Snelle en robuuste analyse van Cellulaire en Moleculaire Polarisatie geïnduceerd door Chemokine Signaling

Samenvatting

Chemokine-signalering veroorzaakt duidelijke veranderingen in cellulaire morfologie en enkele belangrijke herverdelingen van intracellulaire eiwitten. Hier wordt een snel en gedetailleerd protocol geboden om deze gebeurtenissen te bestuderen.

Samenvatting

Cellen reageren op stimulatie door chemokine verliezen hun ronde vorm in een proces genaamd polarisatie, en door het veranderen van de subcellulaire lokalisatie van verschillende proteïnen. Klassieke beeldvormende technieken gebruikt om deze fenomenen. Echter, vereist zij de handmatige overname van vele cellen, gevolgd door tijdrovende kwantificering van de morfologie en de co-localisatie van de kleuring van tientallen cellen. Hier is een snelle en krachtige methode beschreven om deze fenomenen te bestuderen monsters uit meerdere duizenden cellen met een beeldvormende flowcytometrie technologie die de voordelen van een microscoop met die van een cytometer combineert. Met T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19 en kleuring voor MHC klasse I moleculen en filamenteuze actine, wordt een gating gepresenteerde gelijktijdig meten van de mate van veranderingen vorm en de mate van co-lokalisatie van markers die worden beïnvloed door CCL19 signalering. Bovendien is deze gating strategie liet ons toe om OBSERVe de segregatie van draadvormige actine (aan de voorzijde) en gefosforyleerd Ezrin-Radixin-Moesin (fosfo-ERM) eiwitten (aan de achterkant) in gepolariseerd T-cellen na CXCL12 stimulatie. Deze techniek was ook nuttig om de blokkerende effect op de polarisatie van twee verschillende elementen waarnemen: remming van actine polymerisatie door een farmacologische remmer en expressie van mutanten van de Par6 / atypische PKC signaleringsroute. Aldus wordt bewijs blijkt dat deze techniek nuttig is voor zowel morfologische veranderingen en eiwit herverdeling analyseren.

Inleiding

Chemokines zijn kleine oplosbare eiwitten die cellen aan te trekken om gespecialiseerde locaties ^1. Daarom zij deelnemen aan de juiste positionering van de cellen in weefsels, een cruciale functie in de ontwikkeling en fysiologie. Het immuunsysteem is geen uitzondering op deze regel als het gebaseerd is op de actie van vele verschillende celtypen die in onderling overleg handelen om een ​​effectieve immuunrespons. Door het regelen van de specifieke locatie van een immuun celtype in een bepaalde toestand, chemokinen vooraf vereist voordat vreemde antigenen kunnen worden gedetecteerd en geneutraliseerd.

In T-lymfocyten in het bijzonder, chemokines binden aan specifieke oppervlak receptoren die, de huisbediende ontlokken vele intracellulaire signalen (calcium stijging, ERK fosforylering, Rho GTPasen activering, toename van integrines affiniteit en cytoskelet wijzigingen) dat T-cel beweeglijkheid ^2,3 bevoordelen. Op cellulair niveau, kan men morfologische wijzigingen geïnduceerd op chemokine stimulatie observeren.Deze veranderingen in cel vormen zijn bijzonder dramatisch in T-cellen: rustende T cellen een druppelvormig ronde morfologie reizen binnen de bloedstroom. De detectie van de aanwezigheid van chemokinen in ontstekingsplaatsen of nabijheid van lymfoïde organen zal de vorm van T-cellen die nu vast een typische "hand-mirror" morfologie bestaande uit een bipolaire vorm veranderen: een leidende rand aan de voorzijde en een achterste rand, of Uropode, aan de achterkant ^4. Daarnaast kunnen intracellulaire componenten gescheiden in de twee tegenoverliggende gebieden van een gepolariseerde T-cel migratie ondersteunen. Bijvoorbeeld, actine filamenten polymerisatie stijgt op chemokine stimulatie ⁵ en gepolymeriseerd actine accumuleert aan de voorzijde van een gepolariseerde T-cel ^2. Anderzijds, verscheidene eiwitten, zoals gefosforyleerde eiwitten van de Ezrin-Radixin-Moesin (ERM) familie die het plasmamembraan koppelen aan de corticale F-actine cytoskelet, opnieuw lokaliseren de Uropode gepolariseerdeT-cellen ^6. Interessant wij en anderen hebben aangetoond dat dit polarisatieproces vereist voor T celmigratie. Inderdaad, zal er geen behandeling die interfereert met polarisatie cellulaire beweeglijkheid remmen. Bijvoorbeeld, remming van de activiteit van de leden van de atypische eiwitkinasen C (PKC) families, PKCζ en PKCι blokken T cel polarisatie en hun trekkende scannen van dendritische cellen ^7. T-cel polarisatie wordt ook geregeld door Rho GTPasen. We hebben aangetoond dat de modulatie van RhoA activiteit van de recent beschreven Fam65b eiwit interfereert met T cel veranderingen in morfologie en hun vermogen om te migreren in Transwell assay ^6. Als polarisatie voorwaarde stap voor cellulaire motiliteit, is dus cruciaal te kunnen kwantificeren als belangrijkste uitlezen van chemokine reacties. Cel vorm verbouwingen waren eerder handmatig ⁸ gemeten. Echter, dergelijke kwantificering is zeer tijdrovend, waardoor gewoonlijk slechts enkeletientallen cellen rekening gehouden.

