Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Samenvatting

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Samenvatting

Mirna klonen en high-throughput sequencing, genaamd miR-Seq, staat alleen als een transcriptome-brede benadering van miRNAs met single nucleotide resolutie kwantificeren. Deze techniek vangt miRNAs door aan 3 'en 5' oligonucleotide adapters miRNA moleculen en maakt de novo miRNA ontdekking. Koppeling met krachtige next-generation sequencing platforms, heeft miR-Seq instrumenteel in de studie van miRNA biologie geweest. Echter, belangrijke vooroordelen geïntroduceerd door oligonucleotideligatie stappen hebben verhinderd miR-Seq wordt gehanteerd als een nauwkeurige kwantificering tool. Eerdere studies tonen aan dat biases in de huidige miR-Seq methoden leiden vaak tot onnauwkeurige miRNA kwantificering met fouten tot 1.000-voudig voor sommige miRNAs ^1,2. Om deze vertekeningen verleend door RNA ligatie lossen, hebben we een kleine RNA ligatie werkwijze die leidt tot ligatie efficiëntie van meer dan 95% voor zowel de 3 'en 5' ligatiestappen ontwikkeld. Benchmarking deze imbleek bibliotheek bouwmethode met equimolair of verschillend gemengde synthetische miRNAs consequent levert leest getallen minder dan tweevoudige afwijking van de verwachte waarde. Verder is deze high-efficiency miR-Seq methode maakt nauwkeurige genoom-brede miRNA profilering van in vivo totaal RNA monsters ^2.

Inleiding

High-throughput sequencing-gebaseerde methoden zijn op grote schaal toegepast voor vele biologische monsters laatste jaren enorm uitbreiden ons begrip van de moleculaire complexiteit van biologische systemen ^3,4. Echter, het maken van RNA-monsters voor high-throughput sequencing schenkt vaak specifieke biases die inherent zijn aan de gebruikte methoden, het beperken van de potentiële nut van deze krachtige technieken. Deze methode specifieke vooroordelen zijn goed gedocumenteerd voor-ligatie is op kleine RNA bibliotheek voorbereidingen ^1,2,5,6. Deze vooroordelen resulteren in 1.000-voudige variatie in leest nummers voor equimoleculaire synthetische miRNAs, waardoor gevolgtrekking van miRNA overvloed van sequencing data wild variabele en foutgevoelig.

Studies gericht op de eigenschappen van faag afgeleide T4 RNA ligasen hebben aangetoond dat de enzymen vertonen nucleotide gebaseerde voorkeuren ^7, die zoals bevooroordeeld bibliotheken in high-throughput sequencing experimenten manifesteren ^{1,2,8. Om de vooroordelen verleend door RNA ligasen minimaliseren, verschillende strategieën zijn toegepast; macromoleculaire verdringing 9 randomizing de nucleotide sequentie van de adapter die proximaal is aan de ligatieplaats 6, met gebruikmaking van hoge concentraties ligatie adapter 2. Door een combinatie van deze drie benaderingen hebben we een workflow voor onpartijdige bereiding van kleine RNA bibliotheken geschikt voor high-throughput sequencing (figuur 1) ontwikkeld. Voor een directe vergelijking tussen de huidige protocollen en onze geoptimaliseerde methode, verwijzen wij u naar onze recente rapport 2. Deze geoptimaliseerde methode levert ligatie efficiëntie van meer dan 95% op zowel 3 'en 5' stappen en maakt de onpartijdige ligatie van kleine RNA moleculen uit synthetische en biologische monsters 2.}

Protocol

LET OP: Het is cruciaal om RNase vrije omstandigheden te handhaven gedurende de gehele procedure.

