Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

14.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52179

⸱

12 januari 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, 2The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Research, The University of Melbourne

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen die een flexibele en strategische basis bieden voor het op een virale manier manipuleren van oligodendrocytenvoorlopercellen om eiwitten van belang overexpressie te laten vertonen met als doel hun rol in oligodendrocyten specifiek te onderzoeken via het in vitro model van centrale zenuwstelsel myelinisatie.

Samenvatting

Myelination is een complex proces dat zowel neuronen en gliacellen myelinevormende omvat, oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CZS) en Schwann-cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS). We gebruiken een in vitro assay myelinisatie, een gevestigd model voor de studie CNS myelinisatie in vitro. Om dit te doen, zijn oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) toegevoegd aan de gezuiverde primaire knaagdieren dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen te myeliniserende co-culturen te vormen. Om specifiek ondervragen de rollen die specifieke eiwitten door expressie oligodendrocyten uitoefenen op myelinisatie hebben we protocollen selectief transduceren OPC met de lentivirus overexpressie wildtype constitutief actieve of dominant negatieve proteïnen alvorens gezaaid op de DRG neuronen ontwikkeld. Dit stelt ons in staat om specifiek te ondervragen de rollen van deze oligodendrogliale eiwitten bij het reguleren myelinisering. De protocollen kunnen ook bij de studie van ot toegepasthaar celtypen, waardoor een aanpak die selectieve manipulatie van eiwitten met een gewenste cel tot expressie, zoals oligodendrocyten voor de gerichte bestudering van signalering en compensatiemechanismen maakt. Samenvattend combineren de myelinisatie in vitro assay met lentivirale geïnfecteerd OPC levert strategisch instrument voor de analyse van moleculaire mechanismen voor myelinisatie.

Inleiding

Myelinisatie van axonen is cruciaal voor de snelle en efficiënte overdracht van actiepotentialen in zowel het centrale en perifere zenuwstelsel. Gespecialiseerde cellen, Schwann cellen in het perifere zenuwstelsel en oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel, wikkel rond en ensheathe axonen in myeline, effectief te isoleren van de zenuw en het faciliteren saltatorische geleiding 1. Het proces van myelinisatie kan worden bestudeerd in vitro met retinale ganglion neuronen 2, ontworpen nanovezels 3 of dorsale wortel ganglion neuronen samen gekweekt met ofwel Schwann-cellen 4 of oligodendrocyten 5-7. De in vitro myelinisering test is een gevestigd model voor het bestuderen van het zenuwstelsel myelinisatie en het veel van de fundamentele processen die optreden tijdens myelinisatie in vivo 5-8 repliceert. De test omvat de co-cultuur van gezuiverde populaties van ganglion (DRG) neuronen, met OPC (voor CNS myelinisatie) of Schwann-cellen (voor myelinisatie PNS). Onder bepaalde voorwaarden deze myeliniserende cellen ensheathe DRG axonen in de bestelde, ultra structureel gecontroleerd, multi-lamellaire isolerende plasmamembraan die dezelfde complement van myeline specifieke eiwitten die aanwezig zijn in vivo te uiten.

De meest gebruikte cellen bij studeren CNS myelinisatie in vitro co-kweken van DRG neuronen en OPC, die met succes gebruikt volgens welke exogene factoren zoals de neurotrofinen uitoefenen op CNS myelinisatie in vitro 5,6 bestuderen. Exogene factoren zoals groeifactoren of kleine moleculen farmacologische remmers op grote schaal gebruikt om de rol van signaaltransductiewegen in myelinisatie met de DRG-OPC coculture model 7,9 bestuderen. In de gemengde co-kweek instellingen die zowel de neuronen en oligodendrocyten bevatten, formeel mogelijk blijft dat ofwel de groeifactoren of de farmamacological remmers zou hebben uitgeoefend effecten op zowel de DRG neuronen en oligodendrocyten (OL). Dit biedt wel de mogelijkheid om specifiek ontleden de rollen die de eiwitten tot expressie alleen door DRG of oligodendroglia uitoefent op myelinisatie met deze dubbele celsysteem. Ondubbelzinnig bevestigen dat de signaleringsroute in oligodendrogliale direct regelt myelinisatie lentivirale transductie van OPC vóór het zaaien op DRG neuronen voor myelinisatie in vitro assay heeft bewezen een elegante manier om zowel wildtype en mutante eiwitten tot overexpressie brengen, zoals ook als knockdown expressie van constitutief tot expressie gebrachte eiwitten door oligodendrocyten. Zo biedt deze aanpak een laan om specifiek te ondervragen en te manipuleren signaalwegen binnen oligodendrocyten voor het bestuderen van myelinisatie 9,10.