Hier wordt een nieuwe methode voorgesteld om snel kwantificeren van de mate van veranderingen vorm van T-lymfocyten blootgesteld aan stimulatie chemokine. Een imaging flowcytometrie technologie (zie tabel specifieke reagentia / Apparatuur) gebruikt, die de voordelen van een stromingscytometer en een microscoop ⁹ combineert efficiënt kwantificeren van de hoeveelheid gepolariseerde cellen onder verschillende condities van chemokine stimulatie. Naast de kwantificering van de morfologische veranderingen die robuust kan meten met deze techniek, is het ook mogelijk om veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van sommige eiwitten op chemokine signalering evalueren.

Protocol

1. Bereiding van T lymfocyten

1. Bereid primaire muis of humane T cellen zoals beschreven ^10,11.
2. Telen menselijke T-cellen in compleet RPMI-medium met 10% humaan AB serum bij een dichtheid van 2-3 x 10 ⁶ cellen / ml.
   Opmerking: Het gebruik van foetaal kalfsserum (FCS) in plaats van humaan serum kan spontane polarisatie van een groot deel van humane T-cellen in kweek te wekken. Bewaar deze cellen in kweek gedurende 4-5 dagen en verder verwerken ze op elk moment gedurende deze periode.
3. Handhaaf muis T-cellen in volledig RPMI medium aangevuld met 10% FCS in een soortgelijk celdichtheid. Gebruik direct of de volgende dag, na een O / N kweek bij 37 ° C in aanwezigheid van 10 ng / ml IL7.
4. Cultiveren CEM humane T-cellijn in compleet RPMI aangevuld met 10% FCS.

2. Chemokine Stimulatie

1. Was 5 x 10 ⁵ cellen per experimentele conditie in warm HBSS medium aangevuld met 10 mM Hepes. Voor sommige experimenten, co-transfectie van primaire menselijke T-cellen de dag ervoor met 2 ug pmaxGFP en 8 ug pcDNA3.1 ⁺ (lege vector, controle), PKCζ kinase dood, of N-terminale Par6 plasmiden.
2. Resuspendeer de cel pellet in warm HBSS-Hepes medium (gebruik 0,3 ml x aantal experimentele condities).
3. Verdeel de cellen in 1,5 ml microcentrifuge buisjes.
   OPMERKING: Daarom zal één buis overeenkomt met één experimentele conditie 5 x 10 ⁵ cellen bevatten in 0,3 ml HBSS-Hepes medium. Voor sommige experimenten, voeg 500 nM latrunculine A of drager (DMSO) en incubeer de cellen gedurende 30 min voor chemokine stimulatie.
4. Voeg 10 tot 500 ng / ml CCL19 of CXCL12 chemokine in elke buis.
   LET OP: We gebruiken meestal 10-200 ng / ml chemokine voor menselijke T-cellen. CEM cellen niet drukken de CCR7-receptor die CCL19 bindt. Daarom zal CEM cellen alleen in staat om te reageren op een CXCL12 stimulatie. Bovendien gebruiken hogere chemokine concentraties (300-500 ng / ml), muis T-cellen polariseren.
5. Flip de tubes meerdere malen en incubeer ze in een 37 ° C waterbad gedurende 8 of 10 minuten voor primaire T-cellen of CEM respectievelijk.
6. Stop de polarisatie proces door aan elke buis 0,3 ml van een warme oplossing met 2% paraformaldehyde (PFA) en 10 mM Hepes in PBS. Flip de buizen en incubeer ze bij 37 ° C gedurende 5 min.

