Hier beschrijven we een methode voor de gelijktijdige kwantificering van T-cel receptor excisie cirkels (TRECs) en K-deletrerende recombinatie excisie cirkels (KRECs). De TREC/KREC test kan worden gebruikt als marker voor de output van de thymus en het beenmerg.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gelijktijdige Kwantificering van de T-cel receptor Excisie cirkels (TRECS) en K-verwijderen recombinatie Excisie cirkels (KRECs) van Real-time PCR
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
T-celreceptor excisie cirkels (TRECs) en K-deleterende recombinatie excisie cirkels (KRECs) zijn gecirculeerde DNA-elementen die gevormd worden tijdens het recombinatieproces dat T- en B-celreceptoren creëert. Omdat TRECs en KRECs zich niet kunnen vermenigvuldigen, worden ze verdund na elke celdeling en blijven daarom in de cel aanwezig. Hun hoeveelheid in het perifere bloed kan worden beschouwd als een schatting van de output van de thymus en het beenmerg. Door een goed gevestigde en veel gebruikte TREC-assay te combineren met een aangepaste versie van de KREC-assay, hebben we een dubbele kwantitatieve real-time PCR ontwikkeld die de kwantificering van zowel nieuw geproduceerde T- en B-lymfocyten in een enkele assay mogelijk maakt. Het aantal TRECs en KRECs wordt verkregen met behulp van een standaardcurve die is bereid door opeenvolgende verdunning van TREC en KREC signaaljoints die in een bacterieel plasmide zijn gekloond, samen met een fragment van het T-celreceptor alfa constante gen dat dient als referentiegen. Resultaten worden gerapporteerd als aantal TRECs en KRECs/106 cellen of per ml bloed. De kwantificering van deze DNA-fragmenten is bewezen nuttig voor het monitoren van immuunreconstitutie na beenmergtransplantatie bij zowel kinderen als volwassenen, voor een betere karakterisering van immuundeficiënties, of voor een beter begrip van bepaalde immunomodulerende activiteit van geneesmiddelen.
Inleiding
T-cel receptor excisie cirkels (TRECS) en K verwijderen recombinatie excisie cirkels (KRECs) zijn kleine gecirculariseerde DNA-elementen die zijn uitgesneden in een verhouding van T- en B-cellen, respectievelijk, in een genomisch DNA recombinatie proces leidt tot de vorming van een zeer gediversifieerde repertoire van T- en B-celreceptoren. Zij hebben geen functie, maar omdat ze stabiel zijn en niet kunnen worden gerepliceerd, worden ze verdund na elke celdeling, waardoor aanhoudende slechts één van de twee dochtercellen. Daardoor kan het niveau in het perifere bloed worden aangenomen als een schatting van de thymus en beenmerg output.
Te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Ethiek verklaring: Dit protocol volgt de richtlijnen van onze instelling, de Spedali Civili di Brescia
1. Voorbereiding van een "Triple-Insert" Plasmid
- Selectie en de opstelling van een passende uitgangsmateriaal:
- Het verkrijgen van een monster dat cellen zeer waarschijnlijk TRECS en KRECs detecteerbaar met PCR, zoals perifere bloed van een jonge gezonde onderwerp in EDTA-buizen.
NB: Oorspronkelijk hadden we de methode met behulp van thymocytes voor TRECS en mononucleaire cellen uit tonsillen fragmenten voor KRECs ontwikkeld, maar gezonde proefpersonen hebben meestal een bedrag van TRECS en KRECs vold....
- Het verkrijgen van een monster dat cellen zeer waarschijnlijk TRECS en KRECs detecteerbaar met PCR, zoals perifere bloed van een jonge gezonde onderwerp in EDTA-buizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De test werd uitgevoerd in een representatieve steekproef van 87 gezonde controles: 42 kinderen in de leeftijd 0-17 (man / vrouwtjes: 25/17) en 45 volwassenen in de leeftijd 24-60 (mannen / vrouwen: 29/16). De resultaten werden verkregen als TRECS en KRECs per 10 6 PBMC, en vervolgens de TRECS en KRECs per ml bloed werden berekend.
Het aantal TRECS afneemt met de leeftijd toe te schrijven aan involutie van de thymus, 4 in het bijzonder in een zeer scherpe fashion 0-3 - .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
TREC- en KREC-kwantificering kan worden beschouwd als een goede schatting van recente thymus- en beenmergproductie, mits er rekening wordt gehouden met enkele voorbehouden. Hoewel een absolute kwantificeringsmethode met een standaardcurve meer reagentia en meer ruimte op de real-time PCR-reactieplaat vereist, zorgt dit voor zeer nauwkeurige kwantitatieve resultaten omdat onbekende steekproefhoeveelheden worden geïnterpoleerd uit standaardcurves die zijn gebouwd op bekende hoeveelheden van uitgangsmateriaal. Bovendien is .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen dankbetuigingen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA-extractie |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspendeer het gelyofiliseerd product tot 100 pmol/μl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: inclusief 10x Buffer II en 25 mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit voor Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10.000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5.000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE-buffer (1 mM TRIS en 0,1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dubbel gelabelde sondes HPLC 0,01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspendeer het gelyofiliseerd product tot 100 pmol/μl | |
| NanoDrop 2000c spectrofotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR systeem | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Referenties
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication hist....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
