Afleiding van T cellen In Vitro Van muis embryonale stamcellen

Samenvatting

Muis embryonale stamcellen kunnen in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen met behulp van het OP9-DL1 co-cultuursysteem. Succes bij deze procedure vereist zorgvuldige aandacht voor reagens/celonderhoud en belangrijke techniekgevoelige stappen. Hier bespreken we deze kritieke parameters en bieden we een gedetailleerd protocol om de adoptie van deze technologie te stimuleren.

Samenvatting

Het OP9/OP9-DL1 co-cultuur systeem is een goed gevestigde methode geworden voor het verkrijgen van gedifferentieerde bloedceltypen uit embryonale en hematopoëtische progenitorcellen van zowel muizen als mensen. Het wordt nu gebruikt om een groeiend aantal complexe genetische, cellulaire en moleculaire vragen te beantwoorden die verband houden met hematopoëse, en staat aan de voorhoede van inspanningen om deze fundamentele bevindingen te vertalen naar therapeutische toepassingen. De procedures zijn eenvoudig en leveren routinematig robuuste resultaten op. Echter, het bereiken van succesvolle hematopoëtische differentiatie in vitro vereist speciale aandacht voor de details van reagens en celcultuuronderhoud. Bovendien bevat het protocol techniekgevoelige stappen die, hoewel niet moeilijk, zorg en oefening vereisen om onder de knie te krijgen. Hier richten we ons op de procedures voor de differentiatie van T-lymfocyten uit muizen embryonale stamcellen (mESC). We bieden een gedetailleerd protocol met besprekingen van de kritische stappen en parameters die reproduceerbaar robuuste cellulaire differentiatie in vitro mogelijk maken. Het is in het belang van het veld om een bredere toepassing van deze technologie te overwegen, aangezien deze het potentieel heeft om het gebruik van dieren te verminderen, de kosten te verlagen en de tijdlijnen van zowel fundamenteel als translationeel onderzoek te verkorten.

Inleiding

Er is een celcultuursysteem opgezet waarin muizen embryonale stamcellen (mESC) in vitro worden gedifferentieerd tot T-cellen ¹. Dit systeem maakt gebruik van het vermogen van Notch-signalering om T-celdifferentiatie te bevorderen.² De OP9-DL1-cellijn werd gecreëerd door OP9-cellen, afkomstig van beenmerg³, te transduceren met een Notch-ligand, Delta-like 1 (DL1).⁴ Activering van de Notch-signaleringskaskade in vitro vergemakkelijkt de ontwikkeling van T-cellen ten koste van andere cellijnen. Met de toevoeging van geschikte cytokinen, biedt dit systeem een celcultuur'micro-omgeving' die de opeenvolgende voor....

Protocol

1 Voorbereiding van Cultuur Media, cytokines en Verstijfselde Plates

1. Bereid ES celmedium met Dulbecco's modificatie van Eagle's Medium (DMEM) met hoge glucose en natrium pyruvaat. Voeg 20% ​​ESC gekwalificeerd foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine, 1% L-glutamine, 1% HEPES buffer, 1% niet-essentiële aminozuren, 0,1% gentamicine (50 mg / ml) en 0,1% ( 55 uM) β-mercaptoethanol. Steriliseren ES-cel media door middel van filtratie.
2. Bereid OP9 media door 1 L Alpha Minimum Essential Medium (MEM-α) van poeder volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 20% ​​foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Omker....

Resultaten

Wanneer gekweekt op MEFs in aanwezigheid van LIF, kan mESCs worden gehandhaafd in een ongedifferentieerde toestand. Onder ideale omstandigheden, verschijnen ze als compacte kolonies van cellen omgeven door een glanzende halo fasecontrast microscopie (figuur 1). Deze culturen moet dagelijks worden gecontroleerd. Afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen, kan media worden gewijzigd of cellen kunnen worden gesplitst. Naburige mES kolonies moet niet komen tot het punt van contact met elkaar. Een normal.......

Discussie

De OP9-DL1 co-kweeksysteem is gebruikt om de rol van verschillende genproducten te bestuderen bij de ontwikkeling van bloedcellen types van stamcellen. ^8,12,13 Het is ook bewezen een effectief model om de functie van gen-regulatoire DNA bestuderen gedurende de celdifferentiatie. ^9,14 Met deze benadering als alternatief geheel muismodellen kunnen aanzienlijke besparingen op in tijd en kosten van experimenten die vele fundamentele vragen hematopoiese pakken. Echter, aanpassing van het protocol voor d.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
DMEM	Corning	15-013-CV
Stem cell gekwalificeerd FBS	Gemini	100-125	Heat inactivated
Penicillin/Streptomycin	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
HEPES buffer	Millipore	TMS-003-C
Non-Essential Amino Acids	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies	15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS	Life Technologies	21985-023
Filter Unit	Millipore	SCGPU05RE	0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade Water	Corning	25-055-CM
α-MEM	Life Technologies	12000-022	Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Testing of individual lots required
Dimethyl Sulphoxide	Sigma	D2650
Recombinant Human Flt-3 Ligand	R&D Systems	308-FK
Recombinant Murine IL-7	PeproTech	217-17
LIF	Millipore	ESG1107
Utrapure water met 0,1% gelatine	Millipore	ES-006-B
MEFs behandeld met mitomycin C	Millipore	PMEF-CF	Elke mitotisch gearresteerde MEF kan worden gebruikt
DPBS	Corning	21-031-CV
Cel zeef (40 μm)	Fisher	22363547
Weefselkweekschaal 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multiwell 6-well	BD Falcon	353046
1,5 ml microcentrifugebuizen	USA Scientific	1615-5500
15 ml centrifugebuizen	BD Falcon	352096
50 ml centrifugebuizen	BD Falcon	352070
5 ml Polystyrene Rond-Bodembuis met Cell-Strainer Cap	BD Falcon	352235	Buizen voor FACS
ES R1 cellen	ATCC	SCRC-1011
OP9 cellen			Cellen kunnen worden verkregen bij het Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cellen			Cellen kunnen worden aangevraagd bij het Zúñiga-Pflücker laboratorium.
FlowJo software	Tree Star		FACS data analyses
Flow Cytometer	BD		FACScan, FACSCalibur en FACSVantage zijn gebruikt in ons lab