Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Samenvatting

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Samenvatting

Er is geen genezing ontdekt voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van zichtverlies bij mensen ouder dan 55 jaar. AMD is een complexe multifactoriële ziekte met een onbekende etiologie, hoewel men grotendeels denkt dat het optreedt als gevolg van de dood of disfunctie van het retinale pigmentepitheel (RPE), een monolaag van cellen die onder de retina ligt en kritische ondersteuning biedt voor fotoreceptoren. RPE-celvervangende strategieën kunnen veelbelovend zijn voor het bieden van therapeutische verlichting voor een groot deel van AMD-patiënten, en RPE-cellen die sterk lijken op primaire menselijke cellen (hRPE) zijn in meerdere onafhankelijke laboratoria gegenereerd, inclusief de onze. Bovendien zijn de toepassingen voor iPS-RPE niet beperkt tot cel-gebaseerde therapieën, maar zijn ook gebruikt om RPE-ziekten te modelleren. Deze soorten studies kunnen niet alleen de moleculaire basis van de ziekten verduidelijken, maar ook dienen als onschatbare hulpmiddelen voor het ontwikkelen en testen van nieuwe medicijnen. We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol voor gerichte differentiatie van RPE uit stamcellen. Het toevoegen van nicotinamide en ofwel Activin A of IDE-1, een klein molecuul dat de effecten ervan nabootst, op specifieke tijdstippen, verbetert de opbrengst van RPE-cellen aanzienlijk. Met deze techniek kunnen we in slechts drie maanden grote aantallen RPE met lage passage verkrijgen.

Inleiding

De verschillende celtypen die de retina bezetten, zijn georganiseerd in een functionele architectuur. De fotoreceptoren aan de achterkant van de retina zijn verantwoordelijk voor het omzetten van licht in elektrische impulsen door middel van fototransductie. Fototransductie kan echter niet plaatsvinden zonder de gecoördineerde inspanningen van andere aangrenzende celtypen, inclusief Mueller-glia en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. Een monolaag RPE-cellen scheidt de sensorische retina van de choriocapillaris, de primaire bloedtoevoer voor fotoreceptoren, en is ideaal gelegen om meerdere functies te controleren die belangrijk zijn voor de homeostase van fotoreceptoren. In feite zijn de RPE en fotoreceptoren zo onderling afhankelijk dat ze algemeen worden beschouwd als één functioneel geheel. (Voor een overzicht van alle diverse functies van de RPE, zie Strauss, 2005¹.) Dood of disfunctie van retinale pigmentepitheelcellen kan leidt tot leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van permanent verlies van gezichtsvermogen in geïndustrialiseerde landen^2-4.

AMD is een multifactoriële ziekte van RPE, fotoreceptoren en de choroïdale vaatwand; risicofactoren zijn divers en omvatten combinaties van omgevings- en genetische invloeden^5,6. Behandelingen voor AMD zijn zeer beperkt, maar een veelbelovende potentiële therapie is RPE-celvervanging^7,8. Hoewel de resultaten wisselend zijn, heeft de transplantatie van RPE-cellen bij AMD-patiënten (en bij andere patiënten met retinale degeneratie) en ook bij knaagdiermodellen van retinale degeneratie, het potentieel om significante fotoreceptoratrofie tijdelijk te voorkomen^9-23. (Het diermodel dat vaak wordt gebruikt voor deze studies zijn Royal College of Surgeons (RCS) ratten, die een mutatie in het MerTK-gen hebben. Deze mutatie maakt RPE-cellen niet in staat om fotoreceptoruitersten te fagocyteren en bevordert retinale degeneratie²⁴.) Hoewel de gerapporteerde overlevingspercentages van geïmplanteerde RPE in de subretinale ruimte van RCS ratten en muizen sterk variëren, is er potentieel voor het overleven van enkele maanden tot jaren^9,10,12,20.

RPE-cellen kunnen in voldoende aantallen worden verkregen voor transplantatie door ze te verkrijgen uit pluripotente stamcellen^9-14,25-28. Verschillende onafhankelijke groepen hebben aangetoond dat deze cellen op soortgelijke wijze functioneren als hun somatische tegenhangers, en langetermijnstudies suggereren dat ze veilig zijn bij implantatie in rat- en muisziektemodellen^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}. Het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen in plaats van embryonale stamcellen kan voordelig zijn, aangezien ethische kwesties en immunologische uitdagingen geassocieerd met allogene RPE kunnen worden vermeden^33,34. Een andere spannende toepassing voor iPS-technologie is ziektemodellering³⁵. Het vermogen om grote aantallen RPE-cellen afkomstig van patiënten met RPE-ziekten te ondervragen, zou onschatbaar zijn voor het begrijpen van hun moleculaire basis. Dit type studie is onlangs uitgevoerd met RPE van patiënten met de ziekte van Best en zou de weg kunnen wijzen voor soortgelijke studies van erfelijke maculopathieën³⁶.

