Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

Samenvatting

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière wordt ultrastructureel samengesteld door een monolaag van hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) die onderling verbonden zijn door een junctionaal complex van tight en adherens junctions. Samen met andere celtypen zoals astrocyten of pericyten vormen ze de neurovasculaire eenheid (NVU), die specifiek de uitwisseling van vloeistoffen, moleculen en cellen tussen het perifere bloed en het CZS reguleert. Door dit complexe en dynamische systeem zijn BMEC's betrokken bij verschillende processen die de homeostase van het CZS handhaven. Een disfunctie van de BBB wordt waargenomen als een essentiële stap in de pathogenese van veel ernstige CZS-ziekten. Specifieke en gerichte therapieën zijn echter zeer beperkt, omdat de onderliggende mechanismen nog verre van begrepen zijn.

Dier- en in vitro modellen zijn uitgebreid gebruikt om een diepgaande kennis te verkrijgen van complexe fysiologische en pathofysiologische processen. Door reductie en vereenvoudiging is het mogelijk om de onderzoeksaanpak te richten op het onderwerp van belang en om een verscheidenheid aan verstorende factoren uit te sluiten. Vergelijkbaarheid en overdraagbaarheid zijn echter ook verminderd in modelsystemen, waarmee rekening moet worden gehouden bij evaluatie. De meest voorkomende diermodellen zijn gebaseerd op muizen, onder andere vanwege de steeds toenemende mogelijkheden van methodologie. In vitro studies van geïsoleerde murine BMEC's kunnen een diepgaande analyse van hun eigenschappen en van de bloed-hersenbarrière onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden mogelijk maken. Verdere inzichten in de complexe mechanismen bij de BBB vormen mogelijk de basis voor nieuwe therapeutische strategieën.

Dit protocol beschrijft een methode om primaire murine microvasculaire endotheelcellen te isoleren door een reeks fysische en chemische zuiveringsstappen. Speciale overwegingen voor zuiverheid en cultivatie van MBMEC's evenals kwaliteitscontrole, potentiële toepassingen en beperkingen worden besproken.

Inleiding

Brain microvasculaire endotheelcellen (BMEC) vorm monolagen die een integraal onderdeel van de zeer gespecialiseerde bloed-hersen-barrière (BBB). BMECs zijn verbonden door junction eiwitten aan een basale membraan. Samen met pericyten, gladde spiercellen, astrocytische end voeten en circulerende bloedcellen bouwen zij de zogenaamde neurovasculaire eenheid (NVU) ^1. Tegen de vorige notie van een ondoordringbare barrière tussen het bloed en de centrale-zenuwstelsel (CNS), de NVU is een dynamische, zeer specifieke en gereglementeerde interface die de overgang van vloeistoffen, moleculen en cellen tussen cerebrale bloedvaten en de CNS ² regelt . Een disfunctie of ontregeling van de NVU kan initiëren en / of bijdragen aan verschillende neurovasculaire, infectueuze, ontstekings- of degeneratieve ziekten van het CZS, zoals ischemische beroerte, HIV-encefalopathie, multiple sclerosis, Alzheimer of Parkinson's ziekte ^3-6.

_content "> De BMEC monolaag goed afgesloten door een Junctional complex gevormd van vast (TJ) en contactplaatsen (AJ) ^7. De hoge elektrische weerstand en de lage paracellulaire permeabiliteit van de BBB zijn voornamelijk gebaseerd op TJ eiwitten ^8. De TJs zijn complexen gevormd door de transmembraan eiwitten van de claudin en occludin familie, die gekoppeld zijn aan het cytoskelet van de endotheelcellen door adapter moleculen, zoals zonulaoccludens (ZO) eiwitten ZO1-3 ^4. contactplaatsen hoofdzakelijk samengesteld door het integrale membraaneiwit vasculaire endotheliale (VE) -cadherin, gekoppeld aan het cytoskelet via cateninen ^8.

