Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

10.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

14 oktober 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Samenvatting

Het OP9/OP9-DL1 co-cultuur systeem is een goed gevestigde methode geworden voor het verkrijgen van gedifferentieerde bloedceltypen uit embryonale en hematopoëtische progenitorcellen van zowel muizen als mensen. Het wordt nu gebruikt om een groeiend aantal complexe genetische, cellulaire en moleculaire vragen te beantwoorden die verband houden met hematopoëse, en staat aan de voorhoede van inspanningen om deze fundamentele bevindingen te vertalen naar therapeutische toepassingen. De procedures zijn eenvoudig en leveren routinematig robuuste resultaten op. Echter, het bereiken van succesvolle hematopoëtische differentiatie in vitro vereist speciale aandacht voor de details van reagens en celcultuuronderhoud. Bovendien bevat het protocol techniekgevoelige stappen die, hoewel niet moeilijk, zorg en oefening vereisen om onder de knie te krijgen. Hier richten we ons op de procedures voor de differentiatie van T-lymfocyten uit muizen embryonale stamcellen (mESC). We bieden een gedetailleerd protocol met besprekingen van de kritische stappen en parameters die reproduceerbaar robuuste cellulaire differentiatie in vitro mogelijk maken. Het is in het belang van het veld om een bredere toepassing van deze technologie te overwegen, aangezien deze het potentieel heeft om het gebruik van dieren te verminderen, de kosten te verlagen en de tijdlijnen van zowel fundamenteel als translationeel onderzoek te verkorten.

Inleiding

Er is een celcultuursysteem opgezet waarin muizen embryonale stamcellen (mESC) in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen 1. Dit systeem maakt gebruik van het vermogen van Notch-signalering om T-celdifferentiatie te bevorderen.2 De OP9-DL1-cellijn werd gecreëerd door OP9-cellen, afkomstig van beenmerg3, te transduceren met een Notch-ligand, Delta-like 1 (DL1).4 Activering van de Notch-signaleringskaskade in vitro vergemakkelijkt de ontwikkeling van T-cellen ten koste van andere cellijnen. Met de toevoeging van geschikte cytokinen, biedt dit systeem een celcultuur'micro-omgeving' die de opeenvolgende voortgang van mESC naar hematopoietische en uiteindelijk T-cel lijnen ondersteunt. Dit systeem ondersteunt de flowcytometrische identificatie van T-cellen in de verschillende ontwikkelingsstadia die worden gezien tijdens de normale T-cel ontwikkeling in de thymus. Voor het onderzoeken van geselecteerde vragen met betrekking tot de ontwikkeling van T-cellen, is deze procedure een aantrekkelijke alternatief geworden voor in vivo hele muismodellen5 en in vitro foetale thymische orgaancultuur methoden die worden gebruikt om T-cel ontwikkeling uit muis embryonale stamcel afgeleide hematopoietische precursoren te veroorzaken.6 Het grote voordeel van het OP9 co-cultuursysteem is dat het standaard en eenvoudige celcultuurtechnieken omvat en niet afhankelijk is van het voortdurend gebruik van experimentele dieren.

