Methodenartikel

Afleiden en karakterisatie van een Transgene gratis humane geïnduceerde pluripotente Stem Cell Line en de omschakeling naar Defined Klinisch-grade Voorwaarden

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52158

⸱

26 november 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het afleiden van op lentivirus gebaseerde, gereprogrammeerde en gekarakteriseerde factorvrije humane geïnduceerde pluripotente stamcellen en de omzetting hiervan in vermeende klinische-kwaliteitscondities.

Samenvatting

Humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) kan worden gegenereerd met lentivirale gebaseerd herprogrammering methodieken. Echter, sporen van potentieel oncogene genen resterende actief getranscribeerde gebieden van het genoom, beperken hun potentieel voor toepassing in humane therapeutische toepassingen 1. Bovendien, niet-menselijke antigenen afgeleid van stamcellen herprogrammering of differentiatie in therapeutisch relevante derivaten belet deze hiPSCs wordt gebruikt in een klinische context 2. In deze video, presenteren we een procedure voor het herprogrammeren en analyseren-factor vrij hiPSCs vrij van exogene transgenen. Deze hiPSCs kunnen vervolgens worden geanalyseerd op genexpressie afwijkingen in de specifieke intron bevat het lentivirus. Deze analyse kan worden uitgevoerd met gevoelige kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR), die voordeel minder gevoelige technieken vroeger gebruikt om genexpressie 3 verschillen te detecteren is. Volledige omzetting inklinisch-grade goede fabricagemethoden (GMP) voorwaarden, laat de menselijke klinische relevantie. Ons protocol biedt een andere methode op voorwaarde dat de huidige veilige haven criteria zullen uitbreiden en onder-factor vrij gekarakteriseerde iPSC-gebaseerde derivaten voor menselijke therapeutische toepassingen-voor het afleiden van GMP-grade hiPSCs, die elke immunogeniciteit risico moet elimineren als gevolg van niet-menselijke antigenen. Dit protocol is breed toepasbaar lentivirale geherprogrammeerd cellen van elk type en verschaft een reproduceerbare werkwijze voor het omzetten geherprogrammeerd cellen in GMP-grade omstandigheden.

Inleiding

Volwassen menselijke cellen zijn aangetoond in staat te zijn epigenetische hermodellering en herprogrammering te ondergaan, als resultaat van lentivirale expressie van vier belangrijke transcriptiefactoren4,5. Een belangrijke vooruitgang in het herprogrammeringsveld was het gebruik van een enkele verwijderbare lentivirale stamcelcassette (STEMCCA), die alle vier de herprogrammeringstranscriptiefactoren bevatte die een precieze stoichiometrische verhouding van eiwitexpressie mogelijk maakten6. Bovendien kan STEMCCA, wanneer getransduceerd in specifieke besmettingsmultiplicitieiten, leiden tot overwegend enkele genomische integratie-gebeurtenissen tijdens het herprogrammeringsproces7. De introductie van een verwijderbare versie van STEMCCA, die gebruik maakt van Cre/loxP technologie gevolgd door excisie van het herprogrammeringsvector na afstamming van de stamcellijn, maakte het mogelijk om factor-vrije humane geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) lijnen te ontwikkelen8. Bovendien, om therapeutische toepassingen van hiPSC's te verbeteren, was er een nieuwe, snelle en direct toepasbare methodologie nodig voor goede fabricagepraktijken (GMP)-kwaliteit cellijnconversie, van xeno-bevattende naar xeno-vrije condities. Hier bespreken we een relevante methodologie die geïntegreerde genexpressieve verschillen nauwkeuriger beoordeelt, specifiek wanneer geïntegreerd in een intron, en celconversie van klinisch niveau naar veronderstelde GMP-condities.

