Synthese van Immunotargeted Magneto-plasmonische Nanoclusters

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke nabij-infrarood (NIR) absorptie. Het protocol omvat ook antilichaam conjugatie aan de nanodeeltjes door de Fc eenheid voor diverse biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen.

Samenvatting

Magnetische en plasmonische eigenschappen gecombineerd in een enkel nanodeeltje zorgen voor een synergie die voordelig is in een aantal biomedische toepassingen zoals contrast verbetering in de roman magnetomotorische beeldvormende modaliteiten, tegelijkertijd nemen en detectie van circulerende tumorcellen (CTC's), en multimodale moleculaire beeldvorming gecombineerd met fotothermische therapie van kankercellen. Deze toepassingen hebben aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van protocollen voor synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met optische absorptie in het nabije infrarood (NIR) gebied en een sterk magnetisch moment gestimuleerd. Hier presenteren we een nieuw protocol voor de synthese van dergelijke hybride nanodeeltjes die is gebaseerd op een olie-in-water micro-emulsie methode. De unieke eigenschap van de hierin beschreven protocol synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes van verschillende maten van primaire blokken die ook magneto-plasmon kenmerken. Deze benadering levert nanodeeltjes met een hoge densiteit van magnetische en plasmonische functionaliteiten die gelijkmatig zijn verdeeld over de nanodeeltjes volume. De hybride nanodeeltjes kunnen gemakkelijk worden gefunctionaliseerd door het aanbrengen van antilichamen door de Fc eenheid verlaat het Fab-deel dat verantwoordelijk is voor antigeenbinding voor targeting.

Inleiding

Hybride nanodeeltjes bestaande uit verschillende materialen met verschillende fysisch-chemische eigenschappen kunnen nieuwe mogelijkheden openen in biomedische toepassingen, waaronder multimodale moleculaire beeldvorming, therapie levering en bewaking, nieuwe screening en diagnostische testen ^1-3. De combinatie van plasmon en magnetische eigenschappen in een nanodeeltje is van bijzonder belang omdat het een zeer sterk licht verstrooiing en absorptie doorsneden verbonden plasmonresonanties en kunnen reageren op een magnetisch veld. Zo werden magneto-plasmon nanodeeltjes gebruikt om contrast in donkere-field imaging van gemerkte cellen verhogen door een tijdelijke signaal modulatie via een externe elektromagneet ^3-5. Meer recent werd een soortgelijke grondslag voor de ontwikkeling van een nieuwe beeldvormende modaliteit - magneto-fotoakoestische imaging, waar magneto-plasmon nanodeeltjes mogelijk grote verbeteringen in contrast en signaal-achtergrond ratio ^6,7. Ook werd aangetoond dat de hybride nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor gelijktijdige opname en detectie van circulerende tumorcellen in bloed en in vivo ^8,9. Bovendien worden magneto-plasmon nanodeeltjes veelbelovende theranostische middelen die kunnen worden gebruikt voor moleculaire specifieke optische en MRI gecombineerd met fotothermische behandeling van kankercellen ^10.