In dit artikel rapporteren we methoden die we hebben ontwikkeld om een ​​eiwit van interesse overexpressie selectief in oligodendrocyten via een lentiviraalbenadering voor het bestuderen myelinisatie in vitro. De techniek begint met het genereren van expressie vectoren die het gen van belang, hetzij in een wild type, constitutief actieve of dominant negatieve vorm die vervolgens worden gekloneerd in de vector pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Deze vector (die het gen van belang), de CMV promotor donor (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) en de 2K7 lentivector worden gecombineerd in een enzymreactie op een 2K7 vector die CMV promoter, het gen van belang, een produceren interne ribosomale ingangsplaats en GFP (Figuur 1). Deze gateway gekloneerd 2K7 construct in combinatie met de PMD2.G virus envelop en de pBR8.91 virus pakket kan worden gecotransfecteerd in HEK293T cellen lentivirus die vervolgens kan worden gebruikt om OPC transduceren genereren. Eenmaal besmet met het lentivirus de OPCs drukken een hoog niveau van het eiwit van interesse. Deze OPC's kunnen vervolgens worden gezaaid op DRG-neuron culturen en het effect dat expressiehoge niveaus van het gewenste eiwit uitoefent op myelinisatie kunnen worden uitgelezen. De co-kweken worden beoordeeld voor myeline eiwit expressie door Western blot analyse en gevisualiseerd voor de vorming van gemyeliniseerde axonen segmenten door middel van immunocytochemie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: alle dieren die voor deze studie waren van gemengd geslacht en gefokt bij de Animal-voorzieningen van de afdeling Anatomie en Pathologie en De Florey Instituut voor Neurowetenschappen en Mental Health Research aan de Universiteit van Melbourne. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door dierproeven ethische commissies aan de Universiteit van Melbourne.

