producten. Zorg ervoor dat u grondig te analyseren sequencing chromatogrammen voor mutaties. Mutaties kunnen worden waargenomen als een mengsel van twee nucleotiden op een bepaalde plaats (figuur 4), gist vaak meerdere plasmiden herbergen.

Resultaten

We hebben een bibliotheek van Hsp104 varianten gerandomiseerd in het midden domein geconstrueerd en gescreend is voor onderdrukking van TDP-43 toxiciteit. De bibliotheek werd getransformeerd en uitgeplaat op glucose en galactose platen (figuur 2) om de stringentie van het scherm beoordelen. Enkele kolonies werden geselecteerd en de stammen werden geselecteerd teller met 5-FOA de Hsp104 plasmide elimineren. Deze stammen werden vervolgens beoordeeld dat citeit was door TDP-43 alleen, zonder Hsp104 variant...

Discussie

Hier presenteren we onze benadering isoleren gepotentieerd Hsp104 varianten die de toxiciteit van ziekte- geassocieerde substraten met gist proteïnopathie modellen onderdrukken. Met deze benadering kunnen grote bibliotheken van varianten worden gescreend in high throughput, met als enige beperking dat het aantal varianten dat het secundaire scherm 5-FOA passen. Door deze stappen in 96 putjes, routinematig screenen we tot 200 treffers tegelijk in de 5-FOA stappen in de loop van 1-2 weken. Het aantal hits verkregen bij de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150 mm Petri schotels	Falcon	351058
5-Fluorootzuur	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Platen	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200