Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van Wnt5a Oorzaken Cysten in zebravis Nieren

10.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52156

⸱

2 december 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Eastern Virginia Medical School, 2Department of Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Pediatrics, University of Michigan

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een methode om een mogelijk zebravismodel van polycystische nierziekte te genereren. We gebruikten Tg(wt1b:GFP) vissen om de nierstructuur te visualiseren. Knockdown van wnt5a gebeurde door middel van een morpholino-injectie. Pronefrische cystevorming na wnt5a knockdown werd waargenomen in deze GFP-transgene zebravis.

Samenvatting

Polycystische nierziekte (PKD) is een van de meest voorkomende oorzaken van eindstadium nierziekte, een verwoestende ziekte waarvoor er geen geneesmiddel is. De moleculaire mechanismen die leiden tot cystevorming in PKD blijven enigszins onduidelijk, maar er worden veel genen verondersteld te zijn betrokken. Wnt5a is een non-canoniek glycoproteïne dat een breed scala aan ontwikkelingsprocessen reguleert. Wnt5a werkt via de planaire celpolariteit (PCP) route die georiënteerde celdeling reguleert tijdens verlenging van renale tubulaire cellen. Defecten van de PCP-route zijn gevonden als oorzaak van cystevorming in de nier. Ons artikel beschrijft een methode voor het ontwikkelen van een zebravis model voor cystische nierziekte door knockdown van het wnt5a gen met wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotiden. Tg(wt1b:GFP) transgene zebravissen werden gebruikt om de nierstructuur en niercysten te visualiseren na wnt5a knockdown. Twee verschillende antisense MO's (AUG - en splice-site) werden gebruikt en beide resulteerden in een gekrulde staart naar beneden fenotype en cystevorming na wnt5a knockdown. Injectie van muis Wnt5a mRNA, resistent tegen de MO's vanwege een verschil in primaire basenpaar structuur, redde het abnormale fenotype, wat aantoont dat het fenotype niet te wijten was aan “off-target” effecten van de morpholino. Dit werk ondersteunt de geldigheid van het gebruik van een zebravis model om wnt5a functie in de nier te bestuderen.

Inleiding

Zebravis (Danio rerio) embryo's zijn op grote schaal gebruikt als een model voor het bestuderen van de ontwikkeling van de nieren en polycysteuze nierziekte. Er zijn vele voordelen aan het gebruik zebravis als diermodel: de haalbaarheid van het bestuderen van genetische interacties, het vermogen om antisense morfolino (MO) gebruikt voor proteïne knockdown, de mogelijkheid om snel assay grote aantallen embryo's, en het kijkgemak orgaan fenotypes levende larven 1. De pronephros is de eerste nier te ontwikkelen in vertebraten en functioneel is in larvale zebravis 2. De structuur van de zebravis pronephros relatief eenvoudig in vergelijking met de zoogdier metanefros, de derde en laatste nier ontwikkelen bij zoogdieren. De nefron is de werkeenheid van de nier, waarbij elke humane nier die tussen 500,000-1,000,000 nefronen 3,4 en elke muis nier met ongeveer 13.000 nefronen 5, waardoor het moeilijk om één nefron structuur waarnemen in mens of muis nieren. De zebravis heeft slechts twee nefronen, en elke zebravis nefron bevat alle belangrijke componenten in de glomerulus en buisjes van muizen en mensen 6 en soortgelijke gespecialiseerde renale celtypen. Vergeleken met andere gewervelde modellen zoals Xenopus, zebravis het nefron meer lijkt het zoogdier nefron omdat het een gesloten systeem 7.

De laatste jaren heeft de zebravis genoom sequentie is bepaald, waardoor de brede invoering van genetische hulpmiddelen, uitgebreide mutant middelen en verzamelingen van transgene reporter lijnen zebravismodellen. De zebravis pronephros vormt tussen 12-72 uur na bevruchting (HPF) en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in de transparante embryo. De Wilm's tumor WT1 eiwit is een essentiële factor voor de ontwikkeling van de nieren. Transgene zebravis lijnen expressie groen fluorescent proteïne (GFP) onder de controle van de promoter wt1b Tg (wt1b: GFP) tonen GFP Expression specifiek gelegen in pronephric regio's in de zebravis embryo's, vanaf 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), een autosomaal recessieve cystische nierziekte, veroorzaakt door mutaties van genen NPHP 9. NPHP4 knockdown door morfolinogroep veroorzaakt vorming van cysten in de Tg (wt1b: GFP). Vis 10 Daarom is deze transgene vis is een geschikt model voor het observeren van de nieren structuren en cyste vorming tijdens de ontwikkeling nier. Belangrijk is, kan de invloed van modulatoren van nierontwikkeling bestudeerd door deze stam in tijd en arbeid efficiënte wijze.