Eerder onderzoek heeft alleen relatief ongevoelige microarray transcriptieanalyse gebruikt om genexpressieve verschillen in geïntegreerde genen na STEMCCA transductie te analyseren3,9. Hier introduceren we de methodologie van gevoelige kwantitatieve polymerase kettingreactie (PCR) analyse, om verder geïntegreerde genexpressieve verschillen te onderzoeken. Belangrijk is dat huidige veilige-haven criteria hiPSC's verwerpen die genen hebben met virale integraties, waardoor de toepasbaarheid van deze cellen voor downstream humane cellulaire therapieën wordt beperkt9. We stellen voor dat de status quo kan veranderen met het gebruik van volledig gekarakteriseerde en transgen-vrije intronic geherprogrammeerde hiPSC's. Bovendien introduceren we een robuust GMP-kwaliteit celconversieprotocol dat direct kan worden toegepast op een verscheidenheid aan verschillende celtypen, die oorspronkelijk zijn ontwikkeld onder xeno-bevattende condities10. Dit biedt aanzienlijke mogelijkheden voor de ontwikkeling van toekomstige celherprogrammeringsexperimenten, die klinisch niveau condities vereisen om humane therapeutische relevantie te behouden.

Deze methodologieën vormen een basis waarop huidige veilige-haven criteria kunnen worden uitgebreid om gekarakteriseerde STEMCCA geherprogrammeerde hiPSC lijnen te omvatten die een normaal genexpressieprofiel behouden na STEMCCA excisie uit de geïntegreerde intron. Ook zal volledige conversie naar klinische kwaliteit condities, vrij van niet-menselijke dierlijke antigenen, helpen om veel meer celtypen te kunnen incorporeren, die eerder alleen onder xeno-bevattende condities zijn geherprogrammeerd en gekarakteriseerd. Deze methodologieën gecombineerd, zijn overtuigende gronden voor de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) om te overwegen hun beperkte goedkeuring uit te breiden van op humane embryonale stamcel (ESC) gebaseerde therapieën naar hiPSC-gebaseerde therapieën11.

We hebben onlangs de afleiding van een factor-vrije hiPSC lijn gedetailleerd die volledig is gekarakteriseerd en omgezet in veronderstelde klinische kwaliteit condities10. Hier beschrijven we het protocol voor hiPSC afleiding door gebruik van de STEMCCA lentivirus. Deze stamcellen ondergaan vervolgens een excisieproces gevolgd door genexpressie karakterisering. Ten slotte worden de hiPSC's omgezet naar GMP-kwaliteit condities door een langzame conversiemethode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Deze methode werd gebruikt in het onderzoek gerapporteerd in Awe et al. 10.