Verschillende benaderingen werden verkend voor de synthese van magneto-plasmonische nanodeeltjes. Bijvoorbeeld, Yu et al. Gebruikt afbraak en oxidatie van Fe (CO) ₅ op gouden nanodeeltjes dumbbell-achtige bifunctionele Au-Fe ₃ O ₄ nanodeeltjes ¹¹ vormen. Wang et al. Hebben goud gecoate ijzeroxide nanodeeltjes gesynthetiseerd door het gebruik van thermische ontleding methode ^12. Enkele andere benaderingen afhankelijk coating polymeer of aminofunctionele moleculen aan magnetische kern nanodeeltjes gevolgd door afzetting van agoude shell op het polymeer oppervlak om de hybride te creëren deeltjes ^7,13. Bovendien werden ijzeroxide nanodeeltjes goud nanorods via elektrostatische interacties of een chemische reactie ^14,15 bevestigd. Hoewel deze benaderingen leveren magneto-nanostructuren, ze compromis enigszins eigenschappen van de magneto-plasmonische combinatie zoals optische absorptie in het nabije infrarood venster (NIR) of een sterk magnetisch moment beide zijn zeer wenselijk in biomedische toepassingen. Bijvoorbeeld, dumbbell Au-Fe ₃ O ₄ nanodeeltjes een plasmon resonantie piek bij 520 nm die hun bruikbaarheid in vivo beperkt door de hoge weefsel troebelheid in dit spectrale gebied. Bovendien is de magneto-plasmonische nanodeeltjes door huidige protocollen zijn beperkt tot slechts een ¹¹ of weinig (minder dan 10) ^14,15 superparamagnetische delen (bijvoorbeeld ijzeroxide nanodeeltjes) die significant minder dan had ach zijnieved in een dicht opeengepakte nanostructuur. Bijvoorbeeld, kan een dicht op elkaar gepakte 60 nm diameter bolvormige nanodeeltjes bevatten, in de orde van duizend van 6 nm superparamagnetische nanodeeltjes. Daarom is er een grote ruimte voor verbetering van magnetische eigenschappen van de hybride nanodeeltjes. Bovendien zijn sommige van de eerder beschreven protocollen zijn relatief complex en vereisen zorgvuldige optimalisatie om deeltjesaggregatie tijdens de synthese ^14,15 vermijden.

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmonische nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke NIR-absorptie die belangrijke beperkingen van het huidige kunst-adressen. De synthese heeft zijn oorsprong in de olie-in-water micro-emulsie-methode ^16. Het is gebaseerd op de montage van nanodeeltjes van een gewenste grootte van een veel kleinere primaire deeltjes. Deze aanpak is met succes gebruikt om nanostructuren uit een enkel materiaal zoals goud, ijzeroxide en semiconductor pri producerenmary deeltjes ^16. We uitgebreid tot de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes door, eerst, waardoor 6 nm goud diameter shell / ijzeroxide kerndeeltjes en daarna samenstellen van de primaire hybride deeltjes in de uiteindelijke bolvormige nanostructuur. Montage primaire deeltjes in nanoclusters het niet alleen mogelijk verbeteren van de eigenschappen van de samenstellende nanodeeltjes, zoals het bereiken van een sterker magnetisch schip behoud superparamagnetische eigenschappen, maar maakt ook gebruik van de interacties tussen individuele nanodeeltjes zodoende nieuwe kenmerken afwezig de samenstellende nanodeeltjes, zoals sterke optische absorptie in het NIR venster. Dit protocol geeft hybride nanodeeltjes met een hoge magnetische en plasmon functionaliteiten. Na primaire deeltjes worden gesynthetiseerd, onze methode is in wezen een eenvoudige éénpotsreactie. De totale plasmon resonantie sterkte en magnetisch moment worden bepaald door een aantal primaire deeltjes en theroordat, kan eenvoudig worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de aanvraag. Verder hebben we ook een procedure ontwikkeld voor het antilichaam conjugatie tot een hybride nanopartikels voor verschillende biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen. Antilichamen worden door de Fc eenheid verlaat het Fab-deel dat verantwoordelijk is voor antigeenbinding voor targeting gehecht.

Protocol

1 instrumentatie en Glaswerk Voorbereiding

1. Geschikte kleding te dragen, dat wil zeggen, een laboratoriumjas, wegwerphandschoenen en oogbescherming.
2. Sluit een rondbodemkolf met een koeler en dompelen in een silicone oliebad met een temperatuur controle van een thermometer. Plaats een warmtebron (bijvoorbeeld kookplaat) onder oliebad (figuur 1). Gebruik een thermometer voor het meten van de temperatuur boven 260 ° C.

