Automatiseren van ChIP-seq Experimenten om Genereer Epigenetische Profielen op 10.000 HeLa-cellen

Samenvatting

Methoden voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties worden cruciaal voor elk aspect van genomisch onderzoek, maar ze zijn arbeidsintensief, duur en tijdrovend. Hier wordt een commercieel verkrijgbaar robotsysteem voor vloeistofbehartiging gepresenteerd dat chromatine-immunoprecipitatie automatiseert voor het in kaart brengen van in vivo eiwit-DNA-interacties met beperkte hoeveelheden cellen.

Samenvatting

Chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door next generation sequencing (ChIP-seq) is een techniek bij uitstek voor het bestuderen van eiwit-DNA-interacties. ChIP-seq is gebruikt voor het in kaart brengen van eiwit-DNA-interacties en het toewijzen van histonenmodificaties. De procedure is tijdrovend en bewerkelijk, en een van de grootste beperkingen is de behoefte aan grote hoeveelheden uitgangsmateriaal, meestal miljoenen cellen. Automatisering van chromatine-immunoprecipitatie-assays is mogelijk wanneer de procedure gebaseerd is op het gebruik van magnetische kralen. Succesvolle geautomatiseerde protocollen voor chromatine-immunoprecipitatie en bibliotheekvoorbereiding zijn specifiek ontworpen op een commercieel verkrijgbaar robotisch systeem voor vloeistofverwerking, voornamelijk bestemd om epigenetische assays te automatiseren. Eerst werd validatie van geautomatiseerde ChIP-seq-assays getoond met behulp van antilichamen gericht tegen verschillende histon-modificaties, gevolgd door optimalisatie van de geautomatiseerde protocollen om chromatine-immunoprecipitatie en bibliotheekvoorbereiding uit te voeren, beginnend met lage celgetallen. Het doel van deze experimenten is om een waardevol hulpmiddel te bieden voor toekomstige epigenetische analyse van specifieke celtypen, subpopulaties en biopsiemonsters.

Inleiding

Zoals Next-Generation Sequencing (NGS) technologieën wijdverspreid en toegankelijker zijn geworden, de eerste methode voor genoom kartering van eiwit-DNA-interacties nu chromatine immunoprecipitatie gevolgd door NGS detectie (ChIP-seq), die de ontdekking van transcriptiefactor maakt bindingsplaatsen of patronen van histon modificaties. ChIP-seq is voordelig leveren van high-throughput data van het gehele genoom kan worden gebruikt voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van het eiwit-DNA interacties door meting van de verrijkte DNA-fragmenten. Er zijn enkele nadelen in standaard ChIP-seq experimenten zoals de moeilijkheid om voldoende materiaal om een ​​sequentie bibliotheek te creëren.

ChIP experimenten zijn onderverdeeld in zes eenvoudige stappen, waaronder 1) het verknopen van eiwit-DNA-binding regio 2) monstervoorbereiding die cellysis en scheren van het chromatine door geluidsgolven, 3) de vorming van de immunocomplexen omvat,4) precipitatie van de immuuncomplexen, 5) wassen van de immuuncomplexen, en 6) elutie van het verrijkte materiaal en analyse door qPCR en NGS.

Het succes van een ChIP assay is afhankelijk van drie factoren: een goede chromatine voorbereiding, de hoeveelheid antigeen in het oorspronkelijke monster en de specificiteit en affiniteit van het antilichaam voor het verwante antigeen. Een belangrijke beperking is de eis van grote hoeveelheden vanaf celaantallen om voldoende verrijkte DNA een sequentie bibliotheek te creëren verkrijgen. Voor wetenschappers die werken met beperkte steekproef hoeveelheden, zoals biopsie monsters of cel subpopulaties, ChIP-seq experimenten zijn zeer uitdagend. Recente studies hebben aangetoond dat ChIP-seq testen kunnen worden uitgevoerd bij het ​​werken met een lage hoeveelheid cellen ^{1, 2.} Diagenode heeft een robot vloeistofverwerkingsysteem die volledig ChIP-seq experimenten automatiseren wanneer wordt uitgegaan van een beperkt aantal cellen ontwikkeld.

Automation biedtvele voordelen ten opzichte van handmatige bereiding van ChIP-seq monsters zoals het vermindert menselijke fouten, vermindert de variabiliteit, en vermindert de experimentele kosten. Semi-geautomatiseerde protocollen voor chromatine immunoprecipitatie en voorbereiding bibliotheek is gemeld, maar geen van deze studies is gebleken bij het ​​gebruik van lage aantallen cellen ^{3, 4, 5, 6.}

In deze paper wordt een compleet geautomatiseerde workflow wordt beschreven voor zowel chromatine immunoprecipitatie en voorbereiding bibliotheek assays in een robot-vloeistof handling systeem dat magnetische-kraal gebaseerde technologie gebruikt en dat kan aanpakken meerdere parameters in het protocol optimalisatie. Hier geautomatiseerd ChIP-seq experimenten succes uitgevoerd op een beperkt aantal cellen met het doel van vereenvoudiging, standaardisering en een betrouwbare oplossing epigenetische profielen kleine celpopulaties te bestuderen. De geautomatiseerde ChIP protocol beschreven in dit document is geoptimaliseerd op HeLa-cellen met behulp van specifieke histon-antilichamen en reagentia but de workflow kan worden aangepast aan andere cellijnen en antilichamen met overeenkomstige experimentele optimalisatie.

