Remote Limb Ischemische preconditionering: Een Neurobeschermende Technique in Knaagdieren

Summary

Remote ischemische preconditionering (RIP) is een werkwijze voor het conditioneren weefsels tegen schadelijke stress. We hebben een methode van remote ischemie vastgesteld op de achterste ledematen, door het opblazen van een bloeddrukmeter manchet voor 5-10 min. De neurobeschermende capaciteiten van RIP zijn aangetoond in een model van retinale degeneratie in knaagdieren.

Abstract

Subletale ischemie weefsels beschermt tegen latere, meer ernstige ischemie door opregulatie van endogene mechanismen in het aangetaste weefsel. Subletale ischemie is ook aangetoond dat beschermingsmechanismen upregulate afgelegen weefsels. Een korte periode van ischemie (5-10 min) in de achterste ledematen van zoogdieren induceert zelfbeschermende reacties in de hersenen, longen, hart en retina. Het effect is bekend als remote ischemische preconditionering (RIP). Het is een therapeutisch veelbelovende manier van bescherming van vitale organen, en is nu al onder de klinische proeven voor het hart en de hersenen verwondingen. Deze publicatie toont een gecontroleerde, minimaal invasieve werkwijze voor het maken van een ledemaat - speciaal de achterpoot van een rat - ischemische. Een bloeddrukmanchet ontwikkeld voor humane neonaten is verbonden met een handmatige sfygmomanometer en gebruikt om 160 mmHg druk uitoefent rond het bovenste gedeelte van de achterste ledematen. Een sonde ontworpen om huidtemperatuur sporen wordt gebruikt om te controleren ischemia, door registratie van de temperatuurdaling huid veroorzaakt door drukgeïnduceerde occlusie van de beenslagaders en de temperatuurstijging wat afgifte van de manchet volgt. Deze methode van TNO biedt bescherming aan de rat retina tegen fel licht veroorzaakte schade en degeneratie.

Introduction

De overleving van de meeste, zo niet alle weefsels in aanwezigheid van metabole stress kan worden verbeterd door voorafgaande conditionering met een periode van subletale ischemie ^1,2. Ischemische preconditionering (IP) in de praktijk is de blootstelling van weefsel subletale ischemie, voordat het weefsel ervaringen ernstiger stressoren, zoals een volgend ischemische schade. In diermodellen IP geeft opvallend bescherming aan de hersenen, retina, hart en longen ^3-6. Dienovereenkomstig, waarnemingen bij patiënten met een beroerte toonde een verband tussen de eerdere TIA's en een betere klinische resultaten ^7,8. IP beschermt ook retinale fotoreceptoren van niet-ischemische verwondingen ^9.

De effectiviteit van IP in diverse weefsels en letsels suggereert dat het activeren van een aangeboren mechanisme van celoverleving in alle weefsels. Ischemische preconditionering van het myocard is gesuggereerd om beschermende effecten door de upregulation hebbenhypoxie induceerbare factor (HIF), bij velen bekend metabole routes te reguleren door het vrijkomen van adenosine of door de opening van de mitochondriale ATP kaliumkanalen ^10,11. Adenosine afgifte en ATP kaliumkanalen zijn betrokken bij cerebrale ischemie maar onderzoek naar de neuroprotectieve mechanismen van ischemische conditionering tot nu toe gericht op modificaties van anti-excitotoxiciteit, anti-apoptotische en anti-inflammatoire pathways ^12,13. Algemeen begrip van het moleculaire proces van ischemische conditionering voor bescherming neuronen beperkt.

Remote ischemische voorconditionering pogingen conditioneren verre kritisch belangrijke organen (hart, hersenen, long) door het opwekken van ischemie minder kritische weefsels. Remote ischemische preconditionering (RIP) met behulp van de achterste ledematen is aangetoond neuroprotectieve in knaagdiermodellen van een beroerte ^14-17 te zijn. De werkwijze beschreven door ons een eenvoudige, betrouwbare en niet-invasieve protocol voor het induceren van TNO.

De overgrote meerderheid van RIP protocollen omvatten het achterste lidmaat, waarschijnlijk omdat de femorale slagader in het bovenste achterste ledematen gemakkelijk herkenbaar en toegankelijk voor chirurgische klem- en tourniquet toepassing. In ischemische ledematen invasieve studies voor het onderzoek van de hersenen en huidbescherming, ischemie geïnduceerd door het scheiden van de femorale slagader van de lies ligamenten en klemmend de femorale arterie ^2,15,18.

De ischemie die uit een ledemaat cuffing of femorale slagader klemming is bevestigd door veranderingen op het onderdeel inclusief een verlies van puls afname oxygenatie en een daling van de huidtemperatuur. Remote ischemie kan worden bevestigd door het verlies van puls met laser Doppler of Doppler ultrasound ^17-19. Huidtemperatuur kan worden gebruikt als alternatief voor Doppler hoewel de relatie niet lineair ^20,21. Accurate temperatuur opnames zijn gemeengoed in laboratoria en blikgemakkelijk opgenomen in remote ischemische studies.