1. Klonen van 2K7 Lentivector

  1. Voor het kloneren van het gen van belang in de 2K7 lentivirale vector, subkloneren van het gen in de vector pENTR (3637 bp, kanamycineresistente) onder toepassing van standaard moleculaire technieken 11. Gebruik de EcoRI en SacII restrictieplaatsen voor het subkloneren.
  2. Versterking van de 2K7 Lentivector
    1. Transformeren 2K7 lentivector DNA door voorzichtig te mengen 100 ng van plasmide DNA met competente cellen en incubeer op ijs gedurende 30 minuten.
    2. Heat shock DNA / competente cellen mengen bij 42 ° C gedurende 90 sec en plaat ze op LB-agarplaten die zowel ampiciLLIN (100 ug / ml) en chlooramfenicol (15 pg / ml) bij 37 ° C gedurende 16-18 uur.
      OPMERKING: Chloramphenicol wordt gebruikt om recombinatie tussen de lange terminale herhalingen te voorkomen.
    3. De volgende dag, groei geselecteerde bacteriële klonen in LB medium dat zowel ampicilline (100 ug / ml) en chlooramfenicol (15 pg / ml) bij 37 ° C gedurende 16-18 uur. Extraheer het DNA met een commercieel plasmide-DNA Maxiprep kit volgens instructies van de fabrikant.
  3. Sub-kloneren van pENTR vector tot 2K7 Lentivector (figuur 1)
    figure-protocol-1
    Figuur 1:. Schematische weergave van de Gateway recombinatieproces Het gen van interesse, hier voorgesteld als Flag-Erk1, wordt gekloneerd in de pENTR L1-L2 vector. Dit wordt toegevoegd aan de pENTR L4-R1 vector bevattende de CMV-promoter en de ruggengraat 2K7 vector. Deze drie vectoren worden gerecombineerd door LR Clonase II Plus enzymSteek het gen-van-belang en de promotor in de virus-ready 2K7 vector.
    1. Voeg het volgende toe aan een 1,5 ml tube en meng voorzichtig:
      L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 BNG) 1-2,5 pi
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (met een gen van belang) (80 BNG) 1-2,5 pi
      K7 lentivector (80 ng / pl) 1 pl
      TE-buffer, pH 82-5 gl
      Totaal 8 pi
    2. Verwijder clonase enzymmengsel van -80 ° C en ontdooien op ijs gedurende 2 minuten. Zorg ervoor dat dit enzym een ​​verse hoeveelheid van -80 ° C als het enzym aanzienlijk is verminderd kloneringsefficiëntie met herhaalde vries-dooi cycli
    3. Voeg 2 pl enzym per reactie en meng goed via vortex, en incubeer de clonasereactie mengsel bij 23-25 ​​° C gedurende 6-24 uur.
    4. Voeg 1 pl proteinase K oplossing (met enzym kit) aan de clonasereactie mengsel en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
    5. Transformeren clonasereactie mengsel in competente cellen en groeien de selectkolonies op LB medium dat ampicilline (100 ug / ml) bij 37 ° C gedurende 16-18 uur.
    6. Extraheren en zuiveren van DNA met een commercieel plasmide-DNA Miniprep kit volgens instructies van de fabrikant.
    7. Bevestig het DNA via de spijsvertering gebruikmaking van restrictie-enzymen Spe I en Sac II en een geschikte buffer conform de aanwijzing van de fabrikant om het fragment met de promotor en gen van belang te verwijderen.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang om te controleren of de gesubkloneerde DNA heeft de juiste insert gen van belang met de juiste vector backbone. De grootte van de vector zelf zonder ingevoegde fragment 6,7 kb. De omvang van de losgelaten ingevoegde fragment omvat zowel de promotor en het insert gen van belang. Bereken het verwachte fragment maten van de digest voor het specifieke gen via een DNA-sequentie-editing programma, bijvoorbeeld, APE - een plasmide Editor.
    8. Controleer de afmetingen van beide DNA vector backbone en de vrijgemaakte fragment door het uitvoeren van een 1% agarosegelin 1x TAE-buffer (zie tabel voorraad oplossingen) op 100 V.
    9. Amplify de bevestigde DNA door groeiende bacteriën in 500 ml LB medium dat ampicilline (100 ug / ml) bij 37 ° C gedurende 16-18 uur.
    10. Extraheren en zuiveren van DNA met een commercieel plasmide-DNA Maxiprep kit volgens instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Maxiprep genereert typisch voldoende hoeveelheid DNA die nodig is voor virusproductie.
  4. Herhaal stap 1.3.9-1.3.10 de volgende DNA's voor lentivirale preparaten amplificeren: Envelop vector (PMD2.G, 6,1 kb), Pakket vector (pBR8.91, 12.5 kb) en een lege lentivirale vector als controle (GFP -CMV-2K7, 8,7 kb).

2. 2K7 Virus Production

OPMERKING: Dag 1:

  1. Op de dag van de transfectie, plaat 32 miljoen HEK293- T-cellen in T175 kolf met 25 ml HEK293- T-cel media (zie de tabel op voorraad oplossingen). Als alternatief, plaat 16 miljoen cellen van de dagvóór de transfectie als de tijd loopt strak op de dag van de transfectie.
    OPMERKING: Transfectie kan even succesvol door uitplaten cellen op de dag van transfectie of voorafgaand aan de dag. Met een van de twee alternatieven, het kritieke punt hier is te waarborgen cellen worden vastgeplakt op kweekschaal oppervlak voor transfectie.
    OPMERKING: Dag 2:
  2. Transfectie
    1. Voorafgaand aan transfectie DNA verdunnen tot 1 ug / ul in TE buffer die 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 in gedeïoniseerd water bevatten.
    2. In een 50 ml buis, stelt een master mix (tabel 1) voor transfectie in de T175 kolf. DNA toevoegen aan voorverwarmde Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) en meng goed door de vortex, voeg dan steriele polyethylenimine (PEI) (zie de tabel op voorraad oplossingen) om voortijdige neerslaan te voorkomen. ">
      Vector trong> Concentratie Volume
      pMDG.2 1 ug / ul 5 gl
      pBR8.91 1 ug / ul 15 pl
      2K7 vector met GFP + gen van belang 1 ug / ul 22 pi
      Steriele Polyethyleenimine (PEI) 1 g / l 500 pi
      DMEM 2.100 pi
      Tabel 1: Voorbereiding transfectiemix voor 2K7 Virus.
    3. Meng goed door het buisje 3-4x en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Voer een volledige media verandering op HEK293T cellen. Zuig uit het kweekmedium uit cellen volledig en te voeden met voorverwarmde HEK293T celcultuur media (25 ml per T175 kolf).
    5. Voeg de transfectie mengsel (DNA / PEI mengsel) druppelsgewijs aan de monolaag cellen. Verplaats voorzichtig om goed te mengen en incubeer getransfecteerde cellen bij 37 ° C, 5% CO 2, 's nachts.
      OPMERKING: Dag 3:
    6. Om ervoor te zorgen de transfectie succesvol is, controleer GFP expressie 24 uur na transfectie via een fluorescentie microscopie.
      OPMERKING: Meer dan 50% van de cellen die GFP geeft gewoonlijk een goede transfectie.
      OPMERKING: Dag 4:
  3. Bij de 48 uur na transfectie, het verzamelen van de virale supernatant en te vervangen door verse HEK293 T-media (25 ml per T175 kolf).
    1. Centrifugeer het virale supernatant bij 1140 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te helderen celresten uit de supernatant. Overdracht heldere supernatant aan 50 ml buisje en bewaar bij 4 ° C.
      OPMERKING: Dag 5:
  4. Op 72 uur na transfectie, verzamel de tweede partij van viraal supernatant. Herhaal stap 2.3.1 en het zwembad 48 en 72 uur ontruimd bovenstaande vloeistoffen.
  5. Om het virus, centrifuge viraal supernatant geconcentreerd bij 170.000 xg gedurende 90 min bij 4 ° C met 30 ml ultracentrifuge buizen.
  6. Verwijder het supernatant en herhaal stap 2.6 tot alle heldere supernatant werd gecentrifugeerd waardoor een (onzichtbaar) pellet virus plus geprecipiteerd PEI in de bodem van de buis.
  7. Om virus opnieuw in suspensie, voeg 500 ul SATO media (zie tabel op voorraad oplossingen) om de ultracentrifuge buizen. Vortex gedurende 30 seconden eennd schraap de onderkant van de buis met een pipet tip om mechanisch los te maken van het virus. Herhaal deze stap 6x om virale pellet los.
  8. Bundelen de geresuspendeerd virus in microcentrifugebuisjes en spin heel kort om onoplosbare PEI verwijderen. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 pm filter om eiwitten te verwijderen.
  9. Aliquot het virus in 20 ul, 50 ul en 100 ul aliquots en bewaar bij -80 ° C.

3. virale titer bepaling in HEK293T cellen

  1. Om de expressie van eiwit van interesse te controleren en om de optimale virale concentratie experimenten bepalen, voeg een reeks seriële verdunningen van virale voorraad (bijvoorbeeld 0, 5, 10, 20, 40, 80 ui) aan HEK293 T-cellen uitgeplaat in transduceren 6-well platen en kweek gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Dit protocol genereert typisch virus die kunnen worden gebruikt in concentraties die variëren van 1:50 tot 1: 200, dat stabiele expressie van het gen te bereikenbelang.
  2. 48 uur na virale transductie, lyseren HEK293T cellen in TNE buffer (zie tabel voorraad-oplossing) met proteaseremmers.
    1. Spoel putjes tweemaal met koud DPBS en voeg vervolgens 150 pl TNE buffer aan elk putje.
    2. Lyse cellen door en neer te pipetteren 5-10x. Transfer hele cellysaten 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer op ijs gedurende 15-30 min.
    3. Centrifugeer de lysaten bij 4 ° C gedurende 30 minuten bij maximale snelheid (20000 xg) en overdracht heldere supernatant naar een nieuwe buis voor bepaling eiwit door Bradford en daaropvolgende Western blot analyse.
  3. Bepaal het niveau van expressie van het eiwit van belang door standaard western blot analyse terwijl het sonderen voor antilichamen tegen het eiwit zelf en de gesmolten tag (dat wil zeggen, de Vlag). Gebruik de virale verdunning> 95% GFP + cellen en robuuste expressie van eiwit van interesse voor experimentele oplevert.

4. Isolatie en Cultuur van DRG's (Figure 2 stappen 1 & 2)

figure-protocol-2
Figuur 2:. Schematische weergave van de myelinisatie in vitro assay DRG neuronen worden ontleed uit P2-3 rat pups, vervolgens gezuiverd en gekweekt gedurende twee weken (1-2). OPC's worden gezuiverd van P7-9 rat hersenen met behulp van immunopanning (3). OPC's worden vervolgens geïnfecteerd met lentivirus en gekweekt gedurende 48 uur (4). OPC's worden vervolgens gezaaid op DRG's, en alle groeifactoren van belang, zoals BDNF worden toegevoegd (5). Co-culturen zijn vervolgens gekweekt gedurende 2 weken om OPC te differentiëren en myeliniseren de axonen (6). Tenslotte worden co-kweken hetzij gelyseerde voor western blotting of immunocytochemie vaste (7).

