In Vitro Analyse van Myd88 gemedieerde cellulaire immuunrespons op West Nile Virus mutantstam Infectie

Samenvatting

Twee op flowcytometrie gebaseerde methoden – een in vitro T-cel priming test en intracellulaire cytokine kleuring werden gebruikt om de antigeenpresenterende capaciteit van dendritische cellen en antigeenspecifieke T-celreacties op een West Nile-virus mutant infectie bij muizen te meten.

Samenvatting

Een verzwakt West Nile virus (WNV), een niet-structurele (NS) 4B-P38G mutant geïnduceerde hogere aangeboren cytokine en T cel responsen dan het wildtype WNV bij muizen. Onlangs, myeloïde differentiatie factor 88 (MyD88) signalering werd getoond belangrijk voor initiële T-cel priming en geheugen T-cel ontwikkeling te zijn tijdens WNV NS4B-P38G mutant infectie. In deze studie twee stroomcytometrie-gebaseerde methoden - een in vitro T-cel priming assay en een intracellulaire cytokine kleuring (ICS) - werden gebruikt om dendritische cellen (DCs) en T celfuncties beoordelen. In de T-cel priming test werd celproliferatie geanalyseerd door flow cytometrie na co-cultuur van DCs uit beide groepen muizen met carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) - gelabelde CD4 ⁺ T-cellen van OTII transgene muizen. Deze aanpak gaf een nauwkeurige bepaling van het percentage prolifererende CD4 ⁺ T-cellen met aanzienlijk verbeterde algehele gevoeligheid dan de traditieal assays met radioactieve reagentia. Een microcentrifugebuis werd gebruikt in zowel celkweek en cytokine kleuringen van de ICS protocol. Vergeleken met de traditionele weefselkweek-plate-gebaseerd systeem, deze aangepaste procedure was makkelijker om te presteren op de bioveiligheid niveau (BL) 3 faciliteiten. Bovendien werden WNV- geïnfecteerde cellen behandeld met paraformaldehyde in beide assays, die verdere analyse buiten BL3 faciliteiten ingeschakeld. Kortom, kunnen deze in vitro immunologische assays worden gebruikt om celgemedieerde immuunresponsen in WNV infectie efficiënt beoordelen.

Inleiding

West-Nijlvirus (WNV), een neurotropisch, plus-voelde flavivirus, is een opkomende bedreiging voor de volksgezondheid. Op dit moment zijn er geen vaccins zijn goedgekeurd voor menselijk gebruik ^1. Een verzwakte WNV stam, die een P38G substitutie in het niet-structurele (NS) 4B eiwit, bekend geen letaliteit bij muizen maar hogere aangeboren cytokinen en T cel responsen in muizen dan wildtype WNV NY99 stam ² induceren. Muizen geïmmuniseerd met de NS4B-P38G mutant werden allemaal beschermd tegen een secundaire uitdaging met dodelijke wild-type WNV. Dit suggereert dat de NS4B-P38G mutant geschikte kenmerken voor een ideaal vaccin kandidaat. De mechanismen waarmee de NS4B-P38G mutant induceert hoge beschermende adaptieve immuniteit is nog niet duidelijk begrepen. Toll-like receptoren (TLR's), die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen, spelen een essentiële rol in de initiatie van aangeboren immuniteit tegen virale infectie. De kern TLR signaalweg maakt gebruik van myeloïde differentiatie primaire reactie gene 88 (MyD88) als de primaire adapter ^3,4. In een recente studie werd MyD88 signalering blijkt een belangrijke rol in de ontwikkeling van celgemedieerde immuniteit spelen tijdens WNV NS4B- P38G mutante infectie bij muizen ^5. Dendritische cellen (DCs) zijn één van de belangrijkste antigeen presenterende cellen vertonen de unieke capaciteit tijdens virale infectie ^6,7 primaire T-cel responsen leiden. CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T-cellen dragen bij tot langdurige beschermende immuniteit en zijn belangrijk voor gastheer overleven na wildtype WNV infectie ^8,9. Twee immunologische assays werden bij dit onderzoek naar de functie van deze cellen in de NS4B-P38G mutant geïnfecteerde muizen te beoordelen.