We volgen een gedetailleerd, eerder gepubliceerd protocol in onze experimenten met deze benadering.7 We hebben deze technologie gebruikt om de hematopoëtische differentiatieproducten van niet-gemanipuleerde mESC-klonen, hoogwaardige mESC-klonen die handmatig zijn uitgekozen om chimere embryo's te maken8 en stabiel getransfecteerde ESC-klonen die direct uit drugsselectie komen9 te onderzoeken. We hebben opgemerkt dat de temporele kinetiek van de initiële in vitro differentiatie van mESC naar mesoderm-achtige kolonies in dit model variabel kan zijn tussen individuele klonen. De mESC-OP9 co-culturen kunnen visueel worden beoordeeld op progressie naar mesoderm. Hoewel dit meestal tegen de vijfde dag van co-cultuur wordt voltooid, kan de voltooiing bij individuele klonen een of twee dagen worden uitgesteld. Kwantitatieve (~80-90%) mesodermvorming moet worden bereikt voorafgaand aan de overdracht om een optimale vorming van hematopoëtische progenitorcellen (HPC) en robuuste lymfopoëse te verkrijgen. Daarom is, wanneer met meerdere mESC-klonen wordt gewerkt, deze 'dag 5' doorgang het beste uitgesteld totdat alle klonen de overgang naar mesoderm-achtige kolonies hebben voltooid. Dit maakt synchronie van de daaropvolgende ontwikkeling mogelijk tussen de klonen na hun overdracht naar hematopoëtische differentiatiecondities. Drie dagen na het passeren van de 80-90% mesodermale formaties worden HPC's verzameld van de OP9-monolagen. HPC's kunnen op nieuwe OP9-cellen worden gezaaid om differentiatie van monocyte, erythroïde en B-cel lijnen mogelijk te maken. Als alternatief kunnen HPC's op OP9-DL1-cellen worden gezaaid en worden aangedreven naar T-cel ontwikkeling. Alle in vitro differentiatieculturen worden vanaf dag 5 van Flt-3L voorzien, met verdere toevoeging van IL-7 vanaf dag 8. Flowcytometrieanalyses uitgevoerd op verschillende tijdstippen tijdens het experiment maken monitoring van de voortgang door de stadia en lijnen van hematopoëtische differentiatie en T-cel ontwikkeling mogelijk. CD4/CD8 dubbel positieve (DP) T-cellen beginnen te verschijnen op dag 16 van de co-cultuur, en zowel DP- als CD8 enkel positieve (SP) cellen zijn overvloedig op dag 20. Het algemene resultaat en de robuustheid van de co-cultuur zijn grotendeels afhankelijk van de mogelijkheid om visueel de voltooiing van de belangrijke ontwikkelingspunten die zich voordoen, te bepalen. Dit protocol is bedoeld als een gids voor de herkenning van deze mijlpalen, evenals de andere kritische parameters, die sleutel zijn voor een succesvolle differentiatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1 Voorbereiding van Cultuur Media, cytokines en Verstijfselde Plates

  1. Bereid ES celmedium met Dulbecco's modificatie van Eagle's Medium (DMEM) met hoge glucose en natrium pyruvaat. Voeg 20% ​​ESC gekwalificeerd foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine, 1% HEPES buffer, 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% gentamicine (50 mg / ml) en 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoethanol. Steriliseren ES-cel media door middel van filtratie.
  2. Bereid OP9 media door 1 L Alpha Minimum Essential Medium (MEM-α) van poeder volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 20% ​​foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Omkeren om te mengen. Steriliseer door filtratie in twee 500 ml porties.
    Opmerking: het gebruik van media uit poeder wordt aanbevolen en vaak beter OP9 celonderhoud en in vitro differentiatie resultaten op. Deze aanpak heeft onze standaard procedure geworden. Echter, we ook rekening mee that wij hebben soms gebruikt pre-made vloeibare α-MEM met voldoende succes.
  3. Bereid bevriezing media door toevoeging van 10% dimethylsulfoxide (DMSO) met 90% FBS. Roer voorzichtig en steriliseer door filtratie. Bewaren bij 4 ° C.
  4. Bereid 2,000x Flt-3 ligand (10 ug / ml) door het oplossen van humaan recombinant Flt-3-ligand (Flt-3L) in volledige OP9 media tot 10 ug / ml. Aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C. Volg de aanbevelingen van de leverancier met betrekking tot de stabiliteit en de opslag.
    OPMERKING: De stabiliteit van Flt-3L kort (1 maand bij 4 ° C of 3 maanden bij -80 ° C).
  5. Bereid 1000x IL-7 (1 ug / ml) met volledige OP9 media. Aliquot in 1,5 ml microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 ° C. Volg de aanbevelingen van de leverancier op de stabiliteit en de opslag (IL-7 is stabiel gedurende maximaal 12 maanden bij -80 ° C).
  6. Bereid 1000x Leukemie Remmende Factor (LIF) (10 ug / ml) van een 1:10 verdunning van 10 7 eenheden LIF in ES-cel media. WINKEL monster bij 4 ° C. Zorg ervoor dat u de vervaldatum van de fabrikant op de hoeveelheid flesjes mee.
    OPMERKING: Het product is stabiel in geconcentreerde of verdunde vorm ten minste 18 maanden na de datum van fabricage.
  7. Bereid ontsloten 6-well platen met voeg 1,5 ml 0,1% gelatine-oplossing in elk putje van een 6-wells plaat. Zonder vaten in de steriele kap bij kamertemperatuur met deksels op, waardoor ten minste 30 min voor coating. De gerechten kunnen ook worden achtergelaten in een bevochtigde incubator 's nachts. Verwijder eventuele resterende gelatine-oplossing vlak voor cel zaaien. Laat de gelatine-oplossing volledig uit te drogen in de put.