Protocol

1. standaardchip Experimenten

1. Celinzameling en DNA-eiwit verknoping.
   1. Groeien HeLa-S3-cellen een confluentie van 80% -90%. Verwijder kweekmedium was de schaal tweemaal met 10 ml van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en voeg trypsine-EDTA (1x) aan de gekweekte plaat. Incubeer gedurende maximaal 2 minuten om de cellen los te maken van de schaal. Verzamel cellen en tweemaal wassen met 10 ml PBS.
      OPMERKING: Langere incubatietijd zal leiden tot beschadiging van cellen.
   2. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 xg en resuspendeer de cellen in 20 ml PBS. Ga verder naar de cellen te tellen.
   3. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 xg, de bovenstaande vloeistof en voeg 500 pl PBS. Het optimale aantal cellen voor de fixatiestap 10 miljoen cellen per 500 pl PBS.
   4. Voeg 13,5 ul vers 37% formaldehyde in elk monster van 500 ui celsuspensie. Fixeer de cellen gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Voeg 57 ul van 1,25 M glycine solution om de fixatie te stoppen. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder constant mengen door voorzichtig vortex. Werken op het ijs vanaf dit punt.
   6. Centrifugeer de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof zonder de celpellet.
   7. Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS. Gooi voorzichtig het supernatant en houd de cel pellet op ijs.
2. Cell lysis en chromatine afschuiving
   1. Voeg 10 ml ijskoude lysisbuffer iL1 de celpellet (1 ml lysisbuffer per 1.000.000 cellen is de optimale verhouding). Pipet op en neer meerdere malen en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C onder zacht mengen.
   2. Centrifugeer het lysaat gedurende 5 min bij 500 xg en 4 ° C. Verwijder het supernatant.
   3. Voeg 10 ml ijskoude lysisbuffer IL2 de lysaten en meng voorzichtig door en neer te pipetteren. Incubeer de lysaten gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
   4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 xg en 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
   5. Prepare totale afschuiving buffer toevoegen van 200x proteaseremmer cocktail (PIC) het IS1 afschuiving buffer. Houd de buffer op ijs gedurende 5 minuten en werken op ijs achteraf. Voeg 1 ml van de volledige IS1 afschuiving buffer elke 10 miljoen cellen pellet en meng door en neer te pipetteren. Voorafgaand aan sonicatie incubeer de monsters op ijs gedurende 10 min om de viscositeit van het monster te verminderen.
   6. Afschuiving 300 ul aliquots van chromatine door sonicatie behulp van een waterbad ultrasoonapparaat 2 tot 3 sets van 10 cycli elk. Een cyclus bestaat uit 30 sec "ON" en 30 sec "OFF" op een hoge energie-instelling. U kunt ook gebruik maken van een pico-geluidsgolven apparaat met een kortere sonicatie tijd van 5 tot 10 cycli van 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Kort vortex en spin de buizen tussen de runs. Bij het gebruik van andere soorten sonicators Volg bijbehorende instructies van de fabrikant voor het chromatine scheren.
   7. Centrifugeer de geschoren chromatine bij 16.000 xg gedurende 10 min en Collect de supernatant onmiddellijk gebruik in de IP stap. Alternatief bewaar het chromatine bij -80 ° C gedurende maximaal 2 maanden voor toekomstig gebruik.
   8. Analyseer de chromatine scheren efficiëntie voorafgaand aan immunoprecipitatie stap met behulp van 1-1,5% TAE agarose gels of bionalyzer. Optimale chromatine fragment grootte variëren tussen 100-600 bp.