De afkomst van RPE uit stamcellen is een relatief eenvoudig proces en kan volledig worden uitgevoerd onder xeno-vrije omstandigheden. De eenvoudigste strategie is om monolagen van RPE-cellen spontaan te verkrijgen, maar het rendement kan aanzienlijk worden verbeterd met behulp van gerichte differentiatietechnieken. Maar deze technieken omvatten het gebruik van exogene eiwitfactoren die duur kunnen zijn en vaak worden gegenereerd in bacteriën of andere niet-menselijke bronnen^10,12,37. In onze studies volgden we een gevestigd protocol¹⁰ dat nicotinamide en Activin A gebruikt, een signaalfactor waarvan is aangetoond dat het voldoende is voor RPE-specificatie³⁸. Hier zullen we aantonen dat het kleine molecuul IDE-1 Activin A adequaat kan vervangen, waardoor de kosten worden verlaagd en zorgen over het gebruik van recombinante eiwitten worden weggenomen³⁹. Bovendien gebruiken we xeno-vrije serumvervanging en kweken we de differentiërende RPE-cellen op een synthetisch xeno-vrij substraat. RPE-cellen zijn eerder aangetoond dat ze zeer effectief differentiëren met behulp van deze aanpak⁴⁰.

Wanneer gedifferentieerd als een monolaag, visualiseren we gepigmenteerde kolonies met RPE-cellen al na vijf weken¹². Zodra ze voldoende groot zijn, kunnen ze handmatig worden uitgesneden en overgebracht naar een ander schaaltje voor expansie. RPE-cellen staan bekend om het dedifferentiëren met elke passage, en het gebruik van iets ouder dan vijf passages moet worden vermeden (we constateren dat voldoende aantallen cellen voor karakterisering en transplantatie in diermodellen gemakkelijk kunnen worden gegenereerd na twee of drie passages). Zodra ze volledig zijn gedifferentieerd, gebruiken we meerdere technieken om de cellen anatomisch en functioneel te karakteriseren om ervoor te zorgen dat ze dienen als adequate vervanging voor zieke RPE. De beschrijving van deze technieken en het protocol voor het implanteren van de iPS-RPE in de subretinale ruimte van knaagdieren, vallen buiten het bestek van dit methodenartikel en zijn eerder gepubliceerd^12,32,41.

Hoewel het ontwikkelen van gestandaardiseerde protocollen voor effectieve afleiding van iPS-RPE duidelijk belangrijk is voor de klinieken, is er ook significant preklinisch werk dat nog moet worden gedaan in diermodellen. Er zijn zorgen over de immunogeniciteit van iPS-afgeleide cellen en er worden meerdere verschillende implantatietechnieken onderzocht, inclusief het implanteren van cellen op kunstmatige substraten^42,43. Om deze redenen zijn we van mening dat de publicatie van gestandaardiseerde protocollen nuttig is om zowel klinische als preklinische studies te vergemakkelijken. Vooral als directe vergelijkingen worden gemaakt van iPS-RPE-cellen die in verschillende laboratoria door verschillende onderzoeks

Protocol

1. Geregisseerd Differentiatie van stamcellen afgeleide RPE

Opmerking: Alle incubatie stappen worden uitgevoerd bij 37 ° C in 5% _CO2

1. Handhaving van de HES of heupen lijnen (dagelijks voeden) in onderhoud media (MM; tabel 1). Zodra de lijnen voldoende kwaliteits- controle bereikt, houden ze op een laag van muis embryonale voedingscellen (MEF) geënt bij een dichtheid van 250.000 / putje van een zes puts plaat. Xeno-vrij kweken kunnen ook worden gegenereerd na het bij Tucker et al. ⁴⁰ protocol.
2. Laat de stamcellen kolonies tot samenvloeiing bereiken.
3. Schakelen naar differentiatie media met Nicotinezuuramide (DM / NIC; tabel 1); dagelijks voeden.
4. Na drie weken in de cultuur, over te schakelen naar differentiatie media met nicotinamide en ofwel Activin-A of IDE-1 (DM / NIC / AA of DM / NIC / IDE1; tabel 1) tot RPE differentiatie te verbeteren.
5. Na vijf weken in de cultuur, schakel terug naar DM / NIC. Dagelijkse voedingen niet langer nodig wanneer de pH indicatoren in de media stop geel worden de dag na de voeding.
6. Wacht op eilandjes van gepigmenteerde cellen te verschijnen die groot genoeg zijn om te worden gesneden en verwijderd (zie figuur 2D-F en 3A).