2 Synthese van Primary Hybrid Magneto-plasmonische Nanodeeltjes

1. Het maken van Magnetic Core Nanodeeltjes
   1. Voeg 353,2 mg (1 mmol) ijzer (III) acetylacetonaat, 1 ml (2 mmol) oliezuur, 1 ml (2 mmol) oleylamine, 1,292 g (5 mmol) 1,2-hexadecaandiol, en 10 ml fenyl ether op een vierkante -Bottom kolf.
   2. Roer het mengsel krachtig met een magnetische roerstaaf en verhit tot 250-260 ° C gedurende 1 uur onder reflux. Vervolgens wacht de oplossing afkoelentot RT. Controleer de temperatuur onder 260 ° C tot kookpunt van het fenyl ether voorkomen en verhinderen een uitbarsting van het reactiemengsel uit de kolf naar de condensor.
      LET OP: Het reactiemengsel is zeer heet en de chemicaliën kunnen irritatie veroorzaken. Moeten opereren onder een zuurkast en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Zorg voor voldoende ventilatie van het oliebad.
      OPMERKING: De oliebad gehouden bij 250-260 ° C gedurende 1 uur tijdens de synthese van de magnetische nanodeeltjes. In principe kan een Pyrex glazen schaal worden gebruikt voor dit doel. Echter, de maximale continue temperatuur van Pyrex glas is ~ 260 º C volgens de informatie die de leverancier. Daarom is een metalen houder verschaft een veiligere optie voor de reactie aangezien het een hogere temperatuur kan weerstaan ​​en langer in meerdere runs.
2. Depositie een gouden schelp op magnetische kern nanodeeltjes
   1. Voeg 411,5 mg (1,1 mmol) goud acetate, 0,25 ml (0,75 mmol) oliezuur, 1,5 ml (3,0 mmol) oleylamine, 775,3 mg (3 mmol) 1,2-hexadecaandiol, en 15 ml fenyl ether een rondbodemkolf.
   2. Voeg 5 ml suspensie van magnetische nanodeeltjes uit stap 2.1. Verwarm het reactiemengsel tot 180 ° C en houdt onder terugvloeikoeling gedurende 1 uur. Wacht tot de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
   3. Voeg 50 ml ethanol aan de hybride primaire nanodeeltjes gevolgd door centrifugatie precipiteren bij 3250 xg gedurende 15 minuten.
   4. Resuspendeer het neerslag in 25 ml hexaan met een badsonificeerinrichting. Voeg 25 ml ethanol aan de primaire hybride nanodeeltjes te precipiteren. Centrifugeer bij 3250 xg gedurende 15 min en resuspendeer de neerslag in hexaan. Herhaal deze stap drie keer.
   5. Droog de neergeslagen primaire hybride nanodeeltjes in een vacuümexsiccator O / N. Bevestigen dat de deeltjes helemaal droog zijn.

3 Hybrid Magneto-plasmonische Nanoclusters Synthese en Maat Scheiding

1. Hersuspenderen 5 mg droge primaire hybride nanodeeltjes in 1 ml hexaan met een badsonificeerinrichting. Ultrasone trillingen nanodeeltje suspensie totdat er geen zichtbare neerslag aanwezig is.
2. Voeg de oplossing uit stap 3,1-10 ml waterige oplossing van natriumdodecylsulfaat (2,8 mg / ml) in een 20 ml glazen flesje met aangehechte caps. Voeg de suspensie primaire hybride nanopartikels druppelsgewijs vermijden vermenging van de twee fasen voor de volgende stap.
3. Ultrasone trillingen de tweefasige oplossing in een badsonicator gedurende 2 uur, gevolgd door verwarmen in een waterbad bij 80 ° C gedurende 10 minuten. Wacht tot de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur.
   1. Vul het water aan het operationele niveau lijn van de geluidsgolven bad. Centreer de glazen flacon in de ultrasoonapparaat bad. Een emulsie vormt zich onmiddellijk tussen de twee fasen. Schud de tweefasige oplossing handmatig na aanvang van de sonicatie; Dit vergemakkelijkt het mengen tussen de fase die primaire hybride nanopartikels en de onderste waterige fase.
      LET OP: Wees je bewust that de sonicator warmt na 2 uur van de exploitatie.
4. Centrifugeer de hybride nanocluster suspensie bij 100 xg gedurende 30 minuten. Verzamel zowel de neerslag en de supernatant. Resuspendeer de neerslag in 0,1 mM natriumcitraat onder de 10 min geluidsgolven. De verwachte grootte van de nanoclusters is ~ 180 nm in diameter.
5. Breng de bovenstaande vanaf stap 3.3 naar een nieuwe conische buis.
6. Centrifugeer de suspensie van stap 3.4 bij 400 xg gedurende 30 minuten. Verzamel zowel de neerslag en de supernatant. Resuspendeer de neerslag in 0,1 mM natriumcitraat onder de 10 min geluidsgolven. De verwachte grootte van de nanoclusters is ~ 130 nm in diameter.
7. Breng de supernatant van stap 3.5 een nieuwe conische buis.
8. Centrifugeer de suspensie van stap 3.6 bij 1500 xg gedurende 30 minuten. Verzamel het neerslag en resuspendeer in 0,1 mM natriumcitraat onder de 10 min geluidsgolven. De verwachte grootte van de nanoclusters is ~ 90 nm in diameter.
9. Voeg 300 _6, l nanocluster suspensie een 96-wells microplate reader voor het meten van een UV-Vis-NIR-absorptiespectrum. Drop 10 ul nanocluster schorsing op koolstof beklede koperen rooster voor TEM-beeldvorming.