Een alternatief voor femorale vastklemmen operatie is de inductie van ischemie met een tourniquet. Tourniquet toepassing produceert vergelijkbaar ischemie is aan dat van vaartuig klemmen; Kutchner et al. vergeleken invasieve femorale arterie klemmen met een niet-invasieve tourniquet en vonden werkwijzen onderbroken bloedtoevoer naar de ledematen en verminderde huidbeschadiging in een plastische chirurgie model van ischemie huidflap ^18. Cuffing hetzij een been of arm en verhogen van de manchetdruk boven de systolische bloeddruk is gevonden beschermde tegen ischemische schade bij varkens en mensen ^17,19,22 te zijn.

Verschillende tourniquet zal remote-inducerende ischemische omvatten het gebruik van een bloeddrukmanchet of een elastische band ^17,22,23. Het gebruik van een elastische band ischemie induceren een onveilige methode mogelijk die tot een ongereguleerde hoeveelheid druk in deledematen, met de druk stijgt boven de 500 mmHg wordt opgenomen bij de mens ^24. Verder ischemie middels een elastische band leidt tot spierbeschadiging in ratten na verwijdering van de band ^23, zoals beoordeeld door Evans Blue Dye, een in vivo marker van myofiber permeabiliteit ^25. Daarentegen kan de afgifte van een geregelde druk aan de tourniquet worden bereikt met behulp van een bloeddrukmanchet verbonden met een sphygmomanometer ^17,19,22,26.

In deze studie werd een lichte letselmodel van fotoreceptor degeneratie werd gebruikt voor het neuroprotectieve effect van externe ischemische preconditionering tonen. Remote ischemie werd onmiddellijk opgewekt voor lichte verwondingen, zodat de daaropvolgende fotoreceptor degeneratie zoals bevestigd door retinale functie testen. De bijbehorende video zal de toepassing van niet-invasieve remote ischemie aangetoond.

Protocol

Ethiek statement: Het protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Sydney, AEC # 5657. Verdoving werd goedgekeurd door dier ethische commissie (Universiteit van Sydney, AEC # 5657).

1. apparatuur Voorbereiding

1. Met real-time huidtemperatuur tracking. Schakel op de computer, en de data-acquisitie hardware.
2. Open temperatuur opname-software en de temperatuur instelling om tussen de 30-35 ° C en de frequentie van de bemonstering op elke 100 msec te passen.
3. Optioneel: Insert rectale thermometer om de kerntemperatuur te garanderen blijft stabiel op 37,5 ° C.

2. De kalibratie van de handleiding Sphygmomanometer

1. Sluit neonatale manchet tot een grootte 2 manchet voor een 250-550 g rat sphygmomanometer.Use. Een adapter kan nodig zijn om de manchetslang sluiten op de sphygmomanometer.
2. Leeglopen van de manchet door een van beide het losdraaien van de ontluchtingsventiel of het loskoppelen van de manchet slang van de aan te passenof. Zorg ervoor dat er geen druk blijft in de slang en de manometer naald rust op nul in de ovale / rechthoek.
3. Controleer de druk tussen slangen, manometer en manchet. Blaas de manchet met zachte pompen van de inflatie lamp totdat het leest 100 mmHg op de manometer. Zorg ervoor dat de druk constant blijft. Leeglopen van de manchet door langzaam openen van de lucht vrijkomen waarde.

3. Animal Voorbereiding

Let op: dieren die aan het licht letsel ondergaan vereisen donkere aanpassing van de avond voor remote ischemie. Dieren die een lichte schade nodig donker opfok (12 uur licht: donker cyclus (5 lux))