2 Voorbereiding en onderhoud van Feeder Cellen en muis embryonale stamcellen (mES)

Opmerking: Incubeer alle cellen in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2.

  1. Ontdooien muis embryonale fibroblasten (MEF)
    1. Quick-ontdooien van een bevroren flesje (~ 5 x 10 6 cellen / flacon) van mitomycine-C behandelde (of anderszins mitotically gearresteerd) MEF en overbrengen naar een 15 ml buis.
    2. Voeg 8 ml van ES-cel media om de ontdooide cellen, in een drop-wise fashion geleidelijk verdunnen de DMSO uit de bevriezing medium.
    3. Centrifugeer cellen bij 400 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 3 ml van ES-cel media.
    4. Bereid een 50 ml centrifugebuis met 33 ml voorverwarmde ES-celmedium. Voeg 3 ml geresuspendeerde MEF tot het uiteindelijke volume op 36 ml te brengen.
    5. Verdeel 3 ml van de geresuspendeerde MEFs in elk putje van twee verstijfseld 6-well platen. Plaats de platen in de incubator gedurende ten minste zes uur om de cellen hechten en verspreiden vóór het zaaien mESCs daarop. Deze mitotisch aangehouden feeder lagen kunnen bruikbaar voor enkele dagen na de eerste zaaien, als de media werden elke 2-3 dagen.
      OPMERKING: Vers gearresteerd MEF kunnen ook worden gebruikt.
    6. Zaaien mESCs
      1. Quick-dooi een flacon met een bevroren mES kloon in de 37 ° C waterbad en cellen te bereiden zoals beschreven in 2.1.1-2.1.3.
        LET OP: We bevriezen 2 flesjes van mES uit een samenvloeiing putje van een 6-well plaat.
      2. Verwijder media ve vormt (per mES kloon) van de 6-well plaat met gearresteerde MEF monolagen (bereid in stap 2.1.5) en de zaad 3 ml mESCs bovenop de MEF monolaag. Voeg 3 ul van 1000x LIF (10 ng / ml). Terug vaat in de incubator.
    7. ES celonderhoud en trypsine gemedieerde passage
      OPMERKING: Verander media dagelijks, of gesplitst op basis van samenloop van mES. Optimaal, oogst en split / re-plaat van de cellen om de andere dag.
      1. Verwijder ES celmedium en was mESCs met 2 ml PBS. Verwijder PBS. Voeg 1 ml van 0,25% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 3-5 minuten.
      2. Verzamel getrypsiniseerd cellen en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis. Krachtig pipet de celsuspensie te breken klonten van mSER. Voeg 2 ml compleet ES celmedium aan de celsuspensie om de trypsine te neutraliseren.
      3. Spin cellen bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 3 ml ES-cel media.
      4. Verwijder het afdrukmateriaal uit 6-well platen met voorbereid gearresteerd MEF monolagen. Voeg de juiste hoeveelheid van de celsuspensie (gebaseerd op het gewenste split ratio) in 3 ml ES celmedium aan elk putje worden gezaaid. Voeg 3 pi 1000x LIF. Een samenvloeiing mES goed verdeeld 1: 6 klaar voor de passage in 2 dagen zal zijn.
    8. OP9 / OP9-DL1 celonderhoud
      1. Dooi een flacon van OP9 cellen (volg de stappen 2.1.1-2.1.3 behulp OP9 media)
      2. 7 ml OP9 media tot 10 cm weefselkweek schotel. Voeg 3 ml geresuspendeerde cellen in een druppelsgewijze wijze verdelen cellen in de plaat. Leg de cellen 's nachts in de incubator.
      3. Controleer de samenvloeiing van de OP9 cellen de volgende dag. Als het gerecht bevat veel dode drijvende cellen, remove de media en voeg 10 ml vers OP9 media. Zet de schotel naar de couveuse of bijna vol samenloop niet wordt nageleefd. Split (met behulp van trypsine) 1: 4 de buurt van samenvloeiende OP9 monolaag.
        OPMERKING: De platen moeten dezelfde samenloop niveau weer te bereiken in ongeveer 2 dagen. Zorg ervoor dat u OP9 cellen over-samenvloeiende laten.
      4. Bevries de vroege passages van OP9 cellen als voorraden expansie.
        LET OP: We bevriezen 2 flesjes van OP9 cellen van de ene in de buurt van samenvloeiende 10 cm schotel. Elke flacon expansie voorraad kan verder worden doorgegeven aan werkvoorraden die later worden gebruikt in mES co-cultuur experimenten creëren. Houd alle OP9 voorraden ingevroren in vloeibare stikstof in plaats van in de -80 ° C vriezer, omdat wisselende temperaturen kan een negatieve invloed hebben op de kwaliteit van het bevriest.

