Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Samenvatting

We presenteren een protocol om primaire culturen van muis- en menselijke slokdarmstroomacellen met een myofibroblast-fenotype te genereren. De gekweekte cellen hebben een spindelvormige morfologie, drukken α-SMA en vimentin uit en missen epitheliale, hematopoëtische en endotheelcel-oppervlaktemarkers. Gekarakteriseerde stromacellen kunnen worden gebruikt in functionele studies van epitheel-stroma interacties.

Samenvatting

Muizen en menselijke slokdarm myofibroblasten worden gegenereerd via enzymatische afbraak. Neonaat (8-12 dagen oud) murine slokdarm wordt geoogst, fijngemaakt, gewassen en onderworpen aan enzymatische digestie met collagenase en dispase 25 min. Menselijke oesofageale resectiepreparaten ontdaan van muscularis propria en adventitia en de resterende mucosa wordt gehakt, en onderworpen aan enzymatische digestie met collagenase en dispase tot 6 uur. Gekweekte cellen brengen α-SMA en vimentine en uitdrukkelijke desmin zwak of helemaal niet. Kweekomstandigheden zijn niet bevorderlijk voor de groei van epitheliale, hematopoietische of endotheelcellen. Culture zuiverheid wordt verder bevestigd door flowcytometrische evaluatie celoppervlak marker expressie van potentieel verontreinigende hematopoietische en endotheelcellen. De beschreven techniek is eenvoudig en resulteert in consistente generatie niet-hematopoieitc, niet-endotheliale stromale cellen. Beperkingen van deze techniek zijn inherent aan het gebruik vanprimaire culturen in de moleculaire biologie studies, dat wil zeggen, de onvermijdelijke variatie aangetroffen onder in verschillende muizen of mensen gevestigde culturen. Primaire kweken zijn echter een meer representatieve afspiegeling van de in vivo toestand tegenover cellijnen. Deze werkwijzen geven ook onderzoekers de mogelijkheid het isoleren en kweken stromale cellen van verschillende klinische en experimentele omstandigheden, zodat vergelijkingen tussen groepen. Kenmerk slokdarm stromale cellen kunnen ook worden gebruikt in functionele studies die epitheliale-stromale interacties in slokdarm aandoeningen.

Inleiding

Epitheliale-stromale interacties zijn betrokken bij de regulatie van een verscheidenheid van het maagdarmkanaal functies, waaronder mucosale regeneratie, reparatie, fibrose, en carcinogenese ^1,2. Deze interacties zijn best bestudeerd in de dunne en dikke darm en kunnen eveneens een rol spelen bij slokdarmkanker mucosale stoornissen ³ spelen. Een subpopulatie van darm en colon stromale cellen genoemd myofibroblasten is aangetoond deelnemen bemiddelen weefselschade, inflammatie en reparatie ^4,5. In de distale maagdarmkanaal, worden deze spoelvormige cellen gelegen naast de basaalmembraan op het grensvlak tussen epitheel en lamina propria en gedefinieerd als α-SMA en vimentine positieve pan-cytokeratine negatief en zwak positief of negatief desmine ^5.

De slokdarm stroma is niet rigoureus gekarakteriseerd op cellulair of moleculair niveau. Ons werk in het muizen slokdarm heeft Demonstrated α-SMA en vimentine cellen in de slokdarm stroma, soms onderliggend aan het plaveiselepitheel ^6. Epitheliale-stromale interacties zijn betrokken bij oesofageale slijmvlies aandoeningen zoals gastro-oesofageale gemedieerde schade ⁶ en eosinofiele oesofagitis ^3. Fibrotische stricturen ook een bekende complicatie van oesofageale schade en stromale cellen zijn betrokken bij de pathogenese van gastro fibrose. Isolatie van deze cellen zal helpen bereiken van de nodige studies om gestoorde signaalwegen te onderzoeken.

Deze inzending geeft de technieken die nodig zijn om primaire culturen van α-SMA positief, vimentine positieve myofibroblasten zodanig dat de bestaande lacunes in de kennis over signaalwegen bemiddelen deze interacties kunnen worden gericht vast te stellen. De beschreven techniek werd met succes gebruikt door de auteurs primaire murine colon myofibroblasten ⁷ en furthe vaststellenr aangepast voor oprichting van muizen ⁶ en menselijke myofibroblast-achtige oesofageale stromale cellen.