De afdichting van de BBB voorkomt dat de vrije uitwisseling van substraten en cellen tussen bloed en CSF. Uitzonderingen op deze regel zijn lipofiele, kleine moleculen met een molecuulgewicht <400 Da, die in staat zijn om de BBB oversteken lipidegemedieerde diffusie ⁹ zijn. De passage van grotere en / ofhydrofiele moleculen, zoals glucose, aminozuren, peptiden, proteïnen en veel medicijnen beperkt tot sterk gecontroleerde transcellulaire transportsystemen ^10, die kunnen worden ingedeeld in vijf hoofdcategorieën: carrier-gemedieerd transport, ionentransport, actieve efflux transport, receptor gemedieerde vervoer, en-caveolae gemedieerd transport ^4. Deze transporter systemen helpen handhaven van de homeostase van het CZS, die nodig is voor een nauwkeurig signaal genereren, transductie en integratie. Bovendien BMECs kunnen actieve regeling van de overgang afzonderlijke moleculen door de expressie van verschillende ectoenzymes. Deze enzymen zijn gelokaliseerd op het celoppervlak en wijzigen specifieke endogene en exogene substraten hinderen of voor de overgang van de BBB ^11.

Overwegende dat de CNS werd beschouwd als een immuun-bevoorrechte orgel voor een lange tijd, recente bevindingen suggereren een vrij dynamisch en strak gereguleerd systeem van immuun surveillance van de CNS. De BMECs spelen een kritieke rol in de regulatie van het immuunsysteem cel transmigratie. Door de expressie van selectinen op hun oppervlak lymfocyten selectief geïnduceerd losjes hechten aan het endotheel. De afscheiding van chemokinen die ontmoeting met specifieke receptoren op leukocyten leidt tot de expressie of conformatieveranderingen van leukocyt integrinen, zoals LFA-1 (lymfocyt functie-geassocieerde antigen 1) en VLA-4 (zeer laat antigeen-4). De integrines bemiddelen een stevige hechting door binding hun endotheliale tegenreceptoren, bijvoorbeeld VCAM-I (vasculaire celadhesiemolecuul), ICAM-I (intercellulaire adhesie molecuul), waardoor de transmigratie in de hersenen parenchym tussen of over BMECs van de BBB ^12-14. Deze en andere bevindingen onderstrepen de actieve rol van het endotheel zich in het reguleren van het immuunsysteem cel migratie.

Bovendien BMECs als onderdeel van de NVU zijn betrokken bij de regulatie van de bloedtoevoer naar de hersenen linked lokale neuronale metabole eisen. Bij astrocytaire stimulatie endotheliale cellen vasoactieve stoffen zoals stikstofoxide waardoor relaxatie van vasculaire gladde spiercellen ^15.

Angiogenese en neurogenese in de ontwikkeling en in het volwassen hersenshow parallelle patronen en ontwikkeling en hebben veel eigenschappen van voorschrift ^{1, 4.} Endotheelcellen kritieke rol in deze processen ^{16, 17.}

Samenvattend BMECs essentiële elementen om ontwikkeling en werking van het CZS rechtvaardigen. BBB disfunctie is verbonden met vele ernstige neurologische aandoeningen. Echter, slechts een gering aantal targets geïdentificeerd in de hersenen-vaatstelsel interface voor een specifieke en efficiënte behandeling ^18. Vereenvoudigde in vitro modellen gebruikt om de betrokken functie en regulering van complexe fysiologische systemen voor lo mechanismen te begrijpenng tijd. De isolatie zoals beschreven door dit manuscript en het in vitro onderzoek van muizen BMECs, gezien de grote verscheidenheid van specifieke knockout muizen-stammen, kan een verder begrip van BBB functie en regulatie verschaffen onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden openen van nieuwe therapeutische middelen.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten ("LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW; Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Duitsland") en uitgevoerd volgens de Duitse wet van de dierenbescherming.