4 Conjugatie van monoklonale antilichamen Nanoclusters

1. Bereid 100 pl monoklonaal antilichaam (1 mg / ml) in PBS, pH 7,2, bijvoorbeeld anti-Epidermale Groei Factor Receptor 2 (HER2)-antilichamen of anti-Epidermale Groei Factor Receptor 1 (EGFR) antilichamen.
2. Voeg de antilichaamoplossing van stap 4,1-3,9 ml 4 mM HEPES, pH 7,2. Centrifugeer de oplossing door een 10 k MWCO centrifugale filter bij 3250 xg gedurende 20 minuten bij 8 ° C. Resuspendeer het antilichaam in 4 mM HEPES, pH 7,2, tot een eindvolume van 100 pl.
   Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd om het oorspronkelijke medium vervangen het antilichaam oplossing HEPES.
3. Voeg 10 ul van 100 mM NalO _4-100 ui antilichaamoplossing. Bedek de reactie flacon met een aluminum folie op kamertemperatuur en meng gedurende 30 minuten met behulp van een schudapparaat.
4. Schrik de reactie af door toevoeging van 500 pi 1X PBS.
5. Voeg 2 pl 46,5 mM linker oplossing (dithiolaromatic PEG6-CONHNH ₂₎ aan het antilichaam oplossing uit stap 4.4 en schud gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
6. Filtreer de oplossing met behulp van een 10 k MWCO centrifuge filter bij 3250 xg gedurende 20 minuten bij 8 ° C. Resuspendeer het antilichaam in 1x PBS tot een eindvolume van 100 ul wat leidt tot een antilichaamconcentratie van ~ 1 mg / ml.
7. Meng 100 ui nanocluster suspensie OD ~ 1,0 met 1 pi gemodificeerde antilichamen van stap 4.6 (1 mg / ml) gedurende 120 min bij kamertemperatuur.
8. Voeg 10 ul van 10 ^-3 M 5 kDa PEG thiol en schud gedurende 15 min bij KT.
9. Centrifugeer de oplossing bij 830 x g gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de sediment in 100 ui 2% w / v 5 kDa PEG in PBS, pH 7,2.
10. Meet de absorptie spectrum van het antilichaam-geconjugeerde nanoclusters en vergelijk tot thij absorptie spectrum van de kale nanoclusters. Verwacht een paar nanometer rood verschuiving na de vervoeging.
11. Als de nanodeeltjes aggregeren zoals blijkt uit een significante verschuiving met een toename van OD regio rood-NIR, verhoging van de concentratie van PEG thiol tot 5 x 10 ^-3 M. Ook vergroten de incubatietijd met thiol PEG 30 min en de centrifugale snelheid in stappen 200 xg verlagen.
12. Voor kankercel labeling test, voeg het antilichaam geconjugeerd nanodeeltjes van stap 4.9 kankercel suspensie in ofwel medium of 1x PBS (1 ml ~ 10 ⁶ cellen) en meng gedurende 60 minuten.