Onze paper beschrijft het gebruik van Tg (wt1b: GFP) vis als een model om de nieren cyste vorming visualiseren na genmodulatie. We gebruikten start- en splice-terrein anti-sense MO's af te breken de Wnt5a gen in de zebravis. Wnt5a is een niet-canonieke uitgescheiden glycoproteïne van de familie Wnt die een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van verschillende organen en postnatale cellulairefunctie 11. Wnt5a werkt door Wnt banen, waaronder de vlakke cel polariteit (PCP) route, die is gevonden om een ​​rol georiënteerde celdeling spelen tijdens renale tubulaire rek. Wnt5a regelt de Wnt / PCP reactieweg door een complex te vormen met de receptor, zoals tyrosine kinase (Ryk), die verder overbrengt Wnt5a signalering door vorming van een complex met de VANGL vlakke cel polariteit eiwit 2 (Vangl2), waardoor Vangl2 stabiliteit 12 bevorderen. Defecten in het PCP traject kan resulteren in willekeurige celdeling en veroorzaken niercyste formatie. We gebruikten de Tg (wt1b: GFP) zebravis lijn naar de nieren cyste vorming observeren volgende Wnt5a knockdown. De Tg (wt1b: GFP) zebravis model maakt live beeldvorming en tijdige waarneming van nier structuur. Na Wnt5a knock-down, werd niercyste formatie gevonden beginnend bij 24 hpf; 72 HPF cysten kan worden gevonden in de glomeruli en de proximale tubuli. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om screen andere genen die de nieren cyste vorming kunnen veroorzaken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Alle zebravis experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Eastern Virginia Medical School.

1. Morfolino Voorbereiding

  1. Ontwerp en synthetiseren translatie-blokkering (, bijgedragen) en splice-remmende (Splice-) antisense morfolino (MO) oligonucleotiden voor het gen van belang volgens instructies van de fabrikant (Figuur 1A). Zie informatie van de fabrikant in tabel 1.
    OPMERKING: MO's worden geleverd als gevriesdroogde aandelen in glazen flessen.
  2. Voeg hoogwaardige steriel water om de glazen flessen te resuspenderen MO tot een eindconcentratie van 25 ug / ul. Zorg ervoor dat de oligonucleotide volledig is opgelost. Als sommige solide overblijfselen, verwarm de flacon met de voorraad oligonucleotide oplossing bij 65 ° C gedurende 5 tot 10 min en vortex kort.
  3. Bewaar de MO voorraad oplossing bij RT. Bewaar ze niet bij 4 ° C of -20 °; C omdat lagere temperaturen kunnen leiden MO oligonucleotide bindt aan de houderwand. Meet de concentratie van de stockoplossing met behulp van een spectrofotometer (zie tabel 1) elke keer een nieuwe MO-stamoplossing wordt bereid.
  4. Bereid de MO werkoplossing op de dag van de injectie door verdunning van de voorraadoplossing met hoogwaardige steriel water om de gewenste dosis. Voeg 0,5% fenolrood tot een concentratie van 0,05% te bereiken. Om bijvoorbeeld 5 ui werkoplossing met een concentratie van 15 ng / nL, voegt 3 ul MO voorraadoplossing en 0,5 pi 0,5% fenolrood 1,5 ui water.
    OPMERKING: Met deze werkconcentratie, elke druppel (500 pl) van injectie bevat 7,5 ng MO en twee druppels bevatten 15 ng MO.

2. Bereiding van de injectie-inrichting

  1. Aankoop glas pre-getrokken naalden (zie tabel 1 voor nadere informatie). Als alternatief, trek de glazen injectienaald with een naald trekker.
  2. Schakel de luchtcompressor en stel de druk instellen op 50 psi. Zet de dissectiemicroscoop lichtbron en Pico micro-injectie pomp en de instellingen als volgt aan te passen: houd de druk 20 psi, uitwerpen druk 10 psi, periode waarde van 2,5 en 100 usee scala van gating.
  3. Laad het glas vooraf getrokken naald met 5 pl van de injectie-oplossing en plaats de naald in een verticale positie met de punt naar beneden gericht. Wacht tot alle de oplossing van de naald, zonder zichtbare luchtbellen bereikt. Plaats de naald houder in een geschikte positie naast de microscoop en steek de glazen naald in de houder. Pas de injectiehoek tot 45 graden.
  4. Breng de naald in beeld onder de microscoop, hoog boven het podium, en zich richten op het dunste deel van de tip. Breek de naaldtip met fijne punt pincet.
  5. Plaats een liniaal en een capillaire buis met inwendige diameter van 0,15 mm naast elkaar onder de microscoop;de injectie in een uiteinde van de capillaire buis een vloeistofkolom maken. Pas de eject tijd om elke 17 druppels per 1 mm lengte van de kolom vloeistof te bereiken, dan is het volume van elke druppel is 1 nl (druppel volume = π x straal van 2 x lengte (van vloeistof kolom) / count (druppels).
    OPMERKING: Een druppel met een diameter van 0,1 mm geeft een injectievolume van 500 pl (druppelvolume = 4/3 x π x straal 3).