2. Lage celchip Experimenten

1. Celinzameling en DNA-eiwit verknoping
   1. Groeien HeLa-S3-cellen een confluentie van 80% -90%. Verwijder kweekmedium was de schaal tweemaal met 10 ml van 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), en voeg 1x trypsine-EDTA op de gekweekte plaat. Incubeer gedurende maximaal 2 minuten om de cellen los te maken van de schaal.
      OPMERKING: Langere incubatietijd zal leiden tot beschadiging van cellen.
   2. Verzamel cellen door toevoeging van 1 ml kweekmedium dat serum in een 1 ml centrifugebuis. Tel de cellen.
   3. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 x g. Breng het aantal cellen10.000 cellen per ml kweekmedium voor de fixatie.
   4. Voeg 27 ul van 36,5% vers bereid formaldehyde in elke buis voor de fixatie. Inverteer de buis twee of drie keer en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Voeg 115 ul van 1,25 M glycine-oplossing aan het monster keer de buis twee of drie keer en incubeer 5 min bij RT. Werken op het ijs vanaf dit punt.
   6. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant langzaam.
   7. Was de cellen met 1 ml ijskoude HBSS met PIC (200x, uiteindelijke concentratie 1x). Inverteer de buis twee of drie keer om de cellen en resuspendeer centrifuge bij 300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi voorzichtig het supernatant en houd de cel pellet op ijs.
2. Cell lysis en chromatine afschuiving
   1. Voeg 25 ul van complete lysisbuffer tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) per 10.000 cellen en beweeg handmatig de bodem van de buis om de cellen te resuspenderen. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
   2. Voeg 75 ul volledig HBSS (HBSS + PIC) buffer in elk aliquot met 10.000 cellen.
   3. Afschuiving 100 ul aliquots van 10.000 cellen door sonicatie gedurende 5 sets van 5 elke cyclus. Een cyclus bestaat uit 30 sec "ON" en 30 sec "OFF" op de hoge energie-instelling. U kunt ook gebruik maken van een pico-geluidsgolven apparaat gebruikt met een kortere sonicatie tijd van 5 cycli van 30 sec "ON", 30 sec "OFF". Optimale chromatine fragment grootte variëren tussen 100-600 bp. Merk op dat chromatine voorbereidingen, celtypes en verschillende sonicators vereisen aparte scheren optimalisatie experimenten.
   4. Centrifugeer de geschoren chromatine bij 14.000 xg gedurende 10 min naar het onoplosbare materiaal de bovenstaande vloeistof en het verzamelen onmiddellijk gebruik in de IP stap. Alternatief bewaar het chromatine bij -80 ° C gedurende maximaal 2 maanden voor toekomstig gebruik.
   5. Analyseer de chromatine scheren efficiëntie voorafgaand aan immunoprecipitatie stap met behulp van 1-1,5% TAE agarose gels ofde bionalyzer. Behandel monsters met RNase voor gelanalyse agarose om de visuele beoordeling van het scheren verbeteren. Optimale chromatine fragment grootte variëren tussen 100-600 bp.