3. kleuringen

1. Breng de cellen van de reactievaatjes aan flowcytometrie buizen.
2. Vul de buizen volledig met RB oplossing die 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5 mM EDTA en 10 mM Hepes in PBS.
3. Centrifugeer de buizen bij 460 g gedurende 4 min.
4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 pl van een RT oplossing met 5% FCS in PBS.
5. Voeg 5 ul FITC-anti-HLA-ABC in elke buis, vortex hen en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
6. Was de cellen eenmaal met PBS met 5% FCS, eennd eenmaal met alleen PBS.
7. At RT: voeg 500 ul 1% PFA, incubeer gedurende 10 min, daarna wassen cellen met een oplossing die 1% BSA, 0,5 mM EDTA en 10 mM HEPES in PBS.
8. Verwijder het supernatant, vul de buizen volledig met een oplossing van PBS met 0,2% BSA, 0,1% saponine, 0,5 mM EDTA en 10 mM Hepes (permeabilisatie buffer).
9. Was de cellen tweemaal in dit medium.
10. Flip de buizen het medium te verwijderen en vortex ze de celpellet dissociëren.
11. Voeg 0,25 pg / ml TRITC-Phalloidin en / of een 1: 100 verdunning van anti-P-ERM antilichaam aan elke buis, vortex hen en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
12. Was de cellen met de permeabilisatie buffer. Incubeer met een fluorescerende secundaire antilichaam indien nodig.
13. Resuspendeer de cellen in 200 ul PBS en overbrengen naar microcentrifugebuizen.
    OPMERKING: Cellen zijn klaar voor overname. Alternatief, terwijl maximaal totaal volume van 200 gl per buis, voeg geconcentreerd PFA tot een uiteindelijke 1%concentratie teneinde de kleuringen behouden wanneer de cellen niet worden gebruikt op dezelfde dag voor verdere verwerking.

4. Images Acquisition and Analysis

1. Schakel het apparaat (zie Tabel van specifieke reagentia / Equipment) en laat hem zelf te kalibreren volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: De INSPIRE-software werd gebruikt met een 40X objectief (0,75 NA). De ideeën 3.0-software werd gebruikt voor alle gerapporteerde kwantificeringen.
2. Maak een reeks overname ramen die kunnen worden opgeslagen in een sjabloon voor toekomstige experimenten. Teken histogrammen dat de RMS-gradiënt waarden te kwantificeren. Van de "In Focus" bevolking, geselecteerd op de RMS gradiënt histogram, begrenzen de "Single cell" populatie op een histogram van de omgeving. Zodra de microcentrifugebuisje heeft in de machine is geplaatst, past het laservermogen, hek aan individuele cellen en het verwerven van 5000 T-lymfocyten.
3. In de Ideeën zachteware, opent de overname bestand en maak een histogram dat de waarde van de gradiënt RMS-waarde voor helderveld beelden zal tonen (kanaal 1) verkregen voor elke individuele cel. Teken een hek aan de RMS gradiënt histogram dat cellen vertonen RMS gradiënt waarde boven 57 beschouwt.
   OPMERKING: De RMS gradiënt hiermee rekening te houden bij de analyse alleen de T-lymfocyten die in het brandvlak. We hebben empirisch vastgesteld dat individuele cellen vertonen een RMS-gradiënt waarde superieur is aan 57 zijn in het brandvlak, en nauwkeurig kan worden beschouwd.
4. In de analyse / Maskers menu, maak een nieuw masker, genaamd Erode (M01,2) van de morfologie masker op de helderveld beelden M01, geërodeerde van 2 pixels. Daarna, in de analyse / Features menu, een nieuwe functie van de ruimte, berekend over het eroderen (M01,2) masker. Van de geselecteerde in de vorige poort cellen, opent een histogram dat de omgeving van de cellen met behulp van deze nieuw gecreëerde masker.
   OPMERKING: De morfologie maskers die beschikbaar zijn doorStandaard zijn veel groter dan de werkelijke grootte van de cel. Zo is nauwkeuriger te eroderen tot 2 pixels.
5. Teken een hek aan de individuele T-cellen, met uitzondering van de kalibratie kralen en puin (klein gebied) en de wambuizen (grote Area). Stel deze poort bij elke aankoop.
   OPMERKING: Variaties in celgrootte de positie van de poort beïnvloeden. Een muis T-cellen zijn kleiner dan menselijke T-cellen die zelf kleiner is dan CEM cellen, zal het gebied van elke celtype evenredig met de grootte.
6. Gezien de single, focus cellen die werden afgesloten in de vorige stappen, opent een puntenplot bestaande uit de ruwe Max pixel op het HLA-ABC kleuring (kanaal 2, x-as) als functie van de Raw Max pixel op de phalloidin kleuring (Channel 4, y-as). Maak een poort naar de ongekleurde of verzadigd fluorescerende gebeurtenissen uit te sluiten. Open twee histogrammen tonen de Raw Max Pixel voor HLA-ABC (kanaal 2) en phalloidin (Channel 4) kleuringen.
7. In de analyse / Maskers menu, createa nieuw masker, genaamd Erode (M02,2) van de morfologie masker van de HLA-ABC gekleurde cellen (Channel 2), geërodeerde van 2 pixels. Daarna, in de analyse / Features menu, maak dan een nieuwe functie, bestaande uit de parameter Circulariteit, berekend op Eroderen (M02,2).
   OPMERKING: Deze parameter meet de afwijking van de cel vorm van een cirkel. Daarom zal een perfect ronde T-cel een hoge circulariteit waarde terwijl langgerekte gepolariseerde cellen zullen een lage cirkelvormigheid index exposeren.
8. Vervolgens maakt een histogram dat de waarden van de functie Recursiviteit van de eerder gated cellen rapporteert. Met dit histogram direct plot de verdeling van een individu, in-focus celpopulatie volgens de waarde van de Recursiviteit per individuele cel.
9. Kijkend naar de vorm van het histogram voor niet gestimuleerde cellen opneming van een poort voor gepolariseerde cellen, beginnend bij de laagste circulariteit waarde tot de circulariteit grenswaarde waar de meeste van de niet gestimuleerde cellenworden uitgezet. Kijk naar de statistieken display voor het percentage van de gepolariseerde cellen onder de gated bevolking (% Gated).
   LET OP: Wij hebben deze poort voor Circulariteit index waarden onder 13 in te stellen.
10. Om te kijken naar de polarisatie van het actine kleuring in de cellen plot een histogram voor de heldere details Gelijkenis R3 waarde, het vergelijken van de HLA-ABC kleuring (kanaal 2) en de phalloidin kleuring (Channel 4).
    OPMERKING: Hoe groter de waarde van deze functie, hoe meer bovenop de twee kleuringen zijn.
11. Met dezelfde gating strategie als voorheen, breng een hek aan de niet-gestimuleerde cellen voor de gescheiden kleuring dat het percentage cellen met gepolariseerde actine kleuring toont.
12. Wanneer voltooid, het percentage cellen vertonen een scheiding in de verdeling van de MHC klasse I en falloïdine kleuringen het percentage gepolariseerde cellen met de gemiddelde waarden van de Recursiviteit en Gelijkenis indexen van alle cellen ± SD wordt in corresponding statistieken panelen.