Resultaten

Een schema voor de synthese van immunotargeted magneto-plasmon nanoclusters wordt getoond in figuur 2. Eerst worden magnetische Fe ₃ O ₄ ijzeroxide nanodeeltjes gesynthetiseerd door thermische ontleding methode. Vervolgens wordt een dunne ca. 1 nm goud shell afgezet op ijzeroxide kerndeeltjes via thermische ontleding. De primaire ca. 6 nm hybride nanopartikels dienen als zaden magneto-plasmon nanoclusters maken door gebruik van een olie-in-water micro-emulsie bena...

Discussie

Kritische stappen in de geslaagde synthese van magneto-plasmonische nanoclusters omvatten het maken van zeer monogedispergeerde primaire goud shell / ijzeroxide nanodeeltjes kern en regisseren zelf-assemblage van de primaire deeltjes in nanoclusters. Een molaire verhouding tussen de primaire deeltjes en oppervlakteactieve stoffen spelen een belangrijke rol bij het bepalen van grootteverdeling van de nanoclusters. Niet-uniforme grootte verdeling van de primaire nanodeeltjes kan de vorming van grote aggregaten veroorzaken...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PYREX 50 ml round bottom boiling flask with short neck & 24/40 [ST] joint	Corning	4320A-50	Thermische ontledingsreactie
PYREX 41 x 300 mm 5-bulb Allihn condenser met 24/40 [ST] buiten-/binnenste verbindingen	Corning	2480-300	Thermische ontledingsreactie
Silicone olie	Fisher	S159-500	Oliebad
Verwarmingsplaat roerder	Corning	PC-351	Verwarm de reactie met roerfunctie
Thermometer	ThermoWorks	221-092	Temperatuur meten
IJzer(III) acetylacetonaat	Fisher	AC11913-0250	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
Oleaanzuur 99%	Fisher	A195-500	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
Goud(III) acetaat	Fisher	AA3974206	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
Hexaan	Fisher	H292-1	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
Fenylether 99%	Fisher	AC13060-0025	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
1,2-Hexadecaandiol 90%	Sigma	213748-50G	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
Oleylamine 70%	Sigma	O7805-100G	Materiaal voor primaire hybride nanodeeltjessynthese
Natriumdodecylsulfaat	Fisher	BP166-100	Clustersynthese
Natriumcitraatdihydraat	Sigma	W302600	Clustersynthese
Monoklonaal anti-EGF receptor antilichaam	Sigma	E2156	Cellabelingspecificiteitstest
Monoklonaal anti-HER2 antilichaam	Sigma	AMAB90627	Cellabelingspecificiteitstest
Natriumperiodaat	Sigma	311448	Oxidatie van Fc-regio van antilichamen
Dithiolaraomische PEG6-CONHNH2	SensoPath Technologies	SPT-0014B	Heterofunctionele linker voor antilichaamconjugatie aan nanoclusters
Methoxy-PEG-thiol, 5 k	Creative PEGworks	PLS-604	Passivatie van resterend goudoppervlak na antilichaamconjugatie
Amicon Ultra-4 centrifugaalfiltereenheid met Ultracel-10 membraan	Millipore	UFC801008	Eiwitzuivering
HEPES	Sigma	H3375	Buffer
PBS, 1x oplossing	Fisher	BP2438-20	Buffer
UV-Vis spectroscopie	BioTek	Synergy HT	Spectrum verkrijgen
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Separatie
Transmissie Elektronenmicroscoop	FEI	TECNAI G2 F20 X-TWIN	Morfologie van nanostructuren verkrijgen
Staande microscoop	Leica	DM6000	Donkerveldbeelden verkrijgen
Sonicator	Branson	1510	Sonicatie
Koperfolie 300 maas raster	EMS	CF300-Cu	TEM beeldvorming
96-wells plaat	Corning	09-761-145	UV-Vis meetplaat