OPMERKING: Dag 1- 2 dagen voor dissectie:

  1. Coat geautoclaveerd 22 mm x 22 mm dekglaasjes met poly-L-ornithine (0,5 mg / ml) in een 6-wells plaat en incubeer bij 37 ° C geïncubeerd.
  2. Op de volgende dag, jas coverslips opnieuw met Laminin (20 ug / ml in MEM) bij 37 ° C gedurende de nacht, aspireren overtollige en droog gedurende 20 minuten in weefselkweek kap.
    OPMERKING: Dag 2: Dissection en isolatie van DRG's:
  3. Offer P2-P3 rattenpups 12x door cervicale doorsnijding.
  4. Verwijder de huid die over de spieren van de rug van het dier. Gebruik Vannas schaar om vertebrale foramen openen en een tang om voorzichtig schep het ruggenmerg.
  5. Rukken uit DRG's dat er in liggen tussen de wervelkolom en afgesneden bevestigd spinale zenuwen, dan plaats DRG's in een 33 mm petrischaal met 3 ml L-15 media. Het is gewoonlijk mogelijk te verzamelen tussen 8 en 12 DRG van elke zijde van het ruggenmerg
  6. Overdracht verzameld DRG samen met de L-15 medium in een 15 ml buis, centrifuge bij 180 xg gedurende 5 minuten.
  7. Aspirerenhet supernatant, voeg 2 ml 0,25% trypsine pellets DRG en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
  8. Voeg 5 ml M1 medium (zie Tabel stamoplossing) de DRG pellets stoppen trypsine en centrifugeer bij 180 xg gedurende 3 min bij kamertemperatuur.
  9. Zuig supernatant, resuspendeer de pellet in 2 ml voorverwarmde M1 medium (niet met groeifactoren). Vermaal de ganglia pellet door pipetteren 50x of totdat de ganglia worden gedispergeerd. Centrifugeer celsuspensie bij 180 xg gedurende 3 min.
  10. Hersuspendeer los neuronen in M1 media en plaat vastgelegd in een 6-wells plaat op 5 ganglia per 100 ul per putje.
  11. Na minimaal 4 uur incubatie om prolifererende niet-neuronale cellen te verwijderen, om bevestiging te vergemakkelijken, verwijdert M1 media en voeden neuronen met M2 media (zie tabel op voorraad-oplossing). Cultuur DRG neuronen in de aanwezigheid van NGF (100 ng / ml) een cultuur van NGF-afhankelijke TrkA tot expressie DRG zuiveren. U kunt ook gebruik maken van BDNF (100 ng / ml) aan BDNF-afhankelijke TrkB-expres zuiverenzingen DRG.
  12. Handhaaf neuronen in M1 medium (+ NGF of BDNF bij 100 ng / ml) afwisselen met anti-mitotische M2 media voor 2 weken hieronder.
  13. Handhaaf medium M1 (+ NGF of BDNF bij 100 ng / ml) op dag 4-6, 8-10, 12-14 en M2 media (+ NGF of BDNF bij 100 ng / ml) met FDU en uridine op dag 1 4, 6-8 en 10-12. Een minimum van 3 cycli van M2 media zuivering vereist.
  14. Behouden DRG in M1 alleen voor een verdere week na het voltooien van de 2 week antimitotische cyclus. Veranderen M1 media om de 2-3 dagen.

5. Isolatie en Cultuur van OPC's (figuur 2 stap 3)

OPMERKING: Dag 1- 2 dagen voor dissectie:

  1. Coat 10 cm weefselkweekplaten met Poly-D-Lysine (PDL, 10 ug / ml in gesteriliseerd gedeïoniseerd water) bij 4 ° C overnacht.
    Opmerking: Dag 2: 1 dag voor dissectie:
  2. Was PDL platen met gesteriliseerd gedemineraliseerd water voor 3x. Laten drogen ~ 6 uur in weefselkweek kap. Als niet wordt meteen gebruikt, wrap en op te slaanmaximaal 4 weken bij 4 ° C.
  3. Bereid secundair antilichaam platen voor immunopanning. Voor 1 hersenen dissectie, bereiden 2x IgG platen (voor RAN2 antilichaam aan astrocyten en O1 antilichaam te verwijderen te verwijderen premyelinating oligodendrocyten), met 45 pi Geit α muis IgG in DPBS (15 ml) per 10 cm petrischaal; 1x IgM dienblad (O4 antilichaam voor het selecteren oligodendrocyt voorloper cellen), 45 pl geit α muis IgM in DPBS (15 ml) per 10 cm petrischaal.
    OPMERKING: Dag 3: dag van de dissectie:
  4. Voeg 200 eenheden van papaïne in 10 ml papaïne buffer (tabel 2), en opwarmen bij 37 ° C totdat de buffer helder wordt.
    Concentratie 250 ml De eindconcentratie
    EBSS voorraad 10x 25 ml 1x
    MgSO4 100 mM 2.5 ml 1 mM
    Glucose 30% 3 ml 0,46%
    EGTA 0.5 M 1 ml 2 mM
    NaHCO3 1 M 6.5 ml 26 mM
    Breng het volume tot 250 ml met gedemineraliseerd water en filter steriliseren
    Tabel 2: Bereiding van papaïne buffer.
  5. Was alle secundaire antilichaam platen met DPBS voor 3x.
  6. Giet de RAN2 en O1 antilichaam op de IgG-platen en de O4 hybridoma- aan de IgM-plaat. Incubeer al deze primaire antilichaam platen gedurende meer dan 2 uur bij KT.
  7. Ontleden één brein van een P7 rat. Onthoofden een pup met geslepen schaar en verwijder de huid bovenop de schedel met een schaar.
    1. Snijd rond de schedel van de occipitale kwab, de temporale kwab en de frontale kwab. Verwijder de hersenen uit de schedel met behulp van een pincet en voorzichtig overbrengen naar een 35-mm petrischaal met 1 ml DPBS.
    2. Snijd de hersenen in kleine stukjes ruwweg met een schaar of steriel mes.
  8. Filter voorverwarmd papaïne buffer (10 ml) in een nieuwe 15 ml buis met enkele korrels van L-cysteïne, voeg 200 ul DNAase (12.500 U / ml) de gefilterde papaïne buffer.
  9. Giet de papaïne buffer op de in blokjes gesneden hersenweefsel; incuberen bij 37 ° C gedurende 90 min.
  10. Gentlly overdracht los hersenweefsel in 50 ml buis met behulp van een pipet 25 ml enlaat bezinken.
  11. Verwijder papaïne buffer, voeg 2 ml Lo Ovo (ovomucoïde) naar de hersenen weefsels en titurate 5-10x door pipetteren te breken brokken van hersenweefsel, laat bezinken en verwijder de top 2 ml van de bovenstaande naar een nieuwe buis.
  12. Voeg nog een 2 ml Lo Ovo aan hersenweefsel en herhaal stap 5.11 tot er geen stukjes weefsel blijven. Tituration kan krijgen steeds agressiever.
  13. Centrifugeer gedissocieerde celsuspensie gedurende 15 minuten bij 200 x g. Zuig uit supernatant en resuspendeer celpellet in 10 ml Hi Ovo en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 200 x g.
  14. Was de eerste immunopanning plaat (Ran 2 plaat) met DPBS voor 3x. Zuig supernatant, resuspendeer cellen in 10 ml panning buffer (tabel 2) en giet op de eerste immunopanning plaat (Ran 2 plaat). Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  15. Was de tweede immunopanning plaat (O1 plaat) met DPBS voor 3x.
  16. Na de incubatie op de eerste immunopanning plaat, tip de celsuspensie op tweedeimmunopanning plaat (O1 plaat), Spoel alle losse cellen van het oppervlak van de plaat met 1-3 ml van panning buffer en pipetteer de O1 plaat. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  17. Was de derde immunopanning plaat (O4 plaat). Deze plaat is de positieve selectie plaat waar de OPC's binden het oppervlak. Was de O4 plaat met DPBS voor 3x.
  18. Na de incubatie op de tweede immunopanning plaat overbrengen van de cellen naar de uiteindelijke immunopanning plaat (O4 plaat), incubeer cellen gedurende 45 min bij kamertemperatuur. Deze stap zal O4 + OPC's te selecteren.
  19. Zuig het supernatans van de laatste immunopanning plaat (O4 plaat) en spoel de plaat met EBSS voor 6x.
  20. Om OPC verwijderen van de plaat, incubeer cellen met 5 ml warm 0.05% trypsine-EDTA verdund 1:10 met EBSS bij 37 ° C gedurende 8 min.
  21. Voeg 5 ml 30% FBS (in EBSS) om de trypsine te neutraliseren. Verwijder cellen af ​​oppervlak van de plaat door pipetteren voor ongeveer 50x.
  22. Breng alle celsuspensie naar een nieuwe buis en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 200 x g.
  23. Gooi supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml voorverwarmde SATO media, gevolgd door de cel tellen. Dissectie van een brein kan opleveren 1,5-2.000.000 OPC's.
  24. Plaat cellen op droge PDL beklede platen bij een dichtheid van 1 x 10 5 en 5 x 10 5 per 10 cm plaat met in SATO media (10 ml) dat ciliaire neurotrofe factor bevatten (CNTF, 10 ng / ml), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF, 10 ng / ml), neurotrofine 3 (NT3, 1 ng / ml) en forskoline (4,2 ug / ml) 2,12. Cultuur OPC bij 37 ° C, 8% CO2.