Resultaten

Het eerste voorbeeld hier gekozen heeft betrekking op het gebruik van menselijke primaire T-lymfocyten gestimuleerd met CCL19. Echter, kan dezelfde strategie worden toegepast met primaire muis T-cellen, T-cellijnen of ander celtype reageren op chemokine stimulatie. De gating strategie hier gepresenteerde omvat een reeks vensters die de gefocusseerde evenementen, dan de enkele cellen selecteren. Tenslotte het bereik van fluorescentie-intensiteit gevolgd hier als voorbeeld twee markers: de MHC klasse I HLA-ABC en filament...

Discussie

Een recente techniek van beeldvorming flowcytometrie, een snelle en informatieve gating strategie analyseren cellulaire en moleculaire gebeurtenissen geïnduceerd door chemokine stimulatie wordt gepresenteerd. De veranderingen in celmorfologie geïnduceerd door chemokine stimulatie en de subcellulaire verdeling van verschillende eiwitten tijdens het polarisatieproces: Uit één experiment kan men twee soorten informatie. Interessant is bewijs ook voorzien in de mogelijkheid om een ​​groot aantal cellen, die statistische rob...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI	Gibco	61870-010
Human serum AB	PAA	C11-021	Voorverwarmen om het complement te inactiveren.
Fetal calf serum	PAN Biotech	P30-3300	Voorverwarmen om het complement te inactiveren.
Human T cell nucleofactor kit	Lonza	VCA-1002
Murine IL7	Peprotech	217-17
HBSS	Gibco	14025-050	Opwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik.
Hepes	Gibco	15630-056
Murine CCL19	Peprotech	250-27B	Porties worden ontdooid op ijs voordat de chemokine aan de cellen wordt toegevoegd.
Human CCL19	Peprotech	300-29B	Porties worden ontdooid op ijs voordat de chemokine aan de cellen wordt toegevoegd.
Human CXCL12	Peprotech	300-28A	Porties worden ontdooid op ijs voordat de chemokine aan de cellen wordt toegevoegd. Deze chemokine kan ook worden gebruikt op muis T-cellen.
PFA	Electron Microscopy Sciences	157-8-100	Dit is een 8% PFA-oplossing in water. Meng volume op volume met 2x PBS om een 4% PFA-oplossing in PBS te verkrijgen.
BSA	Sigma	A3059
Saponin	Fluka	84510
Alexa Fluor 594 phalloidin	Invitrogen	A12381
FITC-anti-HLA-ABC antilichaam	Beckman Coulter	IM1838	clone B9.12.1
Anti-P-ERM antilichaam	Cell Signaling Technology	3149P
ImageStreamx Mark II	Amnis