Periodienzuur-Schiff-kleuring is een techniek die het polysacharidegehalte van weefsels visualiseert. Dit artikel demonstreert het protocol voor periodienzuur-Schiff-kleuring dat is aangepast voor gebruik op mononucleaire cellen uit perifeer bloed, gezuiverd uit menselijk veneus bloed. Dergelijke monsters zijn verrijkt met lymfocyten en andere witte bloedcellen van het immuunsysteem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Periodic acid Schiff (PAS) kleuring is een immunohistechemische techniek die wordt gebruikt op spierbiopsieën en als diagnostisch hulpmiddel voor bloedmonsters. Polysachariden zoals glycogeen, glycoproteïnen en glycolipiden kleuren helder magenta, waardoor het gemakkelijk is om positieve en negatieve cellen binnen het weefsel te tellen. In spiercellen wordt PAS-kleuring gebruikt om het glycogeengehalte in verschillende soorten spiercellen te bepalen, terwijl bij bloedcellen PAS-kleuring is onderzocht als diagnostisch hulpmiddel voor verschillende aandoeningen. Bloed bevat een deel van de witte bloedcellen die tot het immuunsysteem behoren. De gedachte dat cellen van het immuunsysteem glycogeen bevatten en dit als energiebron gebruiken, is niet veel onderzocht. Hier beschrijven we een aangepaste versie van het PAS-kleuringsprotocol dat kan worden toegepast op perifere bloedmononucleaire immuuncellen uit menselijk veneus bloed. Kleine cellen met PAS-positieve korrels en grotere cellen met diffuse PAS-kleuring werden waargenomen. Behandeling van monsters met amylase neemt deze patronen weg, wat de specificiteit van de kleuring bevestigt. Een alternatieve techniek op basis van enzymatische spijsvertering bevestigde de aanwezigheid en hoeveelheid glycogeen in de monsters. Dit protocol is nuttig voor hematologen of immunologen die het polysacharidegehalte in bloedafgeleide lymfocyten bestuderen.
Inleiding
Perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring is een immunohistochemische techniek die algemeen wordt gebruikt in de spieren onderzoek en diagnostiek. Het wordt ook gebruikt als een diagnostisch hulpmiddel op bloedmonsters. De techniek werkt door het aanbrengen van periodieke zuuroplossing aan het monster, welke eenheden oxideert in het polysaccharide maken aldehydegroepen die reageren met de kleurloze Schiff reagens waardoor een diep magenta product produceren. De stappen van deze werkwijze zijn weergegeven in Figuur 1. De vlek wordt alles met magenta polysacchariden, zoals glycogeen, glycoproteïnen, glycolipiden, mucinen of andere moleculen met polysaccharide eenheden.
PAS kleuring wordt vaak gebruikt om glycogeen niveaus spiervezels meten. Spieren coupes zijn ideaal voor de techniek als ze stevig aan de glijbaan en bestand tegen meerdere stappen wassen en vlekken. Glycogeen is het meest aanwezig in fast twitch type II spiervezels, die een grote vraag hebbenvoor snelle ATP productie vereisen glycogeen voor maximale prestaties 1,2. Glycogeen is een vertakt polymeer van glucose dat in het vrije glucose kan worden gebroken door de werking van glycogeen fosforylase enzymen. In tijden van rust en voedingswaarde-genoegzaamheid, wordt glycogeen aangevuld door het proces van glycogenese, terwijl in tijden van nutritionele insufficiëntie of hoge-energie-vraag; glycogeen wordt afgebroken tot glucose door glycogenolyse. Al sinds 1950 clinicus wetenschappers ontdekt PAS-kleuring op bloedmonsters glycogeengehalte in verschillende ziekten 3-7 analyseren. Bijvoorbeeld, in Pompe ziekte een bonafide glycogeen opslag ziekte-witte bloedcellen accumuleren grote hoeveelheden glycogeen die aanzienlijk verschilt van gezonde controles 8.
Dit video-artikel wordt een aangepaste versie van PAS kleuring voor perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) monsters uit veneus bloed van gezonde vrijwilligers. PBMCs bevatten meestal lymfocyten van T lymfocyten en B-lymfocyten families, evenals andere immuuncellen zoals natuurlijke killer-cellen en monocyten. De eerste zuiveringsstap verwijdert erytrocyten, neutrofielen en andere granulocyten. Deze techniek verschaft gegevens over een geconcentreerde hoeveelheid lymfocyten waardoor robuustere opsomming van PAS-positieve cellen in vergelijking met volbloed uitstrijkjes.