1. Voer remote ischemie in ofwel wakker of verdoofd knaagdieren. Zorg ervoor dat dieren een gezonde spierspanning. Zorg ervoor dat dit door het knijpen de bovenste achterste ledematen om te bevestigen dat er voldoende spier aanwezig. RIP-geïnduceerde bescherming tegen lichte verwondingen is getest in sedentaire ratten tot 6 maanden oud.
2. Verdoofd voorbereiding voor RIP
   1. Injecteer ratten een intraperitoneale injectie van 60 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine. Controleer de diepte van anesthesie door uitbreiding van het been en het afklemmen van de huid aan de onderzijde van de voet. Het dier heeft geen reflex als het diep is verdoofd. Pas kunstmatige tranen om hoornvlies droog terwijl onder narcose te voorkomen.
   2. Plaats ratten op ofwel een warmte-pad of circulerende boiler slang aan op een constante lichaamstemperatuur van 37,5 ° C te houden. Plaats de rat in buikligging met de onderste ledematen 'voetzolen naar boven. Ofwel de rechter of linker ledematen kunnen remote ischemie ondergaan.
3. Awake voorbereiding RIP
   Opmerking: Wakker dierproeven vereist twee personen. Een persoon weerhoudt het dier en de tweede persoon werkt de handmatige bloeddrukmeter. De onderzoekers moeten vertrouwen om de procedure uit te voeren als terughoudendheid verhoogt het risico op verwonding van de verzorgers zijn. De ratten ondergingen afstand ischemie worden geconditioneerd to handleiding terughoudendheid. Afhankelijk intuïtieve richtlijnenboek beperking zou voortgang van 30 sec tot maximaal 5 min gedurende een aantal weken. Timide dieren die niet om te acclimatiseren op handmatig terughoudendheid moeten van wakker experimenten worden uitgesloten. Tenslotte handmatige beperking waarschijnlijk stress (en mogelijk verwart de studie voeren) voor dieren en een sham cohort (plaatsing van manchet zonder ontsteking) veroorzaken worden gebruikt om RIP studieresultaten te interpreteren.
   1. Snijd een handdoek in een 15 cm x 30-50 cm stuk en plaats de korte zijde loodrecht op rug van de rat, die het hoofd naar de top van de achterpoten.
   2. Plooi de korte zijde onder de romp van de rat stevig en beginnen om de rat wrap met de resterende lange zijde van handdoek. Bevestig de verpakte dier onder de arm in rugligging. Als de rat wordt gehouden onder de linkerarm, bevrijden van de rat juiste ledematen van de handdoek.

4. Toepassing of huidtemperatuursonde

1. Verleng de poot van de rat die ischemie ondergaan en plaats de huid sonde op de voetzool. Plaats de huid probe om contact tussen de temperatuur sonde en de huid te maximaliseren. Duw de sonde in de voetzool en brengen zij de sonde met papier tape.
2. Controleer de huid probe plaatsing door het bijhouden van de temperatuur van de temperatuur opname software. Zorg ervoor dat de temperatuur van de huid is tussen 30-34 ° C en blijft stabiel. Volg de temperatuur van de huid voor 1-2 min. Pas de huidsensor bij temperaturen onstabiel of beneden 30 ° C.

5. Remote ischemie

1. Leeglopen van de manchet en zorgen voor de luchtdruk gesloten is. Verleng de been en losjes omringen de manchet op de bovenste achterste ledematen. Gebruik de wijsvinger en duim aan het been en de lagere cijfers uit te breiden tot de losgemaakte manchet in positie te houden.
2. Verhoog manchetdruk het verdoofd dier tot 160 mmHg, en in wakkere dieren Increase de manchetdruk naar 180 mmHg.
   Opmerking: De verdoofd bloeddruk van ratten varieert 120-140 mmHg en stijgt tot 160 mmHg bij bewustzijn. Begin van de timer en de voet temperatuur opnames zodra de juiste druk is bereikt.
   Opmerking: De voet temperatuur moet dalen met 2 ° C na 5 min van constante druk.
3. Handhaven positie van de manchet boven het dier "knee" gehele ischemie. Manchetdruk zal beginnen te dalen na enkele minuten, of als onderdeel van de rat beweegt.
4. Herhaaldelijk pomp de inflatie lamp in korte uitbarstingen tot de gewenste manchetdruk herhaalde korte uitbarsting van pompen te behouden
5. Remote ischemie kan continu tussen 5 en 15 min worden toegezonden. De ischemie-reperfusie protocol bevat 2 periodes van 5 min ischemie met een tussenliggende 5 min reperfusie.
6. Leeglopen van de manchet druk door de luchtdruk ventiel los te draaien. Controleer de temperatuurverandering in de loop van de ischemie proprotocol. Laat de manchet.
7. Ga verder met letsel experimenteren. Animals onder invloed van anesthesie dient een warmte pad worden geplaatst. Doorgaan met dieren controleren totdat ambulante. Dieren kunnen niet worden teruggestuurd naar behuizing tot wandelen.

6. Licht Schade - retinale degeneratie Model

1. Dark passen de dieren 's nachts (12-15 uur). Onmiddellijk na remote ischemie conditionering of sham remote ischemie (dier terughoudendheid) plaats dieren in perspex behuizing met voedsel en water.
2. Schakel de TL-verlichting (1000 lux) zich boven Perspex woningen tegen 09:00 gedurende 24 uur. Na blootstelling aan licht, de terugkeer van de dieren aan cyclische verlichting dimmen voor 7 dagen.