1. Algemene opmerkingen voor Mouse Experimenten

1. Voer alle experimenten met muizen in overeenstemming met de richtlijnen van de respectievelijke Institutional Animal Care en gebruik Comite.
2. Houd de muizen onder-pathogeen-vrije omstandigheden en hen in staat stellen om de toegang tot voedsel en water ad libitum te hebben.
3. Gebruik voor leeftijd en geslacht gematchte muizen in de experimentele groepen, omdat biologische eigenschappen kunnen variëren met leeftijd en geslacht.
4. Waar mogelijk proberen te verminderen, verfijnen of vervangen dierproeven.

2. Voorbereiding van de Percoll Gradient

1. Meng 19 ml 1X PBS met 1 ml 10x PBS, 1 ml FCS en 10 ml Percoll.
2. Voer steRILE filtratie in een glazen buis (diameter filter poriën: 0,2 urn). Daarna de oplossing bij 4 ° C opgeslagen.

3. Bereiding van endotheel celmedium en Coating van celkweekplaten

1. Endotheelcellen medium:
   1. Bereiding van 500 ml medium: (. Ongeveer 20%) Meng 400 ml DMEM medium (. Ongeveer 80%) met 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml; circa 0,05%), 0,5 ml heparine (100 pl / ml,. ongeveer 0,1%) en 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml,. ongeveer 0,1%). Voeg pyrumycin alleen celkweekmedium in de eerste 2 dagen kweken.
   2. Voer steriele filtratie in een glazen buis (diameter filter poriën: 0,2 urn). Daarna de oplossing bij 4 ° C opgeslagen.
2. Coating van celkweek platen:
   1. 1 ml van coating opgelost, een oplossing van 500 pl DDH ₂ O, 400 ul collageen IV (0,4 mg / ml) en 100 gl fibronectine (0,1 mg / ml).
   2. Bedek het hele oppervlak van each goed van de celkweek plaat met de coating oplossing. Bewaar de plaat staan ​​bij 4 ° C gedurende de nacht.

4. Isolatie van Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen (MBMEC)

1. Offer 10 volwassen muizen (8-12 weken oud, C57BL / 6) door cervicale dislocatie. Daarna isoleren de muis-hersenen en opslaan in 5 ml PBS (Waarschuwing: Werk steriel).
2. Verwijderen hersenen stengels, cerebella en Thalami met een pincet. Los hersenvliezen door voorzichtig het rollen van de hersenen op een steriele vloeipapier. Verzamel de overgebleven hersenvliezen-vrije voorhersenen.
3. Breng de hersenen om een ​​50 ml Falcon buis gevuld met 13,5 ml van DMEM.
4. Hak het weefsel eerst met een pipet 25 ml, vervolgens met een pipet 10 ml, totdat de media wordt melkachtig.
5. Verteren dan het weefsel met een mengsel van 0,6 ml collagenase CLS2 (10 mg / ml in DMEM) en 0,2 ml DNAse (1 mg / ml in PBS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gedurende 1 uur bij 37 ° C op een orbitale schuddenr 180 rpm.
6. Voeg 10 ml DMEM toegevoegd aan de weefselsuspensie en centrifugeer de cellen bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
7. Weggooien supernatant (Waarschuwing:! Pellet wordt makkelijk kwijt te raken)
8. De myeline verwijderen, resuspendeer de pellet met een pipet 25 ml in 25 ml van BSA-DMEM (20% w / v) (ong. 25 keer) en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
9. Gooi de bovenste myelinelaag (melkachtig) met een gebroken glazen Pasteur pipet met grotere diameter, en vervolgens de BSA laag met een normale Pasteur pipet ontdoen.
10. Resuspendeer de pellet in 9 ml DMEM en voeg 1 ml collagenase / dispase (eindconcentratie 1 mg / ml) en 0,1 ml DNAse. Digest de oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C op een orbitale schudder bij 180 rpm (waarschuwing: geen pipet om resuspenderen - cellen verloren).
11. Tijdens de vertering wordt gecentrifugeerd Percoll oplossing om de dichtheidsgradiënt met een ultracentrifuge bij 3000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C, met versnelling, without rem.
12. Voeg 10 ml van DMEM aan de geknipte celsuspensie. Centrifugeer de suspensie bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi dan het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml DMEM.
13. Voeg de geresuspendeerde cellen voorzichtig op de Percoll gradiënt en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C zonder versnelling en rem. Opmerking: De cellen zijn zichtbaar als een wolk in de interfase.
14. Neem ca. 12 ml van de interfase met cellen met een lange steriele naald en plaats deze in een nieuwe 50 ml Falcon met 5 ml van DMEM.
15. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Daarna resuspendeer de pellet in endotheelcellen medium (gebruik ong. 0,2 ml medium per 1 ^cm2 oppervlak van celkweekplaat).
16. Verwijder coating oplossing uit gecoate celcultuur platen (zie stap 3.2) en spoel elke goed met steriele PBS in twee opeenvolgende stappen wassen.
17. Handhaaf celculturen in endothelialecelmedium bij 37 ° C en 5% _CO2 in een steriele incubator. Verander het medium elke twee tot drie dagen. Split cellen 90% samenvloeiing.