1. adenylatie van 3 "Linker

1. Verdun DNA-oligonucleotide ontworpen om 3 'ligatiereacties 100 uM in nuclease-vrij _H2O
   Opmerking: Het oligonucleotide moet 5 'fosfaatgroep, een gerandomiseerde dinucleotide aan het 5' uiteinde en een 3 'dideoxycytosine hebben. De 5 'fosfaatgroep is een vereiste van de Mth enzym efficiënt 5' adenylatie ^10. Het fosfaat kan worden toegevoegd door voorbehandeling van het oligonucleotide met een polynucleotide kinase of besteld met de modificatie direct. De gerandomiseerde dinucleotide aan het 5 'is belangrijk voor het minimaliseren van de sequentie die RNA ligasen voorkeur vertonen voor bepaalde end-end verbinden reacties over anderen ^6. De 3 'dideoxycytosine plaatst een blokkeerelement op het 3' uiteinde van het oligonucleotide to remmen de vorming van linker-linker concatameren tijdens volgende ligatiestappen en dient ook om het 3 'uiteinde van het miRNA-Linker molecuul gevormd aan het einde van de 3' ligatiereactie ¹¹ blokkeren. De oligonucleotide linkersequentie gekozen voor onpartijdige miR-Seq is als volgt: 5'PO ₄ NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3.
2. Monteer de volgende reactie adenylatie: 200 pmol 3 'linker oligonucleotide, 4 pi 10 x 5' DNA adenylatie buffer, 4 pi 1 mM ATP, 4 pl Mth RNA ligase, nuclease-vrij _H2O tot een eindvolume van 40 pi.
3. Incubeer reactie bij 65 ° C gedurende 1 uur. Beëindig de reactie door verwarmen tot 85 ° C gedurende 5 min.
4. Precipiteren geadenyleerde linker door toevoeging van 2,5 volumes 100% ethanol en 1/3 volume 10 M ammoniumacetaat resterende ATP te verwijderen en onverwachte ligaties voortaan reacties te voorkomen.
   1. Kort, meng de alcohol, zout en oligo oplossing tot homogeen, draaien op volle snelheid in een microcentrifuge (~ 15.000 xg) bij 4 ° C gedurende 20 min. Was de pellet in 70% ethanol, lucht drogen, en resuspendeer in de juiste hoeveelheid nuclease-vrij _H2O 50-100 uM geadenyleerde oligo opleveren.
5. Bevestig adenylerings door uitvoeren van 18% polyacrylamidegel.
   1. Bereid de gel door menging van de volgende: 6,3 g ureum, 6,75 ml van 40% acrylamide en 1,5 ml van 10x TBE. H Voeg ₂ O tot 15 ml.
   2. Meng tot ureum volledig is opgelost en voeg 150 pl 10% (w / v) ammoniumpersulfaat (APS) en 15 pl tetramethlyethylenediamine (TEMED).
   3. Zodra gel heeft ingesteld, pre-run voor 30 min bij 24 V / cm gel breedte met 1x TBE lopende buffer bij kamertemperatuur. Zodra 30 min is up flush waterputten met stromend buffer.
   4. Meng 5 pmol van geadenyleerde oligonucleotiden met en gelijk volume 2x denaturerende RNA laadbuffer (95% (v / v) formamide,0,02% (w / v) SDS, 0,02% broomfenolblauw (w / v), 0,01% (w / v) xyleencyanol, 1,0 mM EDTA), warmte kort naar 75 ° C en snap gekoeld op ijs. Pipetteer gehele monster in de put van de gel. Ook een identieke hoeveelheid niet-geadenyleerde controle en lage moleculair gewicht standaarden grootte.
   5. Voer de gel bij 24 V / cm tot de broomfenolblauw is ¾ van de weg naar de bodem van de gel. Demonteer apparaten, post-vlek gel met 1x SYBR-goud oplossing in 1x TBE en visualiseren op UV-transilluminator doos (Figuur 2).
      OPMERKING: Gel zuiveren geadenyleerde oligo op een wijze overeenkomstig aan die boven beschreven als "geen invoer RNA" controle resulteren in een grote hoeveelheid PCR-product vergeleken met monsters met input RNA.