Figuur 1:. Stapsgewijze methode PAS kleuring van PBMC (A) Ten eerste wordt isolatie van PBMC bereikt door Ficoll, het linkerpaneel toont de bereiding vóór centrifugatie, het rechter paneel toont het na centrifugeren waarbij de bufferlaag die de PBMC waargenomen in het midden van de buis. (B) Geïsoleerde PBMC worden bevestigd op de slede met formaline-ethanol fixeermiddel oplostie. De slede wordt voorzichtig gespoeld met gedestilleerd water uit een plastic wasfles. (C) Het objectglaasje wordt vervolgens in een 100 ml bekerglas halverwege gevuld met amylase oplossing die glycogeen zal oplossen. De slede wordt voorzichtig gespoeld. (D) De schuif wordt met periodieke zuuroplossing, waarbij oxidatie van sachariden plaatsvindt. Dia's worden voorzichtig gespoeld; Dit zal de overmaat perjoodzuur verwijderen en stop de oxidatiestap. (E) Wanneer de Schiffs reagens wordt toegevoegd aan de dia, zal het reageren met aldehyden die tijdens de oxidatiestap. Deze kleurloze reagens resulteert dan in een donkerrode magenta product. Dia's worden voorzichtig gespoeld om het overtollige Schiff reagens te verwijderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Onderzoek met menselijke bloedmonsters werd goedgekeurd door Concordia University Ethics Review Board, certificaat nummer 10000618. Het werk op de muis spier werd goedgekeurd door Concordia University Ethics Review Board, certificaatnummer 2010BERG.
1. PBMC Isolatie van volbloed
OPMERKING: Voer deze procedure in een bioveiligheid kast met behulp van steriele techniek en-fabrikant gesteriliseerde apparatuur.
- Giet 10-15 ml volbloed uit het gehepariniseerde (anti-coagulant) bloedafnamebuisjes in een 50 ml steriele conische buis. Voor kleine bloed morst, veeg met DDH 2 O en 70% EtOH behulp reiniging weefsel.
- Verdun het bloed in de conische buis een 1: 1 verhouding met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS 1x) pH 7,4. Zorg ervoor dat de maximale totale volume niet meer dan 30 ml.
- Meng voorzichtig met behulp van een serologische pipet pistool vermijden bubbels.
OPMERKING: Niet mengen door het buisje om bloed een te vermijdenccumulation in de dop en de daaropvolgende kwel tijdens het centrifugeren. - Voeg 13 ml Ficoll-Paque (zie materialen en apparatuur tabel), om een nieuwe 50 ml conische buis. Houd de tube rechtop in het rek.
- Met behulp van een transferpipet, neem verdunde bloed, raakt de transferpipet tip om de binnenwand van de buis in de buurt van de top. Met langzame en constante druk, dragen het bloed langs de binnenwand van de buis die een bloed laag bovenop de sucrose laag. Doe deze stap een paar keer tot alle bloed is overgedragen.
- Sluit het buisje stevig en centrifugeer de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 min bij 700 xg in een schommel rotor met gemiddelde versnelling ingesteld op 5, en vertraging op nul gezet.
- Neemt langzaam uit de buis en zonder verstoring van de lagen, neem het terug naar de bioveiligheid kast.
- Verzamel zorgvuldig de buffycoat (dunne troebel witte laag), waar de PBMC's worden gevestigd, geplaatst tussen de PBS / plasma eennd ficoll lagen met behulp van een pipet overdracht. Vermijd het verzamelen van sucrose laag en niet de rode bloedcellen laag niet verstoren.
- Breng de buffy coat in een nieuwe 50 ml steriele conische buis. Het kan verscheidene malen herhalen van stap 1.8 alle PBMC is verzameld.
- Voeg PBS pH 7,4 op de buis met de PBMC en vul tot de 45 ml markering. Schud de buis grondig. Doe niet vortex.
- Was 1: Centrifugeer gedurende 15 min bij 480 xg zowel maximale versnelling en vertraging ingesteld op 9. Let vorming van een pellet van PBMC op de bodem van de conische buis.
- Verwijder het PBS (supernatant) in een plastic bekerglas met 10 ml bleekwater.
- Draai cel pellet door voorzichtig "rekken" tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Doe niet vortex.
- Voeg 25 ml verse PBS pH 7,4 tot de buis. Indien meer dan één buis wordt verwerkt, zwembad de pellets samen in deze stap.
- Was 2: Centrifuge de buis gedurende 12 min bij 480 xg with zowel maximale versnelling en vertraging op 9 gezet.
- Gooi het PBS (supernatant) in de plastic beker met een scheutje bleekmiddel.
- Zachtjes "rack" tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Doe niet vortex.
- Voeg 25 ml vers PBS aan de buis.
- Neem 50 pi van de cellen en overbrengen naar een microcentrifugebuis levensvatbaarheid tellen.
- Voeg een gelijke hoeveelheid (50 pl) van trypaanblauw (a levensvatbaarheid vlek) en pipet op en neer om voorzichtig te mengen.
- Neem 10 pi en overbrengen naar een hemocytometer om de levensvatbaarheid van cellen per ml controleren. Noteer het aantal cellen / ml.