1. herprogrammeren volwassen menselijke dermale fibroblasten met STEMCCA

  1. Ontdooi volwassen dermale humane fibroblasten (HUFs), doorgang 4 of lager, in een 37 ° C waterbad gedurende 2 min, verzorgen de bovenkant van de flacon met water te dompelen.
  2. Plaats de 1 ml suspensie van humane fibroblasten in een 15 ml conische flacon en langzaam 4 ml standaard HUF media, voorverwarmd tot 37 ° C, in een druppelsgewijze manier, verdund uit dimethylsulfoxide (DMSO) en opnieuw te schorten cellen.
  3. Centrifugeer het buisje bij 200 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant en resuspendeer cellen in een voldoende hoeveelheid media aan een suspensie van 100.000 cellen / ml te maken en voeg vervolgens 2 ml in een putje van zes-well plaat, pre-coating gedurende 20 min met 0,2% gelatine.
    OPMERKING: Een zuster goed met een gelijk aantal cellen per lijn en conditie moet worden gezaaid for de cel tellen / multipliciteit van infectie (MOI) berekening.
  4. Rock de plaat van links naar rechts en weer terug en weer naar de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
  5. Op de dag van transductie, verkrijgen celgetal (s) van de zus goed (s) ongeveer 24 uur na de eerste HUF plating.
  6. Ontdooien 2 x 10 8 TU, of gelijkwaardig, lentivirale concentraat (STEMCCA) en vul aan tot 1 x 10 8 TU / ml in HUF media.
  7. Transduceren cellen bij 10 MOI verhouding HUF medium aangevuld met 8 ug / ml transfectie agens. Meng getransduceerde putjes gelijkmatig en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde incubator.
  8. Ongeveer 24 uur na lentivirale transductie, schakelt de HUF media om standaard menselijke pluripotente stamcellen (PSC) medium.
  9. Op dag 2 tot en met 6, veranderen media dagelijks met menselijke PSC medium.
  10. Op dag 6, plaat twee 0,2% gelatine beklede 10-cm platen van1,5-1,75 x 10 6 MEFs ontleend CF1 muizen HUF media 12.
  11. Op dag 7, dat evenwel niet tot meer dan 100 xg, gebruik kamertemperatuur trypsine centrifuge op te heffen van de dag 7 geherprogrammeerd fibroblasten van de ene put van de zes-well plaat en doorgang aan een 01:16 verhouding, door platen alle cellen gelijkmatig tussen twee platen van 10 cm, met verse menselijke PSC media, die zijn bedekt met MEF de dag ervoor. Verdeel celaggregaten in wijzerzin spiraalvormige beweging en plaats in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator 's nachts.
  12. Ongeveer 48 uur na het zaaien de geherprogrammeerd cellen op MEF en elke dag daarna, uit verandering bracht menselijk PSC media met verse media.
  13. Na 3 tot 4 weken, pick individuele kolonies met typische ESC morfologie met een 21-gauge naald en subkloneren uit in een 24-well plaat door het plaatsen van ongeveer 8 tot 10 individuele stukken van specifieke koloniën in afzonderlijke putjes in een 0,2% gelatine beklede 24-wells plaat pre-seeded met MEF ontleend CF1 muizen menselijke PSC medium.
    OPMERKING: Na expansie van geplukt kolonies, de kolonies moeten worden gekarakteriseerd als pluripotente bij embryoiden-vorming en expressie analyse van pluripotentie markers op eiwitniveau.

2. Vector Integratie Site Analyse en STEMCCA Excisie

  1. Analyseer de STEMCCA intergratieplaats door niet-restrictieve lineaire amplificatie PCR zoals beschreven 10.
  2. Na het testen van een integratie te waarborgen in een gewenst gebied van het genoom, accijnzen STEMCCA door opzuigen uit de oude menselijke ESC medium. Vervolgens combineer 45 pi geconcentreerd Adeno-Cre-PuroR virus met 8 ug / ml transfectie agens in 3 ml standaard PSC media gedurende 24 uur.
