Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Samenvatting

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Samenvatting

Discs large (Dlg) is een geconserveerd lid van de membraan-geassocieerde guanylaatkinasefamilie en dient als een belangrijk schakelend eiwit op de larvale neuromusculaire junctie (NMJ) in Drosophila. Eerdere studies hebben aangetoond dat de post-synaptische verdeling van Dlg op de larvale NMJ overlapt met die van Hu-li tai shao (Hts), een homoloog van de zoogdier-adducines. Bovendien wordt waargenomen dat Dlg en Hts een complex met elkaar vormen op basis van co-immunoprecipitatie-experimenten met gebruik van hele lysaten van volwassen vliegen. Vanwege de aard van deze experimenten was het echter onbekend of dit complex specifiek op de NMJ tijdens de larvale ontwikkeling voorkomt.

Proximity Ligation Assay (PLA) is een recent ontwikkelde techniek die meestal wordt gebruikt in cel- en weefselkweek en die eiwit-eiwit-interacties in situ kan detecteren. In deze assay worden monsters geïncubeerd met primaire antilichamen tegen de twee eiwitten van belang volgens standaard immuno-histochemische procedures. De primaire antilichamen worden vervolgens gedetecteerd met een speciaal ontworpen paar oligonucleotide-geconjugeerde secundaire antilichamen, PLA-sondes genaamd, die kunnen worden gebruikt om een signaal te genereren alleen wanneer de twee sondes in de nabijheid van elkaar zijn gebonden. Dus eiwitten die in een complex zijn, kunnen worden gevisualiseerd. Hier wordt gedemonstreerd hoe PLA kan worden gebruikt om in situ eiwit-eiwit-interacties op de larvale NMJ van Drosophila te detecteren. De techniek wordt uitgevoerd op preparaten van larvale lichaamswandspieren om aan te tonen dat een complex tussen Dlg en Hts inderdaad bestaat in het post-synaptische gebied van NMJ's.

Inleiding

Drosophila Discs grote (Dlg) is een geconserveerde lid van de membraan-geassocieerde guanylate kinase familie van steigers eiwitten die helpen orkestreren de assemblage van grote eiwitcomplexen op specifieke plaatsen van het plasmamembraan. Oorspronkelijk geïdentificeerd als een tumor suppressor eiwit, Dlg fungeert als een belangrijke determinant van epitheliale apicobasal polariteit ^1,2,3. DLG dient ook als een grote steiger module bij de neuromusculaire junctie (NMJ) in de door glutamaat motorische neuronen tijdens de larvale ontwikkeling ^4. DLG speelt diverse rollen in het larvale NMJ, en haar pleiotropism vertrouwt op zijn vermogen ....

Protocol

1. Body muur voorbereiden

OPMERKING: Bereiding van derde instar larven lichaamwanden (voor studie van de NMJs waarvan de lichaamswand spieren innerveren) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven in Brent et al ¹⁰ of Ramachandran en Budnik ^11,12, maar met enkele wijzigingen..

1. Ontleding
   1. Hef fly voorraden en kruisen bij 25 ° C gedurende 5-6 dagen volgens standaardprocedures ^13.
   2. Pick kruipen derde instar larven uit flesjes of flessen met behulp van fijne pincet.
   3. Was de larven in een kleine petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om eventue....

Resultaten

In wild-type derde instar larvale NMJs, wordt Dlg voornamelijk te vinden op de postsynaptische membraan van type I glutamatergische boutons, met Dlg immunoreactiviteit niveaus zijn meer uitgesproken bij type Ib boutons dan type is boutons (figuur 3A) ^4. HTS gehele spier aanwezig maar concentreert op de postsynaptische regio Hts immunoreactiviteit niveaus opgenomen gelijk zowel type I boutons en ook presynaptisch gevonden (Figuur 3A) ^8,17. Merk op dat de verdelingen.......

Discussie

Dit rapport toont aan hoe PLA kan worden toegepast op de Drosophila larven NMJ. De test wordt uitgevoerd op larvale lichaamswand spier voorbereiding van de opsporing van endogeen eiwit-eiwit interacties bij het NMJ. Met deze techniek Dlg en Hts worden getoond in dichte nabijheid van elkaar, en dus bestaan ​​in een complex, specifiek op de postsynaptische gebied ^27. Ter ondersteuning van dit resultaat, heeft een eerdere studie het bewijs van hun associatie met de volgende gegevens: 1) de immuunreactie.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Forceps (fijn #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Meng de elastomeerbasis en het uithardingsmiddel in een verhouding van 10:1. Laat 30 min. zetten. Giet in een mal (bijv. gebruik een 12-well cell culture plate). Laat minimaal 24 uur drogen. Hecht aan de deksel van een 60 x 15 mm Petri-schaal bij het disseceren.
Minutien Pins (0,0125 mm puntdiameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissectiescharen (ultrafijn)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Lijm twee 22 x 22 mm2 deksels op een microscoopglas met transparante nagellak, laat een <20 mm hiaat tussen voor het bevestigen van monsters.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	De stock werd opnieuw uitgebalanceerd over een GFP balancer, zodat homozygote mutanten kunnen worden geselecteerd op basis van de afwezigheid van GFP-signaal.
1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing): 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7,0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's oplossing	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science - 66194-300). Zie doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 voor instructies over het maken van de oplossing.
[header]
1x PBT (fosfaatgebufferde zoutoplossing met Triton): 1x PBS met 0,01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (rundesserumalbumine): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada - ALB001). Bewaar bij 4 °C.
muis anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Gebruik bij een 1:10 verdunning in 1% BSA.
konijn anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Verstrekt door Dr. Lynn Cooley (Yale University). Gebruik bij een 1:250 verdunning in 1% BSA.
konijn anti-Pak (p21-geactiveerde kinase)			Verstrekt door Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Gebruik bij een 1:500 verdunning in 1% BSA.
muis anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Gebruik bij een 1:5 verdunning in 1% BSA.
geit anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Gebruik bij een 1:200 verdunning in 1% BSA.
FITC-geconjugeerd ezel anti-geit	Jackson              ImmunoResearch	705-095-003	Gebruik bij een 1:200 verdunning in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-muis MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-konijn PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detectiereagentia Rood	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0,01 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Wash Buffer B: 0,2 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Wash Buffer B: 2 mM Tris, 1 mM NaCl, pH 7,5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Montage Medium met DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040