2. Linker Ligatie 3 'einde van miRNA

1. 3 "Ligatie
   1. Monteer de volgende componenten op ijs in de genoemde volgorde: 1,0 ul 50% (w / v) PEG 8000, 0,5 &# 956; l 10x RNA ligase buffer (500 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM _MgCl2, 10 mM DTT), 1,0 pl geadenyleerd 3'Linker (100 uM), 0,5 ui RNase inhibitor, 0.5-8.0 ug totaal RNA, 0,5 pl T4 RNA ligase 2, nuclease-vrij _H2O tot een eindvolume van 5 ul.
   2. Meng de reactie door pipetteren de oplossing te viskeus om vortex vanwege de hoge concentratie van PEG 8000. Na grondig gemengd, zet de reactie in een thermocycler met een verwarmd deksel. Stel het blok tot 16 ° C en incubeer gedurende 4 uur.
      OPMERKING: De reactie kan worden opgeschaald tot een eindvolume van 20 pl zonder verlies van ligatie efficiëntie. Reageren gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C in wezen identieke ligatie efficiëntie opleveren.
2. Gel Purification
   1. Na 3 'ligatie, meng de reactie met een gelijk volume van 2x RNA laadbuffer. Verwarm tot 70 ° C gedurende 5 min, en snap afkoelen op ijs.
   2. Laat het monster op een 15% polyacrylamide gel voor PAGE zuivering.
      1. Bereid een 15% polyacrylamide gel die 7 M ureum, in een zelfde wijze als eerder beschreven in stap 1.5.
      2. Voorlooptijd de gel bij 24 V / cm gel breedte ten minste 30 min. Schakel de stroomvoorziening, flush putten, load monster en run gel op dezelfde spanning als pre-run.
      3. Laad het monster en draaien de PAGE totdat de broomfenolblauw net heeft verlaten de gel. Het gewenste product migreert nabij de xyleencyanol.
3. Vlekken, Visualisatie, en Excisie
   1. Demonteer gel apparaten en plaats gel in een schone bak met 1x lopende buffer (TBE), 1x SYBR-goud, en rock voor 15 min.
   2. Verwijder gel tegen vlekken schotel en visualiseren op UV transilluminator doos bedekt met schone plastic wrap. Het ligatieproduct moet ongeveer 45 nucleotiden lang.
   3. Accijnzen het gebied dat de ligatieproduct met een schone Razor mes en plaats in 0,5 ml micro-centrifugebuis.
4. Product Isolatie en neerslag
   1. Pierce bodem van 0,5 ml microcentrifugebuis met een 30 G naald en zet de doorboorde buis in een tweede schone, lage retentie, 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij ~ 15.000 x g.
   2. Visueel bevestigen dat de gehele gel slice is verplaatst door het gat in de binnenband. Gebruik indien nodig een schone pipet tip om wat gelfragmenten dichter bij het gat te duwen.
   3. Gooi de lege buis van 0,5 ml en voeg 400 ul hoge zoutconcentratie kolom buffer (HSCB 400 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1% SDS) aan de acrylamide slurry. Rock tube (s) bij 4 ° C gedurende de nacht.
   4. Transfer slurry naar een 0,22 micron celluloseacetaat spin-kolom met een wide-bore pipet tip. Centrifugeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur ~ 15.000 xg verzamelen alle vloeistof verwijderd van acrylamide gel matrix.
   5. Breng de vloeistof aan een schone, lage retentie, 1,5 ml tube bevattening 1 ui van 20 mg / ml glycogeen. Voeg een gelijk volume isopropanol en ^1/10 volume natriumacetaat. Meng de oplossing door het buisje meerdere malen en neerslaan in -80 ° C vriezer gedurende 20 minuten.
   6. Centrifugeer bij volle snelheid bij 4 ° C gedurende 20 min aan het nucleïnezuur pellet. Verwijder supernatant en was in 70% ethanol. Drogen pellet gedurende 10 min bij kamertemperatuur en direct verder naar 5 'ligatiestap.