3. chromatine Immunoprecipitatie en Bibliotheek Prep

1. Voor standaard geautomatiseerde chip experimenten
   1. Voeg 120 ul van de chip Buffer H (CHIP Buffer H + PIC) tot 100 ul geschoren chromatine. Gebruik 200 ul voor de IP en houden 2 pl tot 20 pl als input monster.
   2. Selecteer de geautomatiseerde chip 200 ul-protocol in de automatisering instrument. De doorvoer van het protocol is 1 tot 16 monsters per run.
   3. Uitvoeren van een geautomatiseerde ChIP experiment met behulp van, chromatine corresponderende tot 1-2 miljoen cellen, 1-2 ug van anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 en H3K9me3 ChIP-seq leerjaar konijn polyklonale antilichamen. Optimale antilichaam hoeveelheden variëren afhankelijk van de histon-eiwitten en de affiniteit en specificity van de corresponderende antilichaam.
      1. Gebruik gelijke hoeveelheden van niet-immune konijn IgG als een isotype controle antilichaam. U kunt ook gebruik maken van niet-gecoate kralen of specifieke geblokkeerd antilichaam als ChIP controles. Voeg 20 ul Proteïne A-gecoate magnetische korrels voor elke reactie.
   4. Gebruik de geautomatiseerde histon ChIP-seq kitreagentia om geautomatiseerde chip experimenten uit te voeren met anti-H3K79me3 en -H3K4me2 polyklonale antilichamen. Gebruik de ideale ChIP-seq kitreagentia chip experimenten uit te voeren met anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 en -H3K9me3.
   5. Selecteer de geautomatiseerde chip-protocol na de software-instructies in de automatisering apparaat geïmplementeerd. Stel de ChIP experimentele parameters tot 4 uur voor het antilichaam bekledingsstap en 15 uur voor de immunoprecipitatie stap. De omgekeerde crosslinking plaats vindt in het geautomatiseerde instrument bij 65 ° C gedurende 4 uur.
   6. Zuiver het omgekeerde verknoopt DNA op het automatische systeem. Selecteer automated protocollen voor DNA-zuivering met een protocol of kit met behulp van magnetische kraal gebaseerde DNA-zuivering. Elueer het DNA in 25 ui water.
   7. Kwantificeren immunologisch DNA door extractie 10% van de immunologisch DNA. De immunologisch DNA rendement afhankelijk van de kwaliteit van het chromatine en antilichamen, celtype en de beoogde histon modificatie. Kwantificeren van het DNA met een testkit volgens de instructies van de fabrikant.
   8. Analyseer de kwaliteit van het immunologisch DNA door kwantitatieve PCR met primers voor ten minste 1 positieve en negatieve controle 1 genomische regio. Gebruik niet meer dan 10% van de totale immunologisch DNA voor het beoordelen ChIP verrijkingen.
      1. Bereid de qPCR reacties. Voeg 10 ul van een 2x SyberGreen qPCR meester mix, 1 ui van primer mix, 1-5 pi immunogeprecipiteerd of ingang DNA en steriel water tot 20 pl uiteindelijke reactie volume. Het qPCR programma omvat een initiële denaturatie bij 95 ° C5-10 min afhankelijk van de leverancier van het Taq polymerase en de annealing temperaturen worden ingesteld volgens de geselecteerde primers.
   9. Geautomatiseerde bibliotheek prep protocollen verenigbaar met de commercieel verkrijgbare Illumina ChIP-seq preparaat bibliotheek reagentia bibliotheken beide Chip DNA als de opgeslagen invoer DNA uit dezelfde chromatine bereiding bouwen. Gebruik 10-20 ng immunogeprecipiteerd DNA van elk antilichaam voor bibliotheek voorbereiding. Bereid tot 16 geautomatiseerde bibliotheken per run.
   10. Sequentie bibliotheken en genereren clusters volgens de instructies Illumina fabrikant. Voeren primaire bioinformatica analyse (cluster filtering, basis roeping, etc.) naar aanleiding van de standaard Illumina pijplijn, filter en lijn de leest de laatste menselijk genoom assemblage (huidige versie is GRCh38) met de ELANDANTILOPE aligner. Gebruik SICER ⁷ of MACS ⁸ voor piek roeping en de downstream-analyses van de pieken te voeren wet Homer ^9, BEDTools ¹⁰ of voorkeur software.
2. Voor lage cel aantal geautomatiseerde chip experimenten
   1. Voeg 120 ul van complete ChIP buffer TC1 (CHIP Buffer TC1 + PIC) tot 100 ul geschoren chromatine. Gebruik 200 ul voor de IP en houd 20 pi als input.
   2. Selecteer geautomatiseerde chip 200 ul-protocol in het automatiseringssysteem. De doorvoer van het protocol is 1 tot 16 monsters per run.
   3. Uitvoeren van een geautomatiseerde ChIP-seq experiment met behulp van geautomatiseerde chip reagentia en ChIP leerjaar antilichamen geoptimaliseerd om te werken aan lage chromatine hoeveelheden. Gebruik chromatine overeenkomend met 10.000 cellen en 100.000 cellen 0,5 ug anti-H3K27me3, 0,25 pg -H3K4me3, 0,1 ug -H3K27ac, 0,25 pg -H3K9me3 konijn Premium ChIP-seq rang konijn polyklonale antilichamen. Optimale antilichaam hoeveelheden variëren afhankelijk van de histon-eiwitten en de affiniteit en specificiteit van het betreffende antilichaam.
      1. Gebruik gelijke hoeveelheid niet-immune rabbit IgG als een isotype controle antilichaam. U kunt ook gebruik maken van niet-gecoate kralen of specifieke geblokkeerd antilichaam als ChIP controles. Voeg 10 ul Proteïne A-gecoate magnetische korrels voor elke reactie.
   4. Selecteer de geautomatiseerde chip-protocol na de software-instructies in de automatisering apparaat geïmplementeerd. Stel de ChIP experimentele parameters tot 4 uur voor het antilichaam bekledingsstap en 15 uur voor de immunoprecipitatie stap. De omgekeerde crosslinking plaats vindt in het geautomatiseerde instrument bij 65 ° C gedurende 4 uur.
   5. Zuiver reverse verknoopt DNA met spinkoloms volgende instructies van de fabrikant en elueren in volumes van 6 pl tot 25 pl water.
   6. Kwantificeren van het DNA met een commercieel testkit. Analyseer de resultaten door qPCR met primers voor positieve en negatieve controlegebieden de snipperkwaliteit evalueren.
   7. Gebruik een bibliotheek voorbereiding kit met geoptimaliseerde bibliotheek voorbereiding reagentia aan bibliotheken met lage DNA quan bereidenheden. Gebruik 30 pg en 300 pg van de chip DNA (respectievelijk overeenkomend met 10.000 en 100.000 cellen experimenten) voor de bibliotheek voorbereiding. Bereid bibliotheken met behulp van de geautomatiseerde protocol compatibel met bibliotheek voorbereiding reagentia. De geautomatiseerde bibliotheek prep doorvoer is 1-48 bibliotheken per run.
   8. Na het einde herstel van het dubbelstrengs DNA-matrijzen, ligeren de splitsbare stamlus adapters bevattende de sequentie primerplaatsen. Naar aanleiding van de DNA-extensie stap, versterken van het monster met de high-fidelity amplificatiewerkwijze in de bibliotheek voorbereiding kit protocol beschreven.
   9. Na bibliotheek versterking, te kwantificeren en te zuiveren van de bibliotheken na de bibliotheek voorbereiding kit richtlijnen. Merk op dat de grootte selectie na zuivering is niet noodzakelijk.
   10. Sequentie van de bibliotheken en het genereren van clusters volgens de instructies van de fabrikant. Voeren primaire bioinformatica analyse (cluster filtering, basis roeping, etc.) naar aanleiding van de standard fabrikant pijpleiding, filter, en lijn de leest de laatste menselijk genoom assemblage (huidige versie is GRCh38) met de ELANDANTILOPE ⁷ aligner. Gebruik SICER ⁸ of MACS ⁹ voor piek roeping en de downstream-analyses van de pieken te voeren met Homer, BEDTools ^10, of elke gewenste software.