    3 OP9-DL1 Co-cultuur Procedure

    1. Co-cultuur voorbereidingen
      1. Ongeveer een week voorafgaand aan de start van een co-cultuur, ontdooien MEF, mESCs en OP9 cel werken stocks. Sinds OP9-DL1 cellen niet nodig zijn totdat co-cultuur dag 8, ontdooien de OP9-DL1 cellen tijdens de eerste drie dagen na de co-cultuur initiatie. Handhaven of te bevriezen alle cellen als nodig is.
      2. Bepaal het aanvankelijke aantal 10 cm platen met OP9 celmonolagen bereid 80% confluentie dag 0 op basis van de omvang van het experiment bereiken co-kweek (bijvoorbeeld aantal mES klonen te onderscheiden en het aantal co-kweekperiode punten worden geanalyseerd). Voor te bereiden op een co-cultuur, opgesplitst in de buurt van samenvloeiende schotel van OP9 cellen tussen 1: 4 en 1: 6 twee dagen voorafgaand aan wanneer de monolagen nodig zal zijn.
        OPMERKING: Men zal ten minste een plaat per ESC kloon nodig. Typisch, een ESC kloon gezaaid op een enkele plaat (zoals hieronder beschreven) op dag 0 moeten voldoende cellen opleveren met zes platen zaad op dag 5 passage. Elke dag 5 plaat zal een verdere analyse tijdstip mogelijk te maken.
      3. Sinds OP9 monolagen zal voortdurend worden die nodig zijn voor co-cultuur passage, zorg altijd maintaadequaat aantal extra OP9 kweekplaten in parallel met de co-cultuur.
    2. Dag 0: Inleiding van co-cultuur
      1. Verzamel mES als in 2.3.1-2.3.4. Tel de cellen.
      2. Voor elke kloon mES bereiden 5 x 10 4 mES in 10 ml OP9 media per plaat.
        Opmerking Hoewel we niet gebruikt we dat een alternatief medium bestaande uit α-MEM, 10% FBS en 5 x 10 -5 M β-mercaptoethanol is ook vermeld voor gebruik bij differentiatie co-kweken 10.
      3. Verwijder de oude media uit OP9 gerechten en voeg de 10 ml mES schorsing aan de gerechten en zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig over de plaat verdelen. Leg de schalen in de 37 ° C incubator.
    3. Dag 3: Media veranderen
      1. De schaaltjes worden uit de couveuse en observeren onder de microscoop. Kolonies moeten beginnen te glimmen te verliezen en er geplet uitzien.
      2. Verwijder het afdrukmateriaal uit gerechten en voorzichtig 10 ml verse OP9media.
      3. Terug de co-cultuur schalen in de broedstoof. Visueel controleren mesoderm-achtige kolonievorming dagelijks aan de timing van OP9 feeder monolaag voorbereiding kennis voor de volgende doorgang (dag 5), die niet totdat ~ 80-90% van de kolonies visueel mesoderm morfologie weer plaatsvinden. Maximale uitstel van de dag 5 cel overdracht stap is 2 dagen.
    4. Dag 5: trypsine gemedieerde passage met pre-plating.
      OPMERKING: Maak vooraf een voldoende aantal van 10 cm schalen met optimaal samenvloeiende OP9 cellen. Ga verder met de volgende stappen alleen uit wanneer de co-culturen visueel de in stap 3.3.3 beschreven functies weer te geven (zie ook Representatieve resultaten).
      1. Verwijder het afdrukmateriaal uit de co-cultuur gerechten. Voeg 4 ml PBS te wassen. Zwenk de PBS en te verwijderen. Voeg 4 ml van 0,25% trypsine en plaats de gerechten in incubator voor ~ 5 min.
      2. Verstoren de laag getrypsiniseerde cellen door heftig pipetteren, zorg ervoor dat u overmatig luchtbellen te introduceren, tot er eenhomogeen, meestal enkele celsuspensie wordt verkregen.