  3. Nadat de 24-uur incubatietijd, zuigen uit de gemengde virale supernatant en was de cellen tweemaal met menselijke PSC media. Plaats verse humane PSC medium met 2 ug / ml puromycine gedurende 5 dagen, veranderen de media dagelijks with verse media en antibioticum.
  4. Na 5 dagen subkloon overblijvende kolonies met een 21-gauge naald op 0,2% gelatine beklede putjes in een 12-well platen vooraf bekleed met MEFs ontleend CF1mice en vergroten zoals hierboven beschreven.
    OPMERKING: Na voldoende uitbreiding naar een bevroren voorraad te verkrijgen, wordt de omzetting in-feeder-vrije omstandigheden vereist. Verwacht ten minste 95% stamcellen kolonie dood meeste cellen niet met succes wordt getransduceerd en bezwijkt antibiotica gedurende de periode van 5 dagen incubatie. Hoewel adeno-Cre-PuroR integreert op een ,001-1% rendement in gastheerchromosomen van geïnfecteerde cellen, reexposing een steekproef van-factor vrije kolonies te puromycine om ervoor te zorgen 100% celdood zal bevestigen geen integratie heeft plaatsgevonden 13.
  5. Ontdooien één flacon vooraf in porties basaalmembraan matrix op ijs, gedurende een periode van ongeveer 2 uur (aanbevelingen van de fabrikant) tot de matrix is ​​een vloeistof en verdunnen naar een uiteindelijke concentratie van 1:30 in koude basale media. Coop gewenste aantal putten in een zes-well plaat met 1 ml per putje. Laat op kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  6. Cross-hatch (met behulp van een 18-gauge naald, of een glas of plastic "tip") ten minste 20 tot 30 kolonies van een goed voorheen bekleed met MEF. Wees voorzichtig om te verminderen MEF opbeurend en overbrengen van de plaat.
    1. Genereer de arcering inrichting via een aantal verschillende benaderingen van de meer gecompliceerde verwarming, trekken en het polijsten van een glazen Pasteur pipet op een open vlam, het eenvoudige gebruik van een steriele plastic pipet tip of, zoals in ons geval, 21- en / of 18-gauge naalden.
  7. Zuig de matrix van de beklede put na incubatie.
  8. Verwijder stukken van de kolonies door voorzichtig schrapen van de oude plaat met een 200 ul pipet en zorgvuldig geplaatst in 3 ml vers gecombineerde medium 1 in de matrix beklede plaat. Incubeer overnacht op 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. Verandering media 48 uur na passage.
  9. Uittreksel genomisch DNA uit post-uitgesneden en voedingsvrije omgezette hiPSCs op meer dan 80% confluentie met commerciële DNA-extractie kits.
  10. Analyseren voor een goede excisie met primers specifiek voor exogene integraties van de STEMCCA lentivirus: gDNA-Hendo-MycS-forward, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; gDNA-hWPRE-reverse, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 '. Reconstrueren gevriesdroogde primers met PCR-grade water om een ​​10-uM stockoplossing.
  11. Voer een PCR met de volgende vijf stappen protocol: initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 3 min; 35 cycli van elk van de volgende: denaturatie bij 98 ° C gedurende 20 seconden, primer annealing bij 62 ° C gedurende 15 sec en verlenging bij 72 ° C gedurende 15 seconden; gevolgd door één cyclus laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 3 min.
  12. Voeg een 3% agarosegel door weging uit 1,5 g agarose en te plaatsen in 50 ml 1x Tris-acetaat-EDTA-buffer. Magnetron totdat agarose is opgelost en plaats in het DNA gel vlek op ptouwslager verdunning, mengen, en afzien juiste volume in gelcassette te stollen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  13. Belasting 12 pi PCR product gemengd met 3 pl geladen kleurstof in een 3% agarose gel. Laat de gel gedurende 30 minuten bij 80 V.
  14. Visualiseren met ultraviolet licht voor het ontbreken van een band aangeeft juiste excisie.