3. Linker Ligatie tot 5 'einde van miRNA-3' Linker Hybrid

1. Om pellets nucleïnezuur, voeg de volgende componenten: 2 pl PEG 8000 (50% w / v), 0,5 gl 10x RNA Ligase buffer, 0,5 ul ATP (10 mM) 0,5 pl NN-RNA oligo (100 uM) en H ₂ O tot een eindvolume van 4 pl.
   OPMERKING: De samenstelling van de "NN-RNA- oligo 'is als volgt 5'-geïnverteerde dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 en werd via HPLC gezuiverd door de fabrikant.
2. Vermengendit monster door pipetteren en herhaaldelijk naar beneden. Doe dit enige tijd (tot 5 min) dat de pellet is volledig opnieuw opgelost. Als opnieuw oplosbaar is problematisch, verwarmen het monster kort (3-5 min) tot 37 ° C en opnieuw pipetteren te mengen.
3. Nadat de pellet terug in oplossing, breng de inhoud ervan een schone PCR buis die 1 ui van een 1: 1 mengsel van RNase inhibitor en T4 RNA-ligase 1 (5 eenheden). Opnieuw meng door en neer te pipetteren.
4. Incubeer de reactie in een thermische cycler bij 37 ° C gedurende 4 uur. Onmiddellijk overgaan tot cDNA synthese.

4. reverse transcriptie / cDNA Synthesis

1. Voeg de volgende componenten aan de 5 'ligatiereactie: 2 pl 5x RT-buffer, 0,75 pl 100 mM DTT, 1 ui Illumina RT primer 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3' (1 uM), en 0,5 pl dNTPs (10 mM).
2. Meng door pipetteren en verhit tot 65 ° C gedurende 5 min. Vervolgens langzaam afkoelen op de bank top.
3. Zodra reactie afgekoeld tot kamertemperatuur, plaats buis op ijs en voeg 0,5 pl elk van reverse transcriptase enzym en RNase inhibitor. Meng door pipetteren en plaats thermische cycler voor het uitrekstap aangegeven in de instructies van de fabrikant.
4. Eenmaal voltooid add 5 ul nuclease-vrij _H2O het eindvolume van het cDNA tot 15 pi te brengen.

5. Bibliotheek Voorbereiding

1. Voor de indexering PCR, assembleren de volgende reactie op ijs: 6 pl 5x Phusion buffer, 1 ul dNTP (10 mM), 0,9 pl DMSO, 0,75 pl 5 'primer (25 uM), 0,75 pl 3' primer (25 uM), 3 pl cDNA-bibliotheek (variabele concentratie, afhankelijk van de hoeveelheid van de input), 0,5 gl Phusion polymerase (1 eenheid), nuclease-vrij _H2O tot een eindvolume van 30 ui. Kies de primer sequenties voor gegarandeerde compatibiliteit met de template en de sequencing platform vankeuze.
   1. Voer de PCR reactie met de volgende instellingen: initiële denaturatie bij 98 ° C gedurende 3 min, gedurende de eerste 4 cycli denaturatie 98 ° C gedurende 15 seconden, annealen bij 50 ° C gedurende 15 seconden, verlengen bij 72 ° C gedurende 15 sec .
      OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid van het uitgangsmateriaal, variëren de totale PCR cyclus nummers. Kenmerkend voor een ingang van 1-2 ug totaal RNA, 13 totaal PCR cycli voldoende om de miR-Seq bibliotheek genereren.
   2. Voer de volgende cycli, bijvoorbeeld cycli 5-12, in een tweestaps wijze waarbij de annealing en extensie cycli worden gecombineerd en bij 70 ° C gedurende 30 sec en de denaturatie weer 98 ° C gedurende 15 sec.
      Opmerking: Het reactievolume is 30 ui toestaan ​​pauzeren het PCR-programma en verwijderen van een 10 pl aliquot op vooraf bepaalde cyclus nummers te controleren op het uiterlijk van het gewenste product. Typisch cycli 10, 13 en 16 zijn gekozen voor het testen van een totaal RNA-monster.
2. Bereideneen 8% niet-denaturerende acrylamide gel door het mengen van 2 ml 40% acrylamide, 1 ml van 10x TBE, en _H2O tot 10 ml. Voeg vervolgens 100 pl 10% APS en 10 ui TEMED. Giet gel en laat set.
   1. Pre-run de gel bij 12 V / cm gel breedte voor 30 min. Flush putten. Voeg 1 pl 10x laadbuffer (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% (w / v) SDS, 0,01% (w / v) broomfenolblauw), voeg 10 ul monster aan elk putje van afmetingen 5 mm x 1 mm x 15 mm. Meestal kan elke well maximaal 30 ui monsters. Laat het monster gel bij 10 V / cm breedte gel in 1x TBE buffer totdat de broomfenolblauw kleurstof loopt net uit de bodem van de gel.
   2. Vlekken en visualiseren gel zoals beschreven in stap 2.3.
   3. Accijnzen de 146 basenparen band en elueren overnachting in 0,25 ml van HSCB op een manier vergelijkbaar met wat is beschreven in paragraaf 2.4. Precipiteren DNA in een gelijk volume isopropanol en ^1/10 volume natriumacetaat. Was de pellet in 70% ethanol en resuspendeer in TE buffer.
   4. Kwantificeren bibliotheek met picogreen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Resultaten