      3. Voeg 4 ml van complete OP9 media en meng door pipetteren. Transfer cellen in een nieuwe, lege 10 cm schotel en plaats in de incubator gedurende 30 minuten om de OP9 cellen om zich te houden aan het gerecht. Deze "pre-plating" stap vermindert het aantal OP9 cellen overgebracht naar de volgende stap van co-cultuur.
      4. Bereid 50 ml centrifugebuizen met 40 micrometer cel filters.
      5. Verzamelen van niet-hechtende cellen uit de pre-plated schotel en geef ze door de cel zeef in de buis. Was de schaal voorzichtig met 6 ml PBS en deze door dezelfde zeef, waardoor de bijgevoegde OP9 cellen achter.
      6. Centrifugeer cellen bij 400 x g 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en resuspendeer pellet cellen in 3 ml compleet OP9 media. Tel de cellen.
      7. Verwijder de media uit 10 cm platen met optimaal samenvloeiende OP9 cellen.
      8. Voor elke analyse tijdstip, zaad 5 x 10 5 cellen op de OP9 monolaag in 10 ml eindvolume.
      9. Voeg 5 ng / ml humaan recombinant Flt-3L en plaats de gerechten in de broedstoof.
    5. Dag 8: hematopoietische Cell (HPC) collectie
      OPMERKING: Maak vooraf een voldoende aantal 6-well platen met OP9 of OP9-DL1 celmonolagen zodat ze zullen worden ~ 80% samenvloeiing in de tijd voor deze stap.
      1. Bereid 50 ml centrifugebuizen met 40 micrometer filters.
      2. Verwijder de gerechten uit de couveuse en observeren onder de microscoop. Glanzende clusters van HPC losjes worden gehecht aan de OP9 monolaag. Verzamel zoveel mogelijk van deze cellen mogelijk door het wassen van (maar niet overdreven te verstoren) de OP9 monolaag met een pipet en de bestaande media op de schotel. Om schuimvorming te voorkomen, laat altijd minimaal 1 ml van de media in de punt van de pipet tijdens deze HPC collectie / wasstap.
      3. Passeren de cellen door de 40 micrometer zeef in een buis. Voeg 8 ml PBS met dezelfde plaat en controleer onder de microscoop als alle HPCs weopnieuw verzameld. Herhaal het wassen / verzamelstap met PBS en (indien nodig) met krachtiger wassen. Zeef de cellen in de buis al de cellen van dezelfde plaat bevat.
      4. Centrifugeer cellen bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
      5. Bereid een master mix van 3 ml (per plaat gezaaid op dag 5) van OP9 medium met 5 ng / ml Flt-3L en 1 ng / ml IL-7.
      6. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in OP9 media met Flt-3L + IL-7 master mix (3 ml voor elke 10 cm schotel verwerkt). Breng de verzamelde cellen van elke plaat in een putje van een 6-wells plaat met OP9 cellen.
        1. Om cellen rijden richting monocyt, B cel of erytroïde lineages, zaaigoed de verzamelde cellen op OP9 cellen. T-cellen af ​​te leiden, het zaad van de cellen op OP9-DL1 celmonolagen.
      7. Plaats de 6-well platen in incubator.
    6. Dag 10: Media veranderen
      1. Bereid een 15 ml centrifugebuis voor elke afzonderlijke kloon mES-feeder celtype combinaking in co-cultuur.
      2. Bereid een master mix van OP9 medium met 5 ng / ml Flt-3L en 1 ng / ml IL-7. Bereid 3 ml voor elke wel.
      3. Verzamel media uit elk putje van de 6-well plaat combineert inhoud van meerdere putjes die dezelfde kloon ESC-feeder celtype formatie.
      4. Voeg 2 ml van OP9 media master mix (zie 3.6.2) in elk putje.