6. transducing OPC

  1. Cultuur primaire OPC in SATO media (10 ml / 10 cm plaat) met CNTF (10 ng / ml), PDGF (10 ng / ml), NT3 (1 ng / ml) en forskoline (4,2 ug / ml) bij 37 ° C, 8% CO2 gedurende 24 uur na dissectie.
  2. Volledig te zuigen uit de OPC cultuur media, diervoeder cellen met versgemaakte SATO media (10 ml) Met groeifactoren (zie hierboven in stap 6.1).
  3. Virus Naar de OPC naar de optimale concentratie bepaald met stap 3 (figuur 2, stap 4), OPC cultuur nog eens 48 uur.

7. OPC Seeding voor myeliniserende Co-culturen (Figuur 2, 5 en 6)

  1. Om OPC het oppervlak, eerste spoeling OPC platen schaffen 8 ml EBSS maal, vervolgens incubeer cellen met 5 ml warm 0.05% trypsine-EDTA verdund 1:10 met EBSS bij 37 ° C gedurende 2 min.
  2. Neutraliseer het trypsine met 30% FBS in EBSS (5 ml) en cellen van de plaat verwijderd door pipetteren. Overdracht celsuspensie aan een 15 ml buis, centrifuge bij 180 xg gedurende 15 min bij KT.
  3. Zuig het supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml voorverwarmde SATO media gevolgd door celgetal.
  4. Voorafgaand aan de OPC zaaien, volledig aspireren media uit de DRG cultuur plaat. Zachtjes zaad 200.000 OPC's druppelsgewijs op de DRG neuronen zoals eerder beschreven 4-6.
    OPMERKING:De totale OPC zaaien volume moet kleiner zijn dan 200 ul per 22 mm dekglaasje.
  5. Verlaat cellen om zich te vestigen, zonder het verplaatsen van de plaat gedurende 10 minuten in de weefselkweek kap, dan voorzichtig bijvullen met 1 ml voorverwarmde SATO media per well.
  6. Replate de overgebleven zus OPC's met SATO media met groeifactoren (zie stap 6.1). Gebruik deze zuster OPC expressie van het eiwit van interesse te controleren.
  7. Na 24 uur, vervang de SATO media met de co-cultuur media (2 ml / putje) met SATO media (geen factoren) en Neurobasal (v / v) met 1% B27. Handhaving van de co-culturen voor 14 dagen met de media te veranderen om de 2-3 dagen.
  8. Beoordeel de co-culturen myeline eiwit expressie door Western blot analyse en visualiseren voor de vorming van gemyeliniseerde axonen segmenten door dubbel immunokleuring met antilichamen tegen myeline basisch eiwit markers en neuronale merkers 4-6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De vlag gelabeld extracellulair signaal verwante kinase 1 (Flag-Erk1) construct voor lentivirus productie wordt gecontroleerd door restrictie-enzym digest van de gebruikte constructen, zowel de 2K7 constructen en de verpakking en toebehoren constructen die voor virusproductie (figuur 3) .