Figuur 1. Screenshots van de software te laten zien hoe het opzetten van geautomatiseerde chip experimenten in het IP-Star Compact. De software biedt de flexibiliteit om de hoeveelheid monsters per run selecteren, evenals de belangrijkste experimentele parameters (Antibody Coating, IP en wast veranderen ) volgens de onderzoeker behoeften. De geautomatiseerde procedure maakt het testen van verschillende omstandigheden in parallel (dwz verschillende soorten en hoeveelheden antilichamen, verschillende soorten en hoeveelheden van cellen en zelfs verschillende types en hoeveelheden magnetische korrels in dezelfde run. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2. Screenshots van de software te laten zien hoe het opzetten van geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor de next generation sequencing met behulp van de bibliotheek kit in het automatiseringssysteem. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Resultaten

Het optimaliseren van geautomatiseerde ChIP-seq experimenten voor acht verschillende histon markers

Om met succes te ontwikkelen en valideren van de geautomatiseerde chip protocollen, ChIP-seq leerjaar antilichamen die eerder werden gevalideerd in manuele ChIP-Seq-experimenten (gegevens niet getoond) werden geselecteerd. De volgende ChIP-seq leerjaar antilichamen werden gekozen voor deze studie: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 en -H3K9me3. De specificiteit van alle ChIP-seq leerjaar antilichamen is reeds bevestigd door dot blot, peptide arrays en Western Blot experimenten (gegevens niet getoond). Pilot ChIP-qPCR experimenten met toenemende hoeveelheden antilichaam werden uitgevoerd om de gevoeligheid van de antilichamen (Figuur 3) te bepalen. qPCR met minstens twee positieve en twee negatieve controle targets werden geanalyseerd en profielen met verrijkingen van positieve dan negatieve doel hoger dan vervijfvoudigd zijn gekwalificeerd voor sequencing exper iments. Het is belangrijk chip en ChIP-seq experimenten met een hoge geschoren chromatine. Alle ChIP experimenten aangetoond in deze publicatie werden uitgevoerd met behulp van verse chromatine. Het is ook mogelijk de gefixeerde cellen bevriezen bij -80 ° C en de procedure chromatine voorbereiding en afschuiven op een andere dag. Echter, chromatine bereid uit bevroren gefixeerde cellen kunnen anders gedragen chromatine vers bereid en daardoor sonicatie voorwaarden moet worden geoptimaliseerd voor elke chromatine voorbereiding. Bij het werken met verschillende celtypen, kunnen afschuiven buffers met verschillende wasmiddelen (SDS) worden gebruikt. Celtypen zoals primaire cellijnen of cellen gekweekt in suspensie moeilijk cellen afschuiving en vereist hoge concentraties SDS (1%), terwijl cellijnen die gemakkelijk afschuiving zoals HeLa SDS lage concentraties (0,1%) in het nodig zijn scheren buffers.

res.jpg "/>
Figuur 3. Validatie van de chip-grade antilichamen met behulp van het automatiseringssysteem. Chip werd uitgevoerd met anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 en -H3K9me3 konijn polyklonale antilichamen op geschoren chromatine uit 1.000.000 HeLa-S3-cellen afhankelijk van de histonmodificaties. Geautomatiseerde ChIP protocollen met 200 ui werken volumina werden in de automatisering instrument voor antilichamen titratie-experimenten. Antilichaam hoeveelheden van 1, 2, 5 en 10 ug werden getest per ChIP experiment en 2 ug IgG werd gebruikt als negatieve controle in elk experiment. Verrijkingen werden beoordeeld door qPCR. De resultaten worden weergegeven als een% van de input (de relatieve hoeveelheid immunogeprecipiteerd DNA vergeleken met ingang van DNA na qPCR analyse). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Na validatie en het bepalen optima l hoeveelheden ChIP-grade antilichamen voor gebruik in het automatiseringssysteem, geautomatiseerd ChIP-seq experimenten uitgevoerd om de sequentie profielen voor elk histon-eiwitten (Figuur 4) te genereren.