      5. Centrifugeer de verzamelde media bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer elke pellet (zeer klein indien zichtbaar) in 1 ml van OP9 media master mix (zie 3.6.2) per well oorspronkelijk zijn verzameld in stap 3.6.3.
      6. Verdeel 1 ml cellen terug in elk putje waarvan de media oorspronkelijk werd verzameld waardoor het volume in elk putje tot 3 ml. Breng de schalen in de broedstoof.
    7. Dag 12: Geen trypsine passage
      OPMERKING: Bereid vooraf een voldoende aantal 6 putjes met OP9 of OP9-DL1 cellen zodat ze optimaal worden confluent in tijd voor stap. Dag 12 is ideaal voor flowcytometrie analyse ontwikkelen erythroïde, monocyt, en jonge T-cellen.
      1. Bereid een master mix (3 ml voor elke wel die verder worden co-kweek) van OP9 medium met 5 ng / ml Flt-3L en 1 ng / ml IL-7.
      2. Bereid 50 ml centrifuge buizen met 40 urn zeven (een voor elke kloon ESC-feeder celtype combinatie in co-kweek).
      3. Krachtig pipet bestaande media in elk putje om alle cellen (inclusief monolaag) te splitsen in de put. Ga verder met krachtig pipetteren totdat een toestand lijkt op een enkele celsuspensie wordt verkregen.
      4. Leid de verzamelde cellen door de zeef in de buis. Voeg 3 ml PBS in elk putje te wassen en alle resterende cellen te verzamelen. Ga cellen door dezelfde zeef. Combineer cellen uit meerdere putjes die dezelfde ESC kloon-feeder celtype combinatie.
      5. Gooi de gebruikte cel zeef en verwijder een hoeveelheid gelijk aan een goed (~ 6 ml) voor elke gewenstestroomcytometrie (of andere) analyses op die dag worden uitgevoerd. Bewaar deze monsters op ijs voor gebruik.
      6. Centrifugeer cellen bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant. Resuspendeer de pellet van 50 ml centrifugebuisjes in 3 ml van master mix per putje opnieuw worden gezaaid. Voeg 3 ml per putje van elke cel schorsing voor het juiste type feeder cel en plaats de gerechten in de couveuse.
    8. Dag 14: Media veranderen
      1. Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.6.
    9. Dag 16: Geen trypsine passage
      OPMERKING: Bereid vooraf 6 putjes van confluente optimaal OP9 of OP9-DL1 cellen voor deze stap.
      OPMERKING: Dag 16 is ideaal voor flowcytometrie analyse van B lymfocyten en middenfase T-cellen.
      1. Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.7.
    10. Dag 18: Media veranderen
      1. Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.6.
    11. Dag 20: Geen trypsine passage
      OPMERKING: Dag 20 is ideaal voor flowcytometrie analyses van midden tot laat stadium de ontwikkeling van T-cellen.
      1. Volg de stappen die worden beschreven in paragraaf 3.7. Indien gewenst voeren differentiërende cellen afgelopen dag 20 afwisselende media verandering en geen trypsine doorgangen om de twee dagen, met een dagelijkse controle van de lymfocyten expansie tarief.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wanneer gekweekt op MEFs in aanwezigheid van LIF, kan mESCs worden gehandhaafd in een ongedifferentieerde toestand. Onder ideale omstandigheden, verschijnen ze als compacte kolonies van cellen omgeven door een glanzende halo fasecontrast microscopie (figuur 1). Deze culturen moet dagelijks worden gecontroleerd. Afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen, kan media worden gewijzigd of cellen kunnen worden gesplitst. Naburige mES kolonies moet niet komen tot het punt van contact met elkaar. Een normal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De OP9-DL1 co-kweeksysteem is gebruikt om de rol van verschillende genproducten te bestuderen bij de ontwikkeling van bloedcellen types van stamcellen. 