figure-results-1
Figuur 3: DNA construct controle. Alle DNA-constructen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Myelinisatie van axonen is een essentieel proces voor de optimale werking van zowel het centrale als perifere zenuwstelsel van vertebraten. De opwekking en instandhouding van gemyeliniseerde axonen is een complex en gecoördineerd proces waarbij moleculaire interacties tussen neuronale, gliale (van Schwann-cellen en oligodendrocyten) en extracellulaire matrixeiwitten. De betekenis en toepasbaarheid van dit protocol is dat het manipulatie van eiwitten in een specifiek celtype in de gemengde co-kweek instellingen. Als meer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot dit onderzoek.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 aan JX, project grant #628761 aan SM en APP1058647 aan JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 aan JX), het University of Melbourne Research Grant Support Scheme en Melbourne Research CI Fellowship aan JX, evenals Australia Postgraduate Scholarships aan HP en AF. We willen graag het Operational Infrastructure Scheme van het Department of Innovation, Industry and Regional Development, Victoria Australia bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2K7 lentivector Gift van Dr Suter9
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100mg
Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse IgGJackson Immunoresearch115545205
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)Life TechnologiesA11008
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG (H+L)Life TechnologiesA11005
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L)Life TechnologiesA11012
AmpicillinSigma-AldrichA9518-5G
B27 - NeuroCul SM1 Neuronal SupplementStem Cell Technologies 5711
BDNF (Human)PeprotechPT450021000
Biotin (d-Biotin)Sigma AldrichB4639
Bradford ReagentSigma AldrichB6916-500ML  
BSASigma AldrichA4161
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378-100G
CNTFPeprotech450-13020
DAKO fluoresence mounting mediaDAKOS302380-2
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamineLife Technologies10313039
DNaseSigma-AldrichD5025-375KU
DPBSLife Technologies14190250
DPBS, calcium, magnesiumLife Technologies14040182
EBSSLife Technologies14155063
EcoRI-HFNEBR3101
Entry vectors for promoter and gene of interestGenerate as per protocols 1-2
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12003C
Forskolin Sigma AldrichF6886-50MG
Glucose (D-glucose)Sigma-AldrichG7528
GlycerolChem SupplyGL010-500MZie Stock Solutions
Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115005003
Goat Anti-Mouse IgM Jackson ImmunoResearch115005020
Goat Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearch112005167
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
IgepalSigma AldrichI3021-100ML 
Insulin Sigma AldrichI6634 
KanamycinSigma-Aldrich60615
Laminin Life Technologies23017015
LB MediumZie Stock Solutions
LB-AgarZie Stock Solutions
L-CysteineSigma-AldrichC-7477
Leibovitz's L-15 MediumLife Technologies11415064
L-GlutamateSigma-AldrichG1626
L-Glutamine- 200 mM (100x) liquidLife Technologies25030081
LR Clonase II Plus enzymeLife Technologies12538-120
MEM, NEAA, no GlutamineLife Technologies10370088
Mouse α βIII Tubulin PromegaG7121
Mouse αMBP (monoclonal)MilliporeMAB381
Na pyruvate Life Technologies11360-070
NACSigma AldrichA8199
NcoI-HFNEBR3193S
NEBuffer 4NEBB7004S
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NGF (mouse)Alomone LabsN-100
NT-3Peprotech 450-03
O1 antibody - Mouse anti-O1MilliporeMAB344Alternatief als O1 hybridoma cellen niet beschikbaar zijn
O1 hybridoma cellenGeconditioneerd medium met anti-O1 antilichaam te gebruiken voor immunopanning
O4 antibody - Mouse anti-O4MilliporeMAB345Alternatief als O4 hybridoma cellen niet beschikbaar zijn
O4 hybridoma cellenGeconditioneerd medium met anti-O4 antilichaam te gebruiken voor immunopanning
Competent cellsLife TechnologiesA10460
One Shot Stbl competent cellsLife TechnologiesC7373-03
Papain SuspensionWorthington/CooperLS003126
pBR8.91Gift van Dr Denham10
PDGF-AA (Human)PeprotechPT10013A500  
Penicillin-streptomycin 100x solutionLife Technologies15140122
pENTRY4IRES2GFPInvitrogen11818-010 
pMD2.GAddgene12259
Poly-D-lysineSigmaP6407-5MG
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Aldrich408727-100ML
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
Progesterone Sigma AldrichP8783
Protease inhibitor tablet (Complete mini)Roche11836153001
Proteinase KWordt geleverd met Clonase enzym
PutrescineSigma AldrichP-5780
Rabbit α neurofilamentMilliporeAB1987  
Rabbit αMBP (polyclonal)Millipore

Referenties

  1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
  2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
  3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
  4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
  7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).
  8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
  9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
  10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
  11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
  12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

LentivirusproductieIn vitro myelinisatie assayVirale transductieWestern blot analyseImmunofluorescentiekleuringDRG neuronencultuurUltracentrifugatieprotocolGFP expressieanalyseCeluitzaai techniek
Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.