De verwachte resultaten voor de bovenstaande methode dient echter aanvankelijk waarneming van een enkel nucleotide verandering (toename) van de omvang van de DNA oligonucleotide die aan adenylatie van Mth RNA ligase was (Figuur 2). Na 3 'ligatie visualisatie van de acrylamide gel aangeeft (zie figuur 3) scherp hoogmoleculaire banden zichtbaar in de 100-300 nucleotide gebied van de gel. Dit betekent dat de totale RNA-monster gebruikt van hoge kwaliteit (niet afgebroken). Ten...

Discussie

De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van een aantal belangrijke variabelen ligatie efficiëntie, namelijk hoge concentraties PEG gebruik van gerandomiseerde linkers en hoge concentratie van linkers ^2,6,9 maximaliseren. Deze aanpak maakt het mogelijk op een betrouwbare kwantitatieve sequencing bibliotheken uit totaal RNA monsters ^2. We hebben meerdere titraties input RNA uitgevoerd en hebben geconcludeerd dat de voorgaande werkwijze is het meest geschikt voor totale RNA bedragen in het bereik...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked)	Integrated DNA Technologies	custom
5' Linker	Integrated DNA Technologies	custom	5' geblokkeerd, HPLC gezuiverd
T4RNL2 (1-249 K227Q)	New England Biolabs	M0351S	Gespecialiseerd voor ligatie van voor-adenylerde DNA adapters
10x Ligatie buffer (zonder ATP)	New England Biolabs	Inbegrepen bij M0351S
10x Ligatie buffer (met ATP)	New England Biolabs	Inbegrepen bij M0204L
RNaseOUT	Invitrogen	10777-019
Polyethyleenglycol (mol. Wt. 8.000)	New England Biolabs	Inbegrepen bij M0204L
Nuclease-vrij water	Ambion	AM9937	We hebben gevonden dat water verzameld uit een destillatieapparaat van gelijke kwaliteit is.
T4RNL1	New England Biolabs	M0204L
Superscript III RT kit	Invitrogen	18080-051
Phusion PCR kit	New England Biolabs	M0530S
Illumina RP1 primer	Integrated DNA Technologies	custom	Sequentie-informatie verkrijgbaar van Illumina
Illumina RT primer	Integrated DNA Technologies	custom	Sequentie-informatie verkrijgbaar van Illumina
Illumina index primer(s)	Integrated DNA Technologies	custom	Sequentie-informatie verkrijgbaar van Illumina
40% Acrylamide	Fisher Scientific	BP14081
Urea	Sigma Aldrich	U6504
Ammoniumpersulfaat	Sigma Aldrich	A3678
Tetramethylethyleendiamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281
2x Denaturerende RNA laadbuffer	New England Biolabs	Inbegrepen bij M0351S
Razor blades	VWR	55411-050
SpinX Centricon buizen	Costar	CLS8161
Microfugebuizen met lage retentie	Fisher Scientific	02-681-320
Sybr Gold	Invitrogen	S-11494
Adenyleringskit	New England Biolabs	E2610L