3. Voorbereiding van bevruchte zebravis embryo's en Injectie met Morpholinos

  1. Het opzetten van Tg (wt1b: GFP) transgene zebravis broedparen volgens gepubliceerde protocollen voor standaard zebravis veeteelt en onderhoud. Verzamel embryo's na natuurlijke paaien, en bewaar ze in een 10 cm petrischaal gevuld met E3 water (5 mM NaCl, 0.17mm KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4). Start MO injectie meteen 13. Monitor embryomorfologie onder de microscoop en zorg ervoor MO injectie is op de een-cel stadium, of uiterlijk op de vier-cel stadium.
    1. Breng de embryo's een 10 cm petrischaal met wigvormige agar troggen. Zuig het extra E3 water en druk de embryo's in de troggen.
    2. Manipuleren van de embryo's met de micropipet 1-cellig stadium embryo zichtbaar onder de stereomicroscoop. Doordringen in de chorion en de dooier één of twee druppels MO injecteren in de dooier (1 druppel = 500 pl). Breng de geïnjecteerde embryo's een 10 cm petrischaal met E3 water en incubeer bij 28.5 ° C.
  2. Na de injecties, verwijder de dode embryo's en noteer het aantal geïnjecteerde embryo's. Vervang het E3 water in de schaal elke 24 tot 48 uur.

4. Fenotype Rescue Experimenten

  1. Selecteer een ortholoog van een andere soort die een verschillende primaire basenparen structuur (meestal 3-7 basepaar mismatches) heeft en derhalve bestand tegen de MO voor redding. Bijvoorbeeld, in dit experiment kozen wemuis omdat de muis Wnt5a mRNA sequentie verschilt van de sequentie zebravis.
  2. Ontwerp een primerset met de voorwaartse primer vanaf het translationele plaats en de reverse primer op bijna het einde van het mRNA coderend gebied. Voeg een T7 promoter sequentie aan het 5'-uiteinde van de voorwaartse primer sequentie. In dit experiment gebruikten we de volgende primer sequenties; vooruit: 5'-taa tac gac tca cta tag GGA cta tga TGC TGC tga agc tga a- 3 'en achteruit: 5'-tca CTT gca gac gta CTG gtc- 3'.
  3. Voer een 50 pl Polymerase Chain Reaction (PCR) met het primerpaar (0,5 uM van elke primer) hierboven ontworpen en 0,1 ug template DNA dat het muizen Wnt5a cDNA-sequentie met de volgende PCR-programma: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 5 min; 35 cycli van 95 ° C (30 sec) 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); en laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 7 min.
  4. Na het afronden van tHij cyclus, lopen 2 pl van het PCR-product op 1% agarosegel om ervoor te zorgen dat de band is de juiste maat. Zuiver het PCR product met een PCR zuivering kit volgens instructies van de fabrikant. Controleer DNA-concentratie met een spectrofotometer. Bewaar het gezuiverde PCR-product bij -20 ° C of direct gebruiken afgetopte RNA transcriptie in de volgende stap.
  5. In vitro te synthetiseren afgedekt mRNA met een afgetopte RNA synthese kit volgens de instructies van de fabrikant. Verdun het mRNA in 20 ul RNase vrij water en het bepalen van de concentratie. Aliquot de RNA en bewaar bij -80 ° C.
  6. Op de dag van injectie, bereid een werkoplossing van het mRNA door RNase vrij steriel water. Merk op dat 40 pg is gewoonlijk de hoogste RNA dosis waarbij niet-specifieke of toxische effecten van het RNA niet optreden. Houd de werkende oplossing op ijs. Injecteer de embryo met MO en vervolgens de redding mRNA, of co-injecteren beide samen. Als bijvoorbeeld de concentratie van het mRNA VOORBEREIDINGed in stap 4.5 0.6 ug / ul, voeg 0,67 pl mRNA (0,4 ug) 4,33 gl RNase vrij water tot een eindconcentratie van 0,08 ug / ul maken dan één druppel (500 pl) van elke injectie bevat 40 pg van mRNA. MO Bereid zoals beschreven in stap 3.