8,12,13 Het is ook bewezen een effectief model om de functie van gen-regulatoire DNA bestuderen gedurende de celdifferentiatie. 9,14 Met deze benadering als alternatief geheel muismodellen kunnen aanzienlijke besparingen op in tijd en kosten van experimenten die vele fundamentele vragen hematopoiese pakken. Echter, aanpassing van het protocol voor d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Joon Kim voor deskundige hulp bij flowcytometrie. Onderzoek in de laboratoria van de auteurs wordt ondersteund door het SCORE-programma van de National Institutes of Health (subsidie SC1-GM095402 aan B.D.O) en de Canadese Institutes of Health Research (aan J.C.Z.P.). J.C.Z.P. wordt ondersteund door een Canada Research Chair in Developmental Immunology. De biomedische onderzoeksinfrastructuur van Hunter College wordt gedeeltelijk ondersteund door het NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) programma via subsidie MD007599. We erkennen ook het New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) voor de ondersteuning van de start van stamcelonderzoek aan Hunter College via subsidie C023048.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DMEMCorning15-013-CV
Stem cell gekwalificeerd FBSGemini100-125Heat inactivated
Penicillin/StreptomycinCorning30-002-CI
L-alanyl L-glutamineCorning25-015-CI
HEPES buffer MilliporeTMS-003-C
Non-Essential Amino AcidsThermoScientificSH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBSLife Technologies 21985-023
Filter UnitMilliporeSCGPU05RE0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade WaterCorning25-055-CM
α-MEM Life Technologies 12000-022Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03Testing of individual lots required 
Dimethyl Sulphoxide SigmaD2650
Recombinant Human Flt-3 LigandR&D Systems308-FK
Recombinant Murine IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
Utrapure water met 0,1% gelatineMilliporeES-006-B
MEFs behandeld met mitomycin CMilliporePMEF-CFElke mitotisch gearresteerde MEF kan worden gebruikt
DPBSCorning21-031-CV
Cel zeef (40 μm)Fisher22363547
Weefselkweekschaal 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-wellBD Falcon353046
1,5 ml microcentrifugebuizenUSA Scientific1615-5500
15 ml centrifugebuizenBD Falcon352096
50 ml centrifugebuizenBD Falcon352070
5 ml Polystyrene Rond-Bodembuis met Cell-Strainer CapBD Falcon352235Buizen voor FACS 
ES R1 cellenATCCSCRC-1011
OP9 cellenCellen kunnen worden verkregen bij het Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cellen    Cellen kunnen worden aangevraagd bij het Zúñiga-Pflücker laboratorium.
FlowJo software Tree StarFACS data analyses
Flow CytometerBDFACScan, FACSCalibur en FACSVantage zijn gebruikt in ons lab

Referenties

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

T-celdifferentiatieOP9-cocultuursysteemhematopoëtische progenitorcellenflowcytometrieanalyseonderhoud van celculturenstromale cellaagT-lymfocytenontwikkelingin vitro-modelCD4 CD8 dubbel positief
Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.