2. Isoleren Gepigmenteerde Eilandjes

1. Smeer de putjes van een 24-wells plaat met een matrix die de natuurlijke cel milieu (xeno-vrije voorkeur) nabootst.
   OPMERKING: Cornea messen en scherpe, fijne punt tang zijn zeer nuttig voor het plukken. Het hele vel van gedifferentieerde cellen kunnen los terwijl het oppakken. Dit voorkomen door zorgvuldig werken en aanvankelijk plukken kolonies in het midden van de schaal.
2. Vul zoveel putjes van de 24-well plaat met differentiatie medium (DM; tabel 1) nodig. Deze beslissing is afhankelijk van het aantal gepigmenteerde koloniesverzameld.
3. In een celkweek kap met een dissectie scope, handmatig uitgesneden gepigmenteerde eilandjes. Hak elk eilandje aan de onderkant van de originele plaat met behulp van een scalpel in ongeveer 2-6 stukken en pak de gepigmenteerde delen met scherpe tang.
4. Transfer 1-2 gepigmenteerde stukjes in elke 24-put.
5. Laat de media niet veranderen voor 3-5 dagen tot cellen hechten, dan beginnen veranderende media drie keer per week. (Als ze niet houden na deze tijd, de kans is groot dat ze nooit doen).
6. Expand cellen voor 3-4 weken differentiatie medium (DM; Tabel 1) - Een beeld van een typische kweek wordt getoond in figuur 3B. Cellen kunnen nog steeds niet vullen het gehele goed maar langer wachten lijkt niet te helpen. Voeden cellen drie keer per week.
7. Na ongeveer 3 weken, handmatig clusters van witte cellen te verwijderen in groepjes, indien nodig met scherpe tang. Voer deze stap niet tenzij dit noodzakelijk is - het is gemakkelijk om verontreinigingen te voeren. Het is ideaal omproberen om een ​​zo zuiver populaties van RPE in stap 1.6 te verkrijgen van de oorspronkelijke gepigmenteerde kolonies.

3. Passage stamcellen afgeleide RPE

1. Trek de cellen met 200 ul van een cel dissociatie oplossing (bij voorkeur geen trypsine-een reagens die kan worden geïnactiveerd door verdunning voorkeur) 5-8 minuten bij 37 ° C en inactiveren door verdunning met DM. Gebruik een 200 ul pipet te wassen alle cellen en hen opnieuw in suspensie (Als het goed gekozen bevat slechts een paar cellen, overweeg dan het bundelen van de cellen van twee 24-wells).
2. Centrifuge (800 g gedurende 5 min), gooi supernatant, en resuspendeer in 3 ml DM media.
3. Opnieuw plate cellen van één (of twee) 24-wells in een matrix beklede 6-well in 3 ml DM per putje (1: 5 expansie).
4. Openen voor 1-2 weken tot de cellen zijn ~ 90% samenvloeiing; een afbeelding van volledig gedifferentieerde zuivere kweek wordt getoond in figuur 3C.
5. Los cellen met 1 ml cel dissociation oplossing gedurende 5-8 minuten bij 37 ° C, inactiveren door verdunning met DM Gebruik 1000 ul pipet te wassen alle cellen en resuspendeer hen.
6. Spin down (800 g gedurende 5 min), gooi supernatant, en resuspendeer in 18 ml DM media.
7. Opnieuw plate cellen van een 6-wells elk in zes matrix beklede 6-putjes in 3 ml DM per putje (1: 6 expansie) of een beklede 75cm ² fles (1: 7.5 expansie).
8. Herhaal stap 3,4-3,8 nodig totdat voldoende cellen zijn verkregen.
   OPMERKING: Probeer zo veel kolonies mogelijk te maken voor uitbreiding te verzamelen in plaats van plan om de culturen te versterken via passage omdat elke passage induceert RPE dedifferentiation.

Resultaten

De stappen in dit manuscript, zoals in figuur 1, kan worden gebruikt om gemakkelijk genereren RPE uit stamcellen zoals eerder gemeld ^10,12. Na handhaven van de iPS lijnen enkele weken gepigmenteerde kolonies beginnen te verschijnen in de kolonies na 5-7 weken (7 weken oude kweken zijn weergegeven in Figuur 2A-C). Deze kolonies kunnen blijven groeien weken als de culturen blijven. Zodra bereiken voldoende afmetingen, zie figuur 2D-F (8 weken oude culturen), ku...

Discussie

In dit manuscript schetsen we de stappen om efficiënt genereren van grote aantallen pure iPS-RPE culturen. We hebben eerder aangegeven met dit gericht differentiatie protocol met Activin A dat we iPS-RPE die sterk lijken hRPE op basis van transcriptomics, proteomics, metabolomics en functionaliteit kan genereren, en dat ze vertragen retinale degeneratie wanneer geïmplanteerd in RCS ratten ^12,31,32 . Het maken van iPS-RPE is tijdrovend, maar niet bewerkelijk (figuur 1). Zodra de iPS kweken con...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Corneal knife	Surgipro	SPOI-070	mes x 1
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca of Mg	VWR	45000-434	500 ml x 6
Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0021	100 µg x 1
IDE-1	Stemgent	04-0026	2 mg x 1
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
Recombinant Human/Murine/Rat Activin A	PeproTech	120-14E	10 µg x 2
Synthemax-T Surface 6 Well Plates	Corning	3877	Case(12) x 1
TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red	Life Technologies	12604-021	500 ml x 1
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml	Corning	431475	Case(12) x 1