3. Kwantificering van Gene Expression Verschillen met behulp van kwantitatieve PCR uit pre- en post-weggesneden hiPSCs

  1. Uittreksel totaal RNA van post-uitgesneden en voedingsvrije geconverteerde hiPSCs met behulp van commerciële RNA-extractie kits.
  2. Omgekeerde transcriptie tot 1 ug totaal RNA met gebruik van commerciële kits volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik verankerd-oligo (dT) 18 en random hexameer primers.
    OPMERKING: Zorg dat de PCR-protocol is op maat gemaakt voor gentranscripten van meer dan of minder dan 4 kb. Specifieke primers moeten worden gemaakt welke genen STEMCCA oorspronkelijk geïntegreerd into.
  3. Reconstrueren de gevriesdroogde primer met PCR-grade water om een ​​20 uM stockoplossing.
  4. Gebruik 5 ng monster per 20 pi reactie die bestaat uit 10 uM UPL sonde, 2x LightCycler 480 Probes Meester, en 20 uM forward en reverse primers.

4. Omzetting in GMP-grade Voorwaarden

  1. Op de eerste dag van de overgang van de post-weggesneden hiPSCs over aan GMP-grade omstandigheden, maken een mix van media, bestaande uit de menselijke PSC gecombineerd media 1 (gecombineerd media 1) en de klinische kwaliteit goede fabricagemethoden (GMP) compatibele media (gecombineerde media 2 ) in een 80:20 verhouding.
  2. Zuig de oude gecombineerde media 1 en plaats 3 ml van de nieuwe gecombineerde media 1 en 2, voorverwarmd op de 80:20 verhouding. Verander media dagelijks gedurende 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  3. Op dag 4, maken de gecombineerde media 1 en 2 met een 50:50 verhouding. Zuig de oude medium en replace met voorverwarmde media, de gecombineerde media 1 en 2 aan de 50:50 verhouding. Verander media voor 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  4. Op dag 7, maken de gecombineerde media 1 en 2 met een 20:80 verhouding. Zuig de oude medium en vervang voorverwarmde media, met de gecombineerde media 1 en 2 aan de 20:80 verhouding. Verander media voor 3 dagen met dit specifieke verhouding. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  5. Op dag 10, maakt de gecombineerde media 1 en 2 met een 0 100 ratio. Zuig de oude medium en vervang voorverwarmde media, met de gecombineerde media 1 en 2 bij de 0: 100 verhouding. Wijzig de media elke dag op deze specifieke verhouding. De cellen zijn nu in totaal toegezegde xeno vrije media. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
    OPMERKING: Tijdens dit hele conversie proces, wordt routinematige passage met een 18-gauge naald nodig om een ​​goede kolonie grootte en dichtheid te behouden. Plan op het passaging cellen elke 4 tot 5 dagen op basis van koloniegrootte, confluentie en differentiatie.
  6. Jas een goed in een zes-well plaat met een gedefinieerde-xeno gratis substraat, zoals aanbevolen door de fabrikant.
  7. Mechanisch passage een samenvloeiing goed, al omgezet naar xeno-vrije media voorwaarden, van een zes-well plaat met een 18-gauge naald. Belangrijker is, plaatst u de nieuwe media (gecombineerd media 2) op de cellen met 1x ROCK-remmer gedurende 1 uur, vóór passage van een pre-conditie de media.
  8. Zuig het synthetische substraat oplossing van de nieuwe plaat die de cellen worden overgebracht naar. Verwijder alle media die de stamcellen klonten uit de oude plaat en over te dragen aan nieuwe plaat.
  9. Plaats cellen terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 2 dagen met minimale fysieke verstoringen (idealiter platen eenmaal binnen incubator, niet rechtstreeks geraakt aan uit) om maximale hechting mogelijk.
    OPMERKING: Cellen zal dagelijks media veranderingen vereisen. Voortdurende passaging om de 4 dagen zal belangrijk zijn. Met behulp van een 21-gauge naald, passage alleen de delen van de kolonies met een optimale ESC-achtige morfologie (hoog nucleocytoplasmatische ratio). Dit zorgt voor een juiste keuze iPSC kolonies die goed groeien en uiteindelijk verkregen homogene kolonies. Totale tijd om afleiding van ESC-achtige kolonies is tussen de 15-20 dagen na de eerste gecombineerde media verandering.
  10. Bevriezen door het GMP-grade achteraf weggesneden hiPSCs door eerste cross-hatch alle kolonies met behulp van een 18-gauge naald. Til alle stukken af ​​met 200 ul pipet geheel overgaat medium dat de cellen een 15 ml conische flacon en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  11. Terwijl de cellen centrifugeren, maak een koude medium bestaat uit gelijke volumina koude gecombineerde media 2 en invriesmedium met een uiteindelijke DMSO-concentratie van 7,5%.
  12. Na cellen worden afgedraaid, zuigen uit oude medium en drop-wijs opnieuw op te schorten de pellet met de bevriezing media. Onmiddellijk transfer te bevriezen flesjes en in een -80 ° C vriezer.