Resultaten

Onmiddellijk na isolatie van muis BMECs en contaminerende cellen vormen conglomeraten drijvend in het celkweekmedium (Figuur 1A, dag 0). De behandeling met pyrumycin leidt tot een selectie van murine BMECs aangezien hoge niveaus van effluxtransporters zoals P-glycoproteïne leidt tot een relatieve resistentie tegen toxines. Contaminerende cellen veel gevoeliger voor cytotoxiciteit ¹⁹ pyrumycin. Tijdens het pyrumicin selectie contaminerende cellen binnen apoptotische of necrotische celdood, terwijl MBMECs gaan hechten aan het collageen IV / fibronectine gecoate celcultuur platen (Figuur 1A, dag 1 en dag 2). Tot dag 5, de MBMECs prolifereren tot een dichtheid van circa. 80-90%. Kenmerkend is de typische spoelvormige uiterlijk. Bij samenvloeiing, vormen ze een monolaag van samengeperst longitudinaal uitgelijnd en niet-overlappende contact geremde cellen (Figuur 1A, dag 5). Doorpyrumicin keuze, een hoge zuiverheid tot 99% MBMEC bereikt zoals blijkt uit de endotheelcellen marker CD31 (PECAM1 Figuur 1B). De MBMECs vormen strak verzegelde monolagen verbonden door tight junction eiwitten. Na 7-8 dagen kweken, de endotheelcel lagen opgebouwd stabiele waarden voor elektrische weerstand (tot specifieke waarden tussen 20 - 30 Ω cm x _^2). En capaciteit (figuur 1C) Op dit tijdpunt functionele assays zoals cel- migratie experimenten ^{3, 20,21} en permeabiliteit testen, bijvoorbeeld met Evans blauw of dextran, moet worden uitgevoerd.