Figuur 4. Histone ChIP-seq profielen gegenereerd door geautomatiseerde ChIP-seq experimenten. De figuur toont de chip-seq profielen in verschillende genomische regio's voor H3K4me3, H3K9ac en H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 en H3K36me3. 4A toont de piek verdeling langs de volledige X -chromosome en 4B de verdeling in een 75 kb regio rond het GAPDH-gen. 4C toont de profielen van H3K27me3, H3K36me3 en H3K4me3 in een 500 kb gebied rond de MYT1 gen en 4D toont de verdeling van H3K9me3 in een 200 kb gebied rond ZNF12.large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Histon epigenetische profielen voor zes verschillende histon modificaties geassocieerd met genexpressie werden gegenereerd (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 en H3K36me3). Figuur 4A toont ChIP-seq profielen langs de X-chromosoom voor de verschillende histon markers. De zeer piek correlatie waargenomen tussen 6 verschillende histon profielen geeft de mogelijkheden van automatisch systeem om nauwkeurige en betrouwbare gegevens te genereren. Figuur 4B, 4C en 4D tonen de verdeling van pieken voor verschillende histon modificaties op specifieke genomische gebieden.

Geautomatiseerde chromatine immunoprecipitatie experimenten omlaag naar 200 cellen

De minimale hoeveelheid cellen die kunnen worden gebruikt bij ChIP experimenten afhankelijk van de kwaliteit van het chromatine, het specificity en de gevoeligheid van het antilichaam en de overvloed van de histon-eiwitten of eiwit bestudeerd. Selecteren goede ChIP-seq klasse antilichamen van belang bij het werken met beperkte hoeveelheden staal en de selectie van optimale reagentia en verschillende dragers verbetert de efficiëntie van de DNA herstel en bijdragen aan het succes van de ChIP experiment. Om de minimale hoeveelheid cellen die de geautomatiseerde ChIP protocol kunnen verwerken, verschillende hoeveelheden chromatine, antilichamen en magnetische parels werden getest in de IP-Star geautomatiseerd systeem met ChIP reagentia speciaal geoptimaliseerd om te werken met lage hoeveelheden chromatine bepalen.

Eerst chromatine van 10.000 cellen werd gesonificeerd zoals beschreven in het protocol. De chip resultaten werden bevestigd door qPCR (Figuur 5A) die aanzienlijke verrijkingen met H3K4me3 antilichaam in positieve controle regio's en verwaarloosbare signaal in negatieve controle regio's laat zien. Voor de vergelijking en het bewijs van de consistentie, additionaliteitsdebatl verkregen met H3K27ac, H3K9me3 en H3K27me3 antilichamen, met 10.000 cellen verschaft.

Geautomatiseerde ChIP experimenten werden vervolgens uitgevoerd om de capaciteit van het automatische systeem aantonen met lage hoeveelheden cellen met dezelfde H3K4me3 antilichaam. De geautomatiseerde ChIP presteerde goed aangetoond door een reeks van tien IP reacties reproduceerbare en zeer vergelijkbaar met de handmatige ChIP resultaten (Figuur 5B) waren. Handmatige en geautomatiseerde experimenten werden uitgevoerd en de voordelen van de geautomatiseerde protocollen zijn waargenomen vermindering experiment variabiliteit (figuur 5C) experimenteren.

Figuur 5. Optimalisatie van ChIP en Auto ChIP experimenten met 10.000 cellen Manual ChIP experimenten werden uitgevoerd op 10.000 cellen en met 0,25 ug H3K4me3 0,1 ug H3K27ac, 0,5 ug en 0,2 H3K9me35 ug H3K27me3 antilichamen. Identieke hoeveelheden konijnen IgG werden toegepast als controle. De qPCR werd uitgevoerd met primers voor twee loci positieve en twee negatieve loci voor elk ChIP assay. Figuur 5A toont de terugwinning, uitgedrukt als percentage van invoer (de relatieve hoeveelheid van immunologisch DNA vergeleken ingang DNA na qPCR analyse). Figuur 5B toont 10 ChIP reacties draaien op de IP-Star Compact met behulp van 0,25 ug H3K4me3 polyklonale antilichaam en 0,25 ug konijn IgG als negatieve controle antilichaam. Vervolgens werd qPCR analyse uitgevoerd met primers voor de positieve loci EIF4A2 promotor en GAPDH- TSS en de negatieve loci Myoglobine exon2 en SAT2. De figuur toont de terugwinning, uitgedrukt als percentage van invoer (relatieve hoeveelheid van immunologisch DNA vergeleken ingang DNA na qPCR analyse). Figuur 5C H3K4me3 ChIP-gegevens van 10 handmatige ChIP experimenten in vergelijking met 10 geautomatiseerde ChIP experimenten. Foutbalken vertegenwoordigen s tandaard afwijkingen van elk van de tien herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de gevoeligheid van de automatische ChIP protocollen begrijpen, werden experimenten uitgevoerd met een aantal cellen die varieerde van 100,000 tot 200 cellen per IP. De anti-H3K27me3 antilichaam werd als het een veel voorkomende histon modificatie. Het gebruik van andere histon of niet-histon antilichamen kunnen min of meer cellen vereist, afhankelijk van de overvloed van het epitoop en de kwaliteit van het antilichaam. De experimenten werden gevalideerd door kwantitatieve PCR en werd waargenomen dat door het verminderen van hoeveelheden kralen en antilichaam achtergrond in de experimenten verminderd waardoor succesvolle ChIP-qPCR resultaten met slechts 200 cellen antilichaam (figuur 6).

iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg "/>
Figuur 6. Geautomatiseerde ChIP assays op 200 cellen. HeLa-S3-cellen en antilichamen gericht tegen H3K27me3. Chromatine werd geschoren van 1.000.000 cellen en seriële verdunningen daarvan chromatine (100.000 tot 200 cellen equivalent) werden gebruikt per ChIP reactie. 1 ug H3K27me3 en 10 pl proteïne A gecoate magnetische parels werden gebruikt op 100.000 cellen experiment, 0,5 ug H3K27me3 en 10 pl kralen op 10.000 en 1.000 cellen en 0,25 ug H3K27me3 en 5 pl parels met 500 en 200 cellen. 1 ug en 0,5 ug konijnen IgG werden toegepast als negatieve controle antilichaam bij het ​​uitvoeren van experimenten met 100.000 cellen en 1000 cellen respectievelijk. 6A toont de bezetting van TSH2B en GAPDH genen in% op invoer. 6B toont relatieve bezetting van TSH2B versus negatieve controle GAPDH genomische regio.

Stroomafwaarts analyse van de chip-seq resultaten op10.000 cellen

Om de globale kwaliteit van de geautomatiseerde ChIP-seq experimenten met lage start aantallen cellen, geautomatiseerde ChIP-seq werden uitgevoerd ervan met 0,25 ug van het antilichaam op H3K4me3 10.000 HeLa-cellen en ChIP experimenten 100.000 HeLa-S3-cellen werden gebruikt als positieve controle voor het experiment. De geautomatiseerde bibliotheken werden opgesteld volgens de Microplex bibliotheek voorbereiding kitreagentia aangepast aan bereid bibliotheken met een lage DNA hoeveelheden. Merk op dat hoewel het mogelijk is om succesvol geautomatiseerde ChIP-experimenten met minder dan 10.000 cellen, zal de hoeveelheid afgebroken DNA niet voldoende om bibliotheken met de kit reagentia te bereiden. Cluster genereren en sequencing werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De bioinformatica analyses na de sequencing tonen opmerkelijke resultaten uit het lage aantal celchip monsters. De 30 pg dataset (overeenkomend met 10.000 cellen uitgangsmateriaal ) Bevatten lage achtergrondruis en betrouwbare verrijking pieken die door zowel het 300 pg dataset (overeenkomend met 100.000 cellen van uitgangsmateriaal) en de H3K4me3 dataset gegenereerd door de globale Instituut voor de ENCODE project dat als externe referentie. Het is belangrijk om de top 40 overlap verhoudingsgegevens, die verwijst naar een standaard methode in het ENCODE ¹¹ project waarin de ChIP-seq wordt beschouwd als reproduceerbaar vergelijken van twee datasets er ten minste een 80% overlap van de beste 40% merken van de pieken in volgorde van belang score. De 30 pg dataset voldoet aan deze criteria vergeleken met zowel de 300 pg dataset (gezien al zijn pieken, niet alleen de beste 40%) en de globale Instituut (tabel 1). De 300 pg dataset toont bijna identiek pieken Broad Institute data met een 98% Top 40 overlap ratio (figuur 7).

ighres.jpg "/>
Figuur 7. ChIP assays en bibliotheek generatie op 10.000 cellen ChIP-seq experimenten werden geproduceerd op 10.000 en 100.000 HeLa-S3-cellen met H3K4me3 antilichaam (0,25 ug / ul). De 35 bp labels werden toegewezen aan het menselijk genoom met de ELANDANTILOPE aligner. Tijdens de daaropvolgende piek bellen SICER betrouwbaar kan identificeren aanrijking lage cel aantallen en uit miljoenen cellen. De datasets werden geanalyseerd en vergeleken met elkaar en de referentiegegevens gegenereerd door de globale Instituut. De lage cel monsters zijn consistent en hebben een zeer hoge gelijkenis. De 30 pg monster voldoet aan de criteria ENCODE ¹¹ (min. 80% van de top 40% van de pieken moeten overlappen). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1.

Discussie

Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door sequencing is nu een standaard procedure. Hier een geautomatiseerd ChIP-seq protocol dat chromatine epigenetische profielen met slechts 10.000 cellen uitgangsmateriaal kan genereren gepresenteerd.