5. Kenmerkend GMP-grade Post-weggesneden hiPSCs

  1. Voor juiste expressie van de pluripotentie markers na de conversie te waarborgen, gebruik QPCR expressie van belangrijke pluripotentie markers (SOX2, OCT4 en NANOG) met de in tabel 1 vermeld met dezelfde stappen primers kwantificeren zoals in stap 3 QPCR methoden volgen Dezelfde stappen als vermeld in stap 3.
  2. Gebruik stromingscytometrie de niet-humane siaalzuur Neu5Gc (N -glycolylneuraminic zuur) volgens in de kit die als eerder gepubliceerd 10 standaard ziektebeelden.
  3. Voorzichtig wassen de celkweek platen met cellen met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  4. Distantiëren kolonies met 1x dissociatie reagens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Tijdens de 5 minuten incubatietijd van stap 5.4 Bereid de blockingbuffer (verstrektkit) door een 0,5% Blocking Agent in ijskoude PBS.
  6. Label de volgende set van buizen voor flowcytometrieanalyse: ongekleurd; 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) DAPI; Controle antilichaam 1: 200; Primair antilichaam 1: 200; Secundair antilichaam 1: 200 Donkey Anti-kip IgG (H + L); Monster MEF; Monster post-weggesneden cellen op matrix; en Sample post-weggesneden cellen op synthetische ondergrond.
  7. Voorzichtig los celaggregaten uit stap 5.4 door het toevoegen van 2 ml van het blokkeren oplossing en overdracht inhoud naar een 15-ml conische buis. Centrifugeer bij 80 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
  8. Was de cellen tweemaal met blokoplossing en gecentrifugeerd zoals in stap 5.7.
  9. Voorzichtig resuspendeer ongeveer 1 x 10 6 cellen in 100 pl blokkeeroplossing de overeenkomstige verdunningsvolume van elk antilichaam. Incubeer met zachte schommelen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
  10. Herhaal wast driemaal in stap 5.8.
  11. Re-schorten de cel pellet in 400 ul van Verdunningsmiddel Buffer (van kit) met 1: 100 DAPI voor buizen 2, 6, 7, en 8 genoemd in stap 5.6.
  12. Stam cellen door een 40 uM zeef en lopen door doorstroomcytometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We presenteren een protocol voor het afleiden van klinisch-grade-factor vrij hiPSCs met behulp van de STEMCCA lentivirale-gebaseerde herprogrammering aanpak. Figuur 1A toont een representatief beeld van drie verschillende pre-weggesneden iPSC lijnen, na herprogrammering met de STEMCCA aanpak op een laag van MEF. Het belangrijkste voordeel van de STEMCCA herprogrammering aanpak ligt bij de consistente herprogrammering succes bereikt door meerdere wetenschappers, in verschillende onderzoeksgroepen en loca...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschrijven een methodiek voor het afleiden-factor vrij hiPSCs en waardoor ze klinisch relevant door het omzetten van deze cellen in het GMP-grade voorwaarden voor downstream celdifferentiatie in de toekomst menselijke geneeswijze. Hoewel dit protocol is breed toepasbaar op een verscheidenheid van celtypen, kozen we humane dermale fibroblasten herprogrammeren, wegens het gemak van extractie van de patiënt en hun toepasbaarheid op maat menselijke therapeutica. Zodra beperkingen wat worden verholpen volledige different...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