Figuur 1. Morfologische en functionele eigenschappen van Muriene BMECs. (A) Vertegenwoordiger tijdsverloop van gekweekte BMECs bekeken door transmissie licht microscopie over 5 dagen. Schaalbalk geldt voor alle beelden. (B) Immunofluorescentiekleuring de endotheliale merker CD31 op dag 5. CD31 (groen) en DAPI (blauw). (C) cellen werden voorgekweekt gedurende 5 dagen en vervolgens overgebracht naar een geautomatiseerd systeem voor analyse van de biofysische eigenschappen (weerstand en capaciteit). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Bloed-hersen-barrière disfunctie is een kenmerk van diverse schadelijke CNS ziekten, bijvoorbeeld een uitsplitsing van de BBB bij multiple sclerose faciliteert uitvoerig de CNS invasie door autoreactieve immuuncellen en maakt de ontmoeting en de vernietiging van oligodendrocyten. In ischemische beroerte de verstoring van de BBB en de daaropvolgende vorming van hersenoedeem zijn kritische factoren die secundaire infarct groei en de algehele overleving van de patiënten ⁶ beïnvloeden. Bovendien, door veranderingen van de BBB in afgelegen gebieden focale ischemische letsels zijn in staat om op grote schaal functionele veranderingen in de hersenen veroorzaken. De onderliggende moleculaire mechanismen grotendeels onbekend ^5. In tegenstelling, de hoge dichtheid en diversiteit van transporters in functionele BMECs vermindert de concentratie van heilzame geneesmiddelen zoals chemotherapeutische middelen voor de hersenen maligniteiten of antibiotica infectieziekten. Daarom is een dieper begrip van de bloed-hersen-barrier functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden moet farmacologische middelen die in staat zijn specifiek de barrièrefunctie van de favoriete richting ²¹ te ontwikkelen. Betrouwbaar in vitro modellen van de BBB zijn onmisbare hulpmiddelen voor de regulerende mechanismen op BBB bestuderen.

Vele geïmmortaliseerde hersenen endotheliale cellijnen werden bepaald en gebruikt als in vitro modellen BBB ^22. Deze cellijnen bieden bepaalde voordelen ten opzichte van de primaire BMECs omdat ze sneller groeien en houden bepaalde BBB kenmerken over verschillende passages. Echter, endotheliale cellijnen niet volledig vervangen primaire cellen als belangrijkste eigenschappen zijn veranderd vermengen met de overdraagbaarheid van experimentele bevindingen aan de in vivo situatie. Bijvoorbeeld, het murine hersenen endotheelcellijn bEnd.5 expressie slechts lage niveaus van discontinu verdeelde tight junction eiwitten leidt tot hoge Paracellular permeabiliteit ^23. BEnd.3, een andere vaak gebruikte muizen hersenen endotheelcellijn, demonstreert dicht en continu verdeeld krappe kruispunten, een hoge transendothele weerstand, diverse transporters en lage paracellulaire permeabiliteit. Echter, bEnd.3 cellagen opzichte primaire BMECs missen een echte discriminatie bij de permeatie van bepaalde transcellulaire en paracellulaire substraten ^24.

In de voorbereidingen van primaire celculturen kunnen besmetten cellen significant interfereren met de validiteit van experimentele bevindingen. In het beschreven protocol, wordt pyrumicin als selectiemiddel voor endotheelcellen hoge zuiverheid te bereiken. Niettemin wordt een regelmatige kwaliteitscontrole van de celkweek onvermijdelijk ter garantie voor een betrouwbare experimenten. Er zijn verschillende methoden voor de kwaliteitscontrole, naast typische morfologische eigenschappen van endotheelcellen (zie figuur 1A), de transendothelial weerstand kan worden gemeten of de expressie van endotheelcel merker zoals CD31 (zie figuur 1B) of von Willebrand factor (vWF) kan worden geëvalueerd.

Het aantal brein endotheelcellen geïsoleerd van muizenhersenen relatief laag en om een ​​goede celkweek voor meerdere experimenten, de hersenen van verschillende muizen worden samengevoegd. In onze ervaring hebben minstens 10 muizen worden gebruikt voor een experiment dat een beperkende factor kan zijn afhankelijk van de middelen van het betreffende dier faciliteit. Om vertekening en verstorende factoren te vermijden, mag alleen muizen met een identieke genetische achtergrond en omgevingsfactoren worden gebundeld. Daarentegen runderen en varkens hersenen endotheelcellen preparaten bieden een groot aantal brein endotheelcellen in één hersenen. Echter, naast de ongecompliceerde fokken en huisvesting, het brede en steeds groeiende repertoire van beschikbare transgene muizen renders primaire muizen BMECs als een ideaalmodel om bloed-hersen-barrière functie te bestuderen.