5. Voorbereiding van de geïnjecteerde embryo's voor TL-Imaging

  1. Na incubatie bij 28.5 ° CO / N, voeg 0.003% N-fenylthioureum (PTU) het E3 water melanisatie, die observatie van pronephros structuur middels fluorescentiemicroscopie beïnvloedt voorkomen. Echter niet PTU toevoegen voordat gastrulatie, omdat het van invloed vroege embryonale ontwikkeling.
  2. Op 48 HPF, handmatig dechorionate de embryo's met fijne pincet. Neem foto's van 48 en 72 HPF embryo's onder een lichte dissectie microscoop.
    LET OP: Deze foto's kunnen worden genomen zonder verdoving.
  3. Ongeveer 10 min voor beeldvorming onder de fluorescentiemicroscoop, verdoven de embryo door ze in10 cm petrischaal die 160 ug / ml gebufferd tricaïne. Wacht 5-10 minuten, en dan licht raken de zebravis te bevestigen dat ze niet kunnen bewegen en dus de verdoving werkt.
  4. Nadat de embryo's worden verdoofd, monteer ze in 3% methylcellulose en oriënteren ze in een buikligging onder een stereomicroscoop (zie tabel 1).
  5. Let op de pronephros structuur onder een fluorescentie microscoop (zie tabel 1) en foto's op verschillende vergrotingen (10X en 20X) nemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Wnt5a knock down werd bereikt door de invoering vertaling blokkeren MO (augustus-MO) of exon / intron grens splice MO (splice-MO) bij de zebravis embryo's in de ene cel podium. De augustus-MO richt het startcodon en derhalve remt zowel moeder en zygote Wnt5a boodschap. De splice-MO richt de derde splitsingdonorplaats en remt alleen de zygote transcript van Wnt5a (figuur 1A). De, bijgedragen en splice- morphants phenocopied elkaar met meerdere gebreken, waaronder krullende staart na...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Polycystische nierziekte (PKD) is een van de belangrijkste oorzaken van eindstadium nierziekte bij de mens en wordt gekenmerkt door progressieve cyste vorming, nier- uitbreiding, en abnormale tubulus ontwikkeling 14. Autosomaal dominant PKD (ADPKD) is een genetische ziekte waarbij mutatie van hetzij PKD1, codeert polycystine-1 (PC1) of PKD2, codeert polycystine-2 (PC2), resultaten in polycysteuze nieren. Vele andere genen, vooral die coderen voor eiwitten in de primaire cilium, wordt gedacht betrokken te zijn...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de NIH (DK093625 aan LH en DK069909 en DK047757 naar JHL) en de VA (Merit Award I01BX000820 aan JHL). We willen graag Dr Michael Pack en Dr. Jie Hij dankt aan de Universiteit van Pennsylvania zebravis Core voor het verstrekken van essentiële ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5% Fenol-RedSigmaP0290Kleurindicator voor injectie
MorpholinoGenn Tools, LLC(aangepast)Aangepast ontworpen voor het gen van belang
Voorgetrokken naaldTritech ResearchMINJ-PPAls een grote hoeveelheid naalden vereist is, kunt u ook een naaldtrekker kopen en de naald in het lab bereiden
T7 mMessage KitAmbion1344Voor in vitro transcriptie om bekapt mRNA te maken voor reddingsexperiment
N-FenyltiyoureumSigmaP7629Voor preventie van melanisering
TricaineSigmaA5040Ook wel ethyl 3-aminobenzoaat genoemd, voor narcose bij zebravissen
MethylcelluloseSigmaM-0387Voor positie van zebravis
QIAquick PCR-zuiveringskitQiagen28104Voor zuivering van PCR-product voor cap RNA-synthese.
dNTP-mixPromegaU1511Voor PCR
Tag DNA PolymeraseInvitrogen10342-053Voor PCR
NanoDrop spectrofotometerThermo ScientificND-1000Voor het meten van morpholino- en RNA-concentratie
LuchtcompressorWerther International, Inc.Panther Compact 106Luchtbron voor injectie
Pico micro-injectiepompWorld Precision Instruments IncPV830 Pneumatische PicoPumpAndere soorten micro-injectiesystemen kunnen worden gebruikt.
Micro-manipulatorWorld Precision Instruments IncMMJRRechterhand (MMJL voor linkshandigen)
NaaldhouderWorld Precision Instruments Inc5430-ALLOm de naald vast te houden voor micromanipulatie
Dumont-pincetFine Surgical Tools11253-20Om de naaldtip af te breken
DissectiemicroscoopLeica M205CVoor het observeren en beelden van zebravis-embryo's
FluorescentiemicroscoopZeiss Axio Observer D1mVoor beeldvorming van zebravis-pronephros
Capillaire buis (ID 0,15 mm)VitroComCV1525Q-100Voor het meten van het volume van elke geïnjecteerde druppel

Referenties

  1. Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
  2. Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
  4. Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
  5. Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
  6. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
  7. Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
  8. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  9. Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
  10. Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
  11. Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
  12. Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Wnt5a knockdownmorfofolijninjectieTg wt1b GFP transgeenfluorescentiemicroscopierescue experimentmuis Wnt5a mRNAcystevormingnierstructuur
Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van Wnt5a Oorzaken Cysten in zebravis Nieren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.