James A. Byrne (JAB) en Agustin Vega-Crespo ontvangen onderzoeksfinanciering van Fibrocell Science, Inc. JAB is een wetenschappelijk adviseur voor Fibrocell Science, Inc. Geen andere auteurs hebben enige concurrentiebelangen te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Patrick C. Lee, Cyril Ramathal en Saravanan Karumbayaram (SK) bedanken voor hun hulp bij het uitvoeren van de iPSC-afleidings- en karakteriseringsexperimenten; Aaron Cooper voor het uitvoeren van de iPSC-analyse-experimenten; Vittorio Sebastiano en Renee A. Reijo Pera voor het leiden van de initiële herprogrammeringsinspanningen; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack en Donald B. Kohn voor het leiden van de oprichting van de UCLA GMP-faciliteiten die de conversie en karakterisering van klinische iPSC's mogelijk maken; Gustavo Mostoslavsky voor het verstrekken van de STEMCCA-polycistronische herprogrammeringsvector. Dit werk is gebaseerd op een onderzoekssamenwerking met Fibrocell Science en de Clinical Investigations for Dermal Mesenchymally Obtained Derivatives (CIDMOD) Initiative om veilige gepersonaliseerde cellulaire therapeutische middelen te genereren. Dit werk werd ondersteund door financiering van het Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research aan UCLA, The Phelps Family Foundation, Fibrocell Science, Inc. en de UCLA CTSI Scholar's Award aan JAB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Media en reagentia
DMEM/F12 (basismedia)Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)11330057
Fetaal bovien serumInvitrogen16000044
Minimum essentieel medium (MEM) niet-essentiële aminozuren (NEAA), 100xInvitrogen11140050
Glutamax, 100xInvitrogen35050-061
PenStrep, penicilline-streptomycine, 100xInvitrogen15140-122Ontdooi bij 4 °C, verdeel in porties en bewaar bij −20 °C
Knockout serum vervangingInvitrogen10828028Ontdooi bij 4 °C, verdeel in porties en bewaar bij −20 °C
Trypsin/EDTA, 0,5%Invitrogen15400-054Verdun stock tot 0,05% in 1x PBS
Basic fibroblast growth factorGlobalStem (Rockville, MD, USA)GSR-2001Reconstitueer tot 10 µg/ml stock in 0,1% bovien serum albumine opgelost in 1x PBS en bewaar bij −80 °C
β-mercaptoethanolMillipore (Billerica, MA, USA)ES-007-E
Matrigel (basale membraanmatrix)BD Biosciences (San Jose, CA, USA)356231Verdun stock Matrigel fles met 10 ml DMEM/F12 terwijl het op ijs staat voor een 1:2 verdunning. Verdeel in porties en bewaar bij −20 °C.
CELLstart (synthetisch substraat)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (Cambridge, MA, USA)04-0012-02
PuromycinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (Basel, Zwitserland)4707494001
ProFreeze-CDM Medium/vriesmediumLonza (Basel, Zwitserland)12-769E
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)D8418
PBSInvitrogen14190-250
100 BP DNA LadderInvitrogen15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000xInvitrogenS33102
AgaroseBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)161-3101
Gelatine, uit varkenshuidSigma-AldrichG1890-100GMaak stock van 0,2% in PBS, autoclaveer en bewaar op kamertemperatuur.
mTeSR1StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada)5850Combineer Supplement 5x met het basismedium, verdeel in porties en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
Stemedia NutriStem XF/FF CultuurmediumStemgent05-100-1AOntdooi bij 4 °C O/N, verdeel in porties en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
PrimocinInvivoGen (San Diego, CA, USA)ant-pm-1
Accutase (dissociatiereagens)InvitrogenA1110501
Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)703-546-155
Polybrene/transfectie-agensMilliporeTR-1003-G
Plasticware
12-wells platenVWR (West Chester, PA, USA)29442-038
6-wells platenVWR29442-042
10-cm platenSigma-AldrichZ688819
18-gauge naaldFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)148265D
21-gauge naaldFisher Scientific14-829-10D
Apparatuur
BD LSRII Flow CytometerKSystem by Nikon (Tokyo, Japan)
BD FACSDiva Version 6.1.3 SoftwareBD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR KitKAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA)KK2601
High Pure RNA Isolation KitRoche11828665001
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis KitRoche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack KitSialix (Newton, MA, USA)Basic Pack
Media
Gecombineerde media 1StemCell Technologies en StemgentBestaat uit gelijke delen mTeSR1 en Nutristem
Gecombineerde media 2StemCell Technologies en StemgentBestaat uit gelijke delen TeSR2 en Nutristem
HUF MediaDulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium/F12 [DMEM/F12] aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 1x niet-essentiële aminozuren, 1x Glutamax, en 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell MediaDMEM/F12 aangevuld met 20% knockout serum vervanging, 1x Glutamax, 1x niet-essentiële aminozuren, 1x Primocin, 1x β-mercaptoethanol, en 10 ng/ml basic fibroblast growth factor.
DMEM/F12, Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium/F12; PBS, fosfaat-gebufferde zoutoplossing.

Referenties

  1. Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
  2. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
  3. Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
  4. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  7. Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  8. Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
  9. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
  10. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
  11. Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
  12. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
  13. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
  14. Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
  15. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  16. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Menselijke ge nduceerde pluripotente stamcellenlentivirale herprogrammeringfactorvrije hiPSC sextractie van genomisch DNAadeno Cre virusexcisieconversie naar GMP kwaliteitxenovrije conditiesflowcytometrie analyseexpressie van pluripotentiemarkersklinische hiPSC s

Gerelateerde artikelen