7. Post-remote Ischemia Procedures

1. Vision assessment met electroretinogram (ERG):
   Opmerking: De ERG set-up en flash protocol gevolgd Brandli en Stone ^26.
   1. Dark passen dieren 's nachts (12-15 uur). Ondergedimd rode verlichting verdoven dieren door intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine (60 mg / kg en 5 mg / kg, respectievelijk). Mydriatische (atropinesulfaat 1,0%), corneale anesthetische (proxymetacaïne 0,5%).
   2. Breng corneale hydratatie (Carbomer polymeer) oogdruppels direct op de cornea. Breng ooggel op 20 min tussenpozen hoornvlies hydratatie te behouden.
   3. Teken een losjes gebonden draad rond de oogbol om stabiele ERG opnames helpen. Monitor temperatuur met een rectale sonde en handhaven lichaamstemperatuur dier bij 37-37,5 ° C.
   4. Plaats de kop in een Ganzfeld bolfotometer.
      Opmerking: De Ganzfeld is een volledig programmeerbaar lichte prikkel die uniform whit flitsen levert van LEDs voor het oog.
   5. Noteer de electroretinogram behulp van een op maat gemaakte 4 mm platina positieve elektrode lichtjes het hoornvlies aan te raken en een 2 mm diameter Ag / AgCl pellet elektrode ingebracht in de mond. Referentie beide elektroden aan een roestvrij stalen naaldsubcutaan ingebracht in de romp.
   6. Record signalen banddoorlaat- instelling van 0.3-1,000 Hz (-3 dB), met een 2 kHz overname tarief (AD Instruments). Na een stabiele ERG opname vastgesteld onder het dier aan een 10 min aanpassing aan het donker alvorens opnamen.
   7. Volg het flash protocol zoals eerder beschreven door Brandli en Stone ^26.
      1. Programmeer de duur van de flitser (we gebruikt knippert 1-2 msec duur), en stel de intensiteit -4,4 tot 2,0 log scot cd.sm ^-2. Gebruik heldere flitsen (2,0 log scot cd.sm ^-2, 1 ms) aan het netvlies functie te meten. In deze studie is de vergelijking tussen controle, licht letsel en licht letsel met RIP.

8. TUNEL Assay

1. Euthanaseren dieren door intraperitoneale injectie van fenobarbital overdosis (100 mg / kg). Ophelderen van de ogen en lossen in 4% paraformaldehyde.
2. Was de ogen in PBS vóór cyroprotectingogen 's nachts in sucrose 30% (w / v). Insluiten de ogen in OCT verbinding en gesneden in 20 urn sagittale secties met behulp van een cryostaat.
3. Voer de TUNEL test op het netvlies secties met DAPI kleuring volgens het protocol van Maslim et al. ²⁷
4. Gebruik fluorescentiemicroscopie voor TUNEL tellingen van het netvlies. TUNEL cellen werden geregistreerd van de buitenste nucleaire laag (ONL); de buitenste laag van het netvlies die fotoreceptorcellen kernen bevat. In deze studie werden TUNEL tellingen in drievoud voor elk oog, met 5 ogen voor elke behandelingsgroep.
5. Gebruik one-way ANOVA statistische vergelijking groep betekent controle, licht letsel en lichte verwondingen + RIP ratten.

Results

Een bloeddrukmanchet verhoogd tot boven 160 mmHg stopt de bloedstroom naar de achterste ledematen zoals duidelijk te zien in figuur 1B. Het ontbreken van weefseloxygenatie resulteerde in een reducerende temperatuur van de voeten van het dier voor ischemie-reperfusie protocol (Figuur 2). De voet temperatuur (33 ° C) lager dan de eigen temperatuur en betrouwbaar verlaagd gedurende manchetdruk elevatie (31 ° C) stijgt wanneer de manchet is leeggelopen (32 ° C). Een enkele 1.000 lux licht l...

Discussion

Knaagdier achterpoot ischemie werd geïnduceerd met succes een manuele bloeddrukmeter en manchet levert neuroprotectie de fotoreceptoren van de retina. Een bevinding consistent met ischemische conditioning geïnduceerde bescherming van de fotoreceptoren van licht letsel ^9,28.

In wezen, remote ischemie veroorzaakt korte zuurstoftekort aan weefsels. Derhalve remote ischemische voorconditionering veel overeenkomsten ischemische conditioneren of als alternatief genoemd ischemische toler...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer	Welch Allyn	DS56	Handmatig sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack	Welch Allyn	5082-102-1	Lijmblok
Luer lock adaptor	Welch Allyn	5082-178	Adapter voor neonatale blok
Thermistor pod	AD Instruments	ML 309	Huidtemperatuur unit
Skin temperture probe	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Towel			optioneel: ontwaken remote ischemie
Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)	Abbot Animal Health	05260-05	optioneel: inhalatieanesthesie remote ischemie
Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		optioneel: injecteerbaar anesthesie remote ischemie
Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)	Troy Laboratories Pty Ltd		optioneel: injecteerbaar anesthesie remote ischemie