Automatiseren chip en voorbereiding bibliotheek assays maakt de chip optimalisatie procedure te standaardiseren en het verminderen van experimentele variabiliteit. Het vloeistofverwerkingsysteem hier gepresenteerde elimineert veel van de handmatige procedures in verband met ChIP vermindering handen op tijd slechts 30 minuten, minimaliseert verlies van monster en maakt accurate ChIP-seq met enkele picogram bibliotheekinvoer. Om succesvolle geautomatiseerde ChIP-seq experimenten bereiken, is het van cruciaal belang om hoogwaardige geschoren chromatine preparaten en ChIP-seq rang antilichamen gebruikt in elk experiment Het systeem maakt gebruik van magnetische-kraal-gebaseerde technologie biedt flexibiliteit belangrijkste experimentele parameters zoals incubatie wijzigen tijd voor het antilichaam jasing en immunoprecipitatie stappen of wijziging van de voorwaarden wassen zodat de onderzoeker om alle nodige experimenten uit te voeren voor de chip-seq optimalisatie. Het automatische systeem is een "open" platform die ook kunnen worden vergeleken meerdere reagentia parallel optimalisatie van experimentele omstandigheden voor iedere afzonderlijke cellijn en antilichamen en maakt directe vergelijking van verschillende typen en concentraties van chromatine, verschillende antilichamen en zelfs verschillende soorten magnetische kralen.

Een van de beperkingen van het automatische systeem is de noodzaak automatiseren alle protocollen volumes die variëren van 5 pl tot 200 pl. Echter, de miniaturisering van de experimenten in deze geautomatiseerde platform maakt het ook mogelijk om kosten te besparen in de reagentia.

Naast de in deze studie beschreven protocollen, het systeem is flexibel en automatiseert ook diverse andere magnetische kraal toepassingen zoals immunoprecipitatie eennd vangst van gemethyleerd DNA (MeDIP en MethylCap technologieën), immunoprecipitatie van hydroxylmethylated DNA (hMEDIP), sequentiële chromatine immunoprecipitatie (ReChIP), RNA-immunoprecipitatie (RNA-IP), bisulfiet conversie, en DNA-zuivering assays.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PBS	Life technologies	14190-094
Trypsin-EDTA	Sigma	T3924-100ML
Formaldehyde 37%	Sigma	F8775-25
1.25 M Glycine Solution	Diagenode	C01020010	Component van de ideale ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL1	Diagenode	C01020010	Component van de ideale ChIP-seq kit
Lysis Buffer iL2	Diagenode	C01020010	Component van de ideale ChIP-seq kit
Shearing Buffer iS1	Diagenode	C01020010	Component van de ideale ChIP-seq kit
Protease Inhibitors Mix (200x)	Diagenode	C01010130	Component van de Auto True Micro ChIP kit
HBSS (geen calcium, geen magnesium, geen fenol rood)	Life technologies	14175-053
Lysis Buffer tL1	Diagenode	C01010130	Component van de Auto True Micro ChIP kit
ChIP Buffer tC1	Diagenode	C01010130	Component van de Auto True Micro ChIP kit
ideale ChIP-seq kit	Diagneode	C01010051
ChIP-Buffer H	Diagenode	C01010020	Component van de Auto Histone ChIP-seq kit
Auto Histone ChIP-seq kit	Diagenode	C01010020
Auto True Micro ChIP kit	Diagenode	C01010130
H3K79me3 polyklonaal antilichaam-Classic	Diagenode	C15310068
H3K27me3 polyklonaal antilichaam-Classic	Diagenode	C15410069
H3K4me3 polyklonaal antilichaam-Classic	Diagenode	C15410030
H3K4me2 polyklonaal antilichaam-Classic	Diagenode	C15410035
H3K9ac polyklonaal antilichaam-Premium	Diagenode	C15410004
H3K9/14ac polyklonaal antilichaam-Premium	Diagenode	C15410200
H3K36me3 polyklonaal antilichaam-Premium	Diagenode	C15410058
H3K9me3 polyklonaal antilichaam-Premium	Diagenode	C15410193
Rabbit IgG	Diagenode	C15410206
Protein-A gecoate paramagnetische kralen	Diagenode	C01010020
Auto IPure	Diagenode	C03010010
MicroChIP DiaPure kolommen	Diagenode	C03040001
Universal SyberGreenMaster Mix 1.25 ml	Diagenode	DMMLD2D100
Quant-IT dsDNA	Invitrogen	Q32854
Illumina Sample Preparation kit voor genomisch DNA	Illumina	FC-121-3001
Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit	Illumina	IP-202-1012
MicroPlex Library Preparation Kit	Diagenode	C05010010
Agencourt AMPure XP kralen	Beckman Coulter	A63881
Illumina Library prep Quantification kit	Kapa Biosystems	KK4844
IP-Star Compact  Geautomatiseerd systeem	Diagenode	B03000002
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001
Bioruptor Pico	Diagenode	B01060001
Qubit systeem	Invitrogen	Q32857
Illumina Hiseq systemen	Illumina