Eerst werd een in vitro T-cel priming assay gebruikt ter vergelijking de antigenpresenterende vermogen van DCs van WNV-geïnfecteerde wildtype en MyD88 ^{- / -} muizen. Om de gevoeligheid van de assay, naïeve CD4 + T-cellen werden geïsoleerd uit OTII transgene muizen, die een Vα2 / Vβ5 TCR specifiek voor de kip ovalbumine (OVA) peptide uitdrukken 323 - 339. DC's van WNV geïnfecteerde muizen werden gezuiverd, en co-gekweekt met carboxyfluoresceïne succinimidyl Pasen (CFSE ) -gemerkte CD4 ⁺ T-cellen in aanwezigheid van OVA-peptide. Na 5 dagen van co-kweek werden de cellen geoogst en met paraformaldehyde (PFA) vastgesteld en door flow cytometrie geanalyseerd. Proliferatieve assays zijn vanouds door incorporatie van 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) of getritieerd thymine deoxyriboside ⁽³ HTdr) ¹⁰ uitgevoerd. Toch zijn deze testen zijn ofwel radioactief en / of die bijzondere apparatuur in bioveiligheidsniveau (BL) 3 faciliteiten waar WNV studies worden uitgevoerd. De flowcytometrische analyse van lymfocyt proliferatie door seriële halvering van de fluorescentie-intensiteit van de vitale kleurstof CFSE geworden vaker gebruikt in immunologische assays de kleurstof stabieleren gelijkmatig opgenomen in cellen, gemakkelijk gedetecteerd door flow cytometrie en is nonradioactive ^11. De test heeft ook de mogelijkheid om het aantal celdelingen beoordelen. Een groot voordeel van deze assay in WNV studies is dat fixatie van de geïnfecteerde cellen met 1-2% PFA WNV ^12, die monsterverzameling mogelijk maakt met een flowcytometer in BL2 laboratorium kunnen inactiveren.

Vervolgens werd een gemodificeerd intracellulaire cytokine kleuring (ICS) procedure gebruikt om de rol van MyD88 signalering in regulatie van WNV specifieke T cel responsen in NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde muizen te bestuderen. In deze test werden splenocyten geïsoleerd uit geïnfecteerde muizen behandeld in vitro met WNV specifieke peptiden. Brefeldine A werd toegevoegd aan de cytokinen in de cel behouden. Na 5 uur incubatie werden cellen geoogst, gewassen en gekleurd voor T cel subsets. Cellen werden vervolgens gefixeerd in PFA, gepermeabiliseerd en gekleurd voor interferon (IFN) -γ en geanalyseerd met flow cytometrie.Zoals bij andere flowcytometrie gebaseerde bepaling, wanneer de cellen worden behandeld met fixatie en permeabilisatie buffer met PFA, geïnfecteerde monsters kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking en analyse. In verschillende gepubliceerde studies, hebben we gebruik ICS T celeffectorfuncties meten WNV-geïnfecteerde muizen ^13,14. Hoewel het goed gevestigd, een belangrijk nadeel van deze test is dat de procedure zeer langdurig en tijdrovend wanneer deze binnen BL3 voorzieningen kunnen zijn. Hier werd een micro-centrifugebuis ICS-methode getoond haalbaarder, gemakkelijker te gaan en minder tijdrovend wanneer deze binnen een BL3 laboratorium zijn.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van Texas Medical Branch.

1. Isolatie van DC's van niet-geïnfecteerde en-WNV geïnfecteerde muizen

1. Leeftijd en sekse match 6-10 weken oud, wild-type C57BL / 6 (B6) en MyD88 ^{- / -} muizen. Te enten intraperitoneaal (ip) met 500 plaque vormende eenheid (PFU) van WNV NS4B- P38G mutant. Op dag 3 na de infectie, euthanaseren B6 en MyD88 ^{- / -} muizen met CO _2. Gebruik van niet-geïnfecteerde muizen van beide groepen als controles. Met drie muizen per groep.
2. Natte vacht aan de linkerkant van opgeofferd muis met behulp van 70% ethanol en weggesneden de vacht langs de linkerkant van de muis, ongeveer halverwege tussen de voor- en achterpoten. Opengesneden de lichaamsholte. Verwijder de milt met behulp van de tang. Plaats de milt in een petrischaal met RPMI.
3. Isoleer milt DCs met anti-CD11c magnetische parels volgensinstructies van de fabrikant.

2. Zuivering en Labeling van T-cellen van OTII transgene muizen

1. Oogst een milt van een naïeve OTII muis zoals beschreven in stap 1.2 en homogeniseer de milt tussen de matte uiteinden van twee dia. Breng de celsuspensie aan een 15 ml conische buis, voeg RPMI-medium tot 14 ml. Laat de suspensie zitten 5 minuten en breng 13 ml aan een nieuwe 15 ml conische buis.
2. Isoleer milt CD4 ⁺ T-cellen met een CD4 ⁺ T cel isolatie kit volgens de instructies van de fabrikant.
3. Overdracht cellen in een 50 ml conische buis, twee keer wassen met PBS. Resuspendeer cellen in PBS met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 1 x 10 ⁶ cellen per ml en voeg 0,5 umol / ml CFSE. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min, beschermd tegen licht.
4. Voeg 5 ml koud compleet medium (RPMI-1640 met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1/100 volantibiotica / antimycotica, 1/100 volume L-glutamine en 1 / 1,000 vol 1,000 x 2-mercaptoethanol).
5. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Was de cellen eenmaal met PBS, vast 0,2 x 10 ⁶ gelabelde CD4 ⁺ T-cellen in 2% PFA en verwerven op een flowcytometer. Gebruik dit monster naar het basale niveau van CFSE bepalen. Resuspendeer de rest van gelabelde cellen in compleet medium.