Enkele belangrijke bevindingen met betrekking tot de functies van de BBB en de onderliggende moleculaire mechanismen zijn afkomstig uit studies in 2D weefselkweeksystemen. Onlangs hebben 3D kweeksystemen ontwikkeld ^25, waarbij endotheelcellen in een collageen matrix waardoor zij lumen en buisvormige netwerken vormen geplaatst. Deze nieuwe celkweek systemen zorgen voor een nog nauwkeurigere weergave van vasculaire processen in het intacte organisme in vivo. De betrokkenheid van verdere cellen van de NVU in 3D celkweek systemen, zoals pericyten en astrocyten zou een revolutie op de in vitro bestuderen van de bloed-hersen-barrière-functie; eerste modellen zijn recentelijk ontwikkeld ^26.

Er zijn een aantal aanbevelingen voor het oplossen van problemen. Allereerst steriel werken is essentieel voor de kwaliteit van de endotheliale celkweek. Ten tweede moet pyrumycin alleen worden toegevoegd voor mobielegebruikte kweekmedium in de eerste 2 dagen van de cultuur, misschien langer toepassing leiden tot een verhoogde MBMEC celdood en lage kwaliteit barrièrefunctie. Ten derde moet het toegepast in dit protocol enzymen worden gebruikt en opgeslagen volgens de instructies van de fabrikant; anders hun functie zouden kunnen worden aangetast. Bovendien zou de coating van celkweek platen worden gewijzigd indien endotheelcellen niet hechten. Concentraties van fibronectine en collageen kan worden veranderd of andere matrixeiwitten kunnen worden toegevoegd aan de bekledingsoplossing. Ten slotte, leeftijd, geslacht, tijd van het jaar en de omgevingsomstandigheden binnen het dier faciliteit zijn belangrijke factoren die de kwaliteit van MBMEC isolatie en vergelijkbaarheid van experimenten zouden kunnen beïnvloeden. Er moet voor worden gezorgd dat de omstandigheden vergelijkbaar zijn tussen onafhankelijke experimenten.

De beschreven protocol moet worden beschouwd als een basis neuroimmunologische methode murine BMECs isoleren. De geïsoleerde cellen kunnen zijn used voor een breed scala van toepassingen in om meer informatie BBB functie, zoals migratie assays, gen- en eiwitexpressie studies, elektrofysiologische evaluaties of permeabiliteit experimenten krijgen. Zoals hierboven aangegeven kan 3D celculturen van BMECs nieuwe mogelijkheden om de complexe mechanismen betrokken bij de regulatie van de BBB in de context van de NVU onderzoek te verrichten. Daarom zal de isolatie van primaire endotheelcellen een waardevolle techniek op het gebied van BBB onderzoek in de toekomst blijven.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
bFGF	Peprotech	100-18B	Basic fibroblast growth factor
BSA	Sigma Aldrich	A9418	Bovine serum albumin
Collagenase CLS2	Worthington	LS004176	High relative level of protease activity
Collagenase-dispase	Roche	10269638001	Collagenase uit V. alginolyticus, Dispase uit B. polymyxa
Collagen IV	Sigma Aldrich	C0543	Van Engelbreth-Holm-Swarm muis-sarcoombeslagmembraan
DMEM	Sigma Aldrich	D5030	Verwarmen in 37 °C waterbad voor gebruik
DNAse	Sigma Aldrich	D4513	Desoxyribonuclease I uit runderpancreas
FCS	Sigma Aldrich	F6178	Foetaal kalfserum (ook wel foetaal bovien serum genoemd)
Heparine	Sigma Aldrich	H3393	Anticoagulans
PDS	First Link UK Ltd.	60-00-850	Plasma-afgeleid serum
Percoll	Sigma Aldrich	P1644	Verwarmen tot kamertemperatuur voor gebruik
Pyrumycine	Sigma Aldrich	P8833	Mag alleen worden gebruikt in de eerste 2 dagen van de kweek