- Neem de gewenste hoeveelheid cellen en centrifugeer de buis gedurende 12 min bij 480 xg zowel maximale acceleratie en deceleratie op 9 gezet.
- Gooi het PBS (supernatant) in de beker met bleekmiddel.
- Zachtjes "rack" tegen een gegolfd oppervlak (dat wil zeggen, leeg rek). Voeg 80 ul PBS in de buis.
2. Het maken van de PBMC Slide
- Plaats 80 gl van de cellen op een objectglaasje. Smeer de druppel met behulp van een slede of plaats 2 druppels van 40 pi elk aan beide uiteinden van de schuif.
- Verlaat dia in de biologische veiligheidskabinet te drogen. Label de dia met een potlood op de berijpte kant.
3. Vaststelling van de monsters op de dia
- Bereid de fixerende oplossing door het mengen van 0,5 ml 37% formaldehyde en 4,5 ml 99% ethanol.
- Na de dia's worden gedroogd, neem 2 ml van de vers gemaakte fixeeroplossing en giet het op de dia, zodat het gehele oppervlak van de dia wordt gedekt.
- Laat de oplossing op de glijbaan voor 1 min. Spoel de glijbaan voor 1 min met water uit de kraan en laat het aan de lucht drogen.
4. Het maken van de amylase Oplossing voor Negatieve controle
- Neem 0,25 g amylase poeder en los op in 50 ml diverstilde water. Giet de oplossing in een schoon bekerglas van 100 ml.
- Dompel de dia in het bekerglas dat de helft van de schuif ontvangt de behandeling en de andere helft onbehandeld blijft en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 1C).
- Maak een notitie aan welke kant van de glijbaan is het ontvangen van de amylase behandeling. Teken een lijn op de achterkant van de slede waarin de grens tussen de behandelde en controlegroepen.
- Was de dia's met DDH 2 O om de amylase oplossing te verwijderen en laat de dia aan de lucht drogen.
5. Voer perjoodzuur Schiff (PAS) kleuring en Imaging
LET OP: PAS reagentia zijn giftig bij inademing en zijn corrosief, dus de stappen die moeten worden gedaan in een zuurkast, en de afvalstoffen moet goed worden afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen.
- Plaats de dia op een vlakke ondergrond en giet 1,50-2,00 ml perjoodzuur Solution op het monster. Incubate gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- De dia's te spoelen in een aantal beschuldigingen van gedestilleerd water.
- Giet 1,50-2,00 ml Schiffs reagens op de glijbaan en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Was de dia met gedestilleerd water gedurende 5 minuten en laat het aan de lucht drogen.
- Solliciteer 10 ul montage media op de dia en dek af met twee kleine dekglaasjes, of toe te passen 50 ui en gebruik een groot dekglaasje.
- Gelden duidelijke nagellak op de randen van het dekglaasje, laat een nacht drogen.
6. Zorg voor afbeeldingen met de Verrekijker microscoop met de 100X Doelstelling
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De reagentia en basistechniek valideren, werd PAS-kleuring uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant op muis soleus spier secties. De kleuring werd uitgevoerd op dezelfde dag als het offer en in de laatste stap van de kleuring werden de coupes vastgesteld door xyleen. De soleus spier is bekend dat 35% glycogeen-positieve cellen bevatten 9 ~. De gekleurde spiercellen weergegeven twee verschillende PAS-positieve functies-punctata korrels in de cel, en een doorlopende lijn markeren van de celmembraan
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De kritische stappen van deze video artikel waren tijdens het wassen en amylase behandeling van de cellen. Terwijl het wassen van de dia's, werd de belangrijkste stap met behulp van een plastic samendrukbare wassen fles en het water te laten zachtjes lopen door het monster op de dia en niet direct gericht op de monsters. Zelfs de geringste directe waterdruk zou ertoe leiden dat de cellen af te komen van de glijbaan. Een andere belangrijke stap was dezelfde dia gebruiken ± amylase omstandigheden. Nadat de PBMC geha...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van het NSERC Discovery-programma, subsidienummer RGPIN 418522-2013. We danken R. Kilgour voor nuttige discussies, en Katelin Gresty en Dr. A. Berghdal voor het verstrekken van de muisspiersecties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Periodic Acid Schiff Kit |  Sigma-Aldrich | 395B | Voor gebruik op kamertemperatuur brengen. De materialen in deze kit zijn toxisch en schadelijk. Gebruik voorzichtigheid. |
| α-Amylase uit varkenspancreas | Sigma-Aldrich | A3176 | |
| Binoculaire microscoop | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogeenasay-kit | Sigma-Aldrich | MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Niet-ionair synthetisch polymeer van sucrose. |
| Centrifuge | Voor de isolatie van PBMC werden swing-out rotoren gebruikt. |
Referenties
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).
- Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
- Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
- Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
- Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
- Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
- Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
- Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
- Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
- Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
- Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
- Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
- Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
- Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: http://www.atlasofms.org (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