3. Co-cultuur OTII T-cellen met DC's van WNV-geïnfecteerde muizen

1. Culture 2 x 10 ⁵ gezuiverde CD4 ⁺ T-cellen van muizen OTII alleen of met gezuiverd DCs wild-type of MyD88 ^{- / -} muizen (2 x 10, ⁴⁾ in een 24 wells plaat met of zonder OVA resten 323-339 (1 g / ml) in 1 ml compleet medium per putje.
2. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 dagen. Oogst cellen, was twee keer in FACS-buffer (PBS met 1% FBS) en bevestig in 0,25 ml 2% PFA. Vortex onmiddellijk.

4. Flowcytometrieanalyse van In Vitro </ Em> T Cell Priming

1. Voor overname, dubbelklik op de flowcytometrie software icoon. Voor een dichtheid perceel van lineaire FSC-A versus lineaire SSC-A, kanalen te selecteren 0 tot 200.000 op FSC-A en 0 tot 200.000 op SSC-A. Maak vervolgens een poort op levende cellen (P2; zie figuur 1A).
2. Om de fluorescentie-intensiteit van CFSE analyseren, opent u het histogram voor de FL1 kanaal en het verwerven van 20.000 evenementen op de gated bevolking. Het opzetten van een marker op monsters voor OTII cellen alleen gekweekt (Figuur 1A).
3. Verwerven monsters OTII cellen samen gekweekt met wildtype DCs (Figuur 1B) of MyD88 ^{- / -} DCs (figuur 1C) op een soortgelijke wijze.

5. Isolatie en Stimulatie van Splenocyten voor cytokine Testen

1. Infecteren B6 en MyD88 ^{- / -} muizen met WNV NS4B-P38G mutant volgens dezelfde procedure zoals beschreven in step 1.1. Op dag 30 na de infectie, re-challenge overlevende muizen met 2000 PFU van de wild-type WNV stam ip Op dagen 8 en 21 post-primaire WNV infectie of op dag 4 na secundaire infectie, euthanaseren muizen met CO ₂ voor het verzamelen van de milt .
   OPMERKING: We gebruikten 2-3 muizen per groep voor elk tijdstip.
2. Voeg een enkele celsuspensie van splenocyten zoals beschreven in stap 1.2 en stap 2.2. Tellen cellen met een hemocytometer en resuspendeer ze in 10 ml compleet medium.
3. Verdun cellen met volledig medium tot 2,5 x 10 ⁶ cellen / ml. Voeg 1 ml splenocyten in 1,5 ml micro-centrifugebuis.
4. CD8 ⁺ T-cellen simuleren verdunnen WNV specifiek NS4B en E peptiden (SSVWNATTA en IALTFLAV) tot 1 mg / ml in DMSO. Voor stimulatie van CD4 ⁺ T-cellen, verdund WNV specifieke NS3 en E peptiden (RRWCFDGPRTNTILE en PVGRLVTVNPFVSVA) tot 1 mg / ml in DMSO. Voeg 10 ul van peptiden aan de cellen followed met 1 pl Brefeldine A oplossing. Gebruik cellen zonder peptiden behandeling als controles. Meng de cellen.
5. Punch twee gaten met een 18 G naald in de dop van de buis. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 uur.

6. intracellulaire cytokine kleuring

1. Overdracht cellen om een ​​nieuwe micro-centrifugebuis. Spin cellen gedurende 5 minuten bij 300-400 xg en giet af supernatant. Voeg 1 ml FACS buffer, draai 5 min bij 300-400 xg en opnieuw te schorten cellen door pipetteren met 120 ul FACS buffer.
2. Voeg 2 pi Fc blokker en incubeer cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg 1 ml FACS-buffer aan elke buis. Spin 5 min bij 300-400 x g.
3. Re-schorten cellen in 300 ul FACS buffer en ze splitsen in drie buizen (ongeveer 0,8 x 10 ⁶ cellen per buis). Zoals getoond in tabel 1, behouden de eerste buis van elke kweekomstandigheid voor rat IgG-PE-kleuring. Voor de tweede buis, voeg 3 ul van anti-CD4 APC CD4 peptiden behandelde cellen, 3 μl anti-CD8 FITC CD8 peptiden behandelde cellen of beide antilichamen aan cellen zonder peptiden behandeling. Gebruik de derde buis tot schadevergoeding kleuring. Voor elke cultuur staat, gebruik drie buizen van cellen gekleurd met APC-geconjugeerde CD4, FITC-geconjugeerd CD8 of PE- gelabelde CD3 antilichamen alleen (3 pi per buis) als compensatie controles voor VT1, VT2 en FL4 kanalen.
4. Vortex cellen kort. Vertrekken op ijs gedurende 20 minuten en bescherming tegen licht. Voeg 1,4 ml FACS buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en giet af supernatant.
5. Ageren naar cel pellet (of kort vortex) verstoren. Re-schorten cel pellet in 250 ul fixatie / permeabilisatie solutionby pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en bescherm tegen licht.
6. Voeg 1,2 ml FACS buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en resuspendeer cellen in 300 pi FACS-buffer.
   OPMERKING: Op dit punt cellen kunnen worden overgebracht naar een BL2 laboratorium voor verdere verwerking of in de koelkast bewaard en beschermd tegen licht for up drie dagen.
7. Voeg 500 pi FACS-buffer. Spin 5 min bij 300-400 xg en resuspendeer cellen in 500 ul van 1x permeabilisatie / wasbuffer. Spin 5 min bij 300-400 x g.
8. Re-schorten cellen in 100 ul 1x Perm / Wash, voeg 3,5 ul anti-IFNy-PE aan de buis eerder toegevoegde met antilichamen voor CD4 en / of CD8 T-cel markers in stap 6.3 en 3.5 pi rat IgG-PE in de buis voorbehouden voor IgG controle gedurende 25 min op ijs en bescherming tegen licht. Was de cellen door het toevoegen van 1,4 ml 1x permeabilisatie / wasbuffer. Spin 5 min bij 300-400 x g. Herhaal de wasstap door het toevoegen van 1,4 ml 1x permeabilisatie / wasbuffer.
9. Spin 5 min bij 300-400 xg en decanteer supernatant. Was de cellen door het toevoegen van 1,4 ml van FACS buffer en opnieuw op te schorten in 400 pi van FACS-buffer voor de definitieve overname.

7. Flowcytometrieanalyse van intracellulaire cytokine kleuring

1. Gebruik dezelfde overname instellingen als in stap 4.1. Create een poort op levende cellen (P2; zie figuur 2A). Stel de spanningen met de compensatie buizen voor elke groep.
2. Open twee nieuwe puntdiagrammen, een tot gegevens die zijn verzameld voor FL1 vs weer te geven. FL2 (CD8 vs. IFN-γ), en de andere is om gegevens verzameld FL4 vs weergegeven. VT2 (CD4 vs. IFN-γ). Verwerven 50.000 evenementen voor de gated bevolking van elk monster.

Resultaten

In de T-cel priming test CFSE gelabelde CD4 ⁺ T-cellen werden gekweekt met gezuiverd DCs uit de NS4B-P38G-mutant geïnfecteerde wildtype en MyD88 ^{- / -} muizen in de aanwezigheid of afwezigheid van OVA-peptiden. Gelabelde T cellen alleen gekweekt met of zonder OVA gedurende 5 dagen werden als negatieve controles. Zoals getoond in figuur 1A, zijn de totale T-cellen gated voor analyse van de fluorescentie-intensiteit op het FL1 kanaal. De markering is ingesteld gebaseerd op de vers gem...

Discussie

WNV is een BL3 pathogeen. Vanwege veiligheidsvoorschriften, worden immunologische tests met WNV besmette monsters vaak beperkt door de beschikbaarheid van apparatuur op BL3 faciliteiten of meer langdurig en vervelend om te presteren. In een recente studie, gebruikten we twee stroomcytometrie gebaseerde methoden om celgemedieerde immuunresponsen bestuderen gedurende WNV infectie ^5. In beide assays werden WNV-geïnfecteerde cellen behandeld met 1-2% PFA rechtstreeks of fixatie / permeabilisatie oplossing met 4% ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI 1640	Invitrogen	11875	opwarmen op 37 °C
anti-CD11c magnetische kralen	Miltenyi Biotec	130-052-001	volg de instructies van de fabrikant’s
anti-CD4 magnetische kralen	Miltenyi Biotec	130-095-248	volg de instructies van de fabrikant’s
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA residu 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptiden	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A oplossing	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-geconjugeerd CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-geconjugeerd CD8	e-Bioscience	11-0081-82
Fixatie/Permeabilisatie Oplossing	BD-Bioscience	554722
Permeabilisatie/wasbuffer	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri flow cytometer	BD Bioscience