Hierin beschrijven we condities die nodig is om en karakteriseren vastgesteld uit muizen of menselijke slokdarm voorafgaand aan gebruik in toekomstige functionele studies culturen. Culturen kunnen worden gekweekt en gebruikt voor maximaal 15 passages. Isolatie en oprichting van primaire culturen via de methoden die hieronder beschreven genereert stromale cellen met een myofibroblast fenotype; α-SMA, vimentine positief, en zwak positief of negatief voor desmine, en cytokeratine negatief. Dit fenotype verschilt van het fenotype van de slokdarm fibroblast dat overwegend vimentine positief, α-SMA negatief ³ of α-SMA positieve, vimentine negatief fenotype van de muscularis mucosae ^6.

Protocol

Het protocol voor dierproeven, de motivering en doelstellingen van het onderzoek uit te voeren, werden voorgelegd aan en goedgekeurd door de Universiteit van Zuid-Californië Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Het protocol voor de oprichting van primaire culturen van de-geïdentificeerde menselijke specimens slokdarmresectie werd goedgekeurd door de University of Southern California Institutional Review Board.

1. Vraag Muis of Human slokdarm

1. Verkrijgen Mouse Slokdarm:
   1. Euthanaseren de 8-12 dagen oude muis met 2% isofluraan inhalatie overdosis gevolgd door cervicale dislocatie.
   2. Speld het dier naar beneden met de buik naar boven en nat het ventrale oppervlak met 70% ethanol. Met een pincet, pak en til de huid juist voor de urethra opening met een pincet. Gebruik standaard rechtdoor chirurgische schaar langs de ventrale middellijn van de urethrale opening naar de kin te snijden. Wees voorzichtig om alleen de huid snijden.
   3. Een insnijding van de urethrale opening beneden de knie aan beide zijden van het dier, die een omgekeerde "Y". Maak een insnijding aan beide zijden van het dier langs de ribbenkast.
   4. Trek voorzichtig de huid aan beide zijden af ​​van de onderliggende buikvlies en de ribbenkast, en lag aan de zijkanten. Onderzoek de ribbenkast bovenop de borstholte en het peritoneum bovenop de buikholte.
      1. Til het buikvlies met een pincet en dwars door het aan het membraan en de ribbenkast, wijzend schaar omhoog om schade aan de abdominale inhoud te verhinderen. Til de linker kwab van de lever, de onderliggende maag, de slokdarm, maag overgang en het abdominale gedeelte van de slokdarm bloot.
   5. Gebruik geautoclaveerd chirurgische schaar door het borstbeen en ribben langs de middellijn naar de cervicale gordel te snijden. Point schaar omhoog om beschadiging van de thoracale inhoud te voorkomen. De inhoud van de volledig blootborstholte door aan de ribben aan de zijkanten.
   6. Verwijder voorzichtig het hart en de beide lobben van de longen. Overtollige bloed te absorberen met Q-tips. De thoracale slokdarm is een smalle flexibele buis liggend posterieur van de luchtpijp en de voorste naar de thoracale wervel.
      OPMERKING: De slokdarm kan moeilijk te identificeren in muizen pasgeborenen zijn. Lokalisatie van de slokdarm-maag overgang maakt slokdarmkanker identificatie eenvoudig.
   7. Volg zorgvuldig de slokdarm omhoog uit de maag, het ontleden van de omringende bloedvaten, vet en mesenterium helemaal tot aan de slokdarm oorsprong in de cervicale holte. Chirurgische schaar met stompe punt werken het beste voor dit doel.
   8. Resect de gehele lengte van de slokdarm en plaats in Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) voor verdere verwerking hierna beschreven. Verwijderen van een gedeelte van de maag ter oriëntatie indien gewenst.
      LET OP: Door kleine weefsel grootte, scheiding van muscularis propria van de gespierdemucosa is niet haalbaar in muriene neonaat slokdarm en de gehele slokdarm is een bewerking hieronder beschreven.
2. Verkrijgen Human Slokdarm:
   1. Was slokdarm resectiepreparaten (meestal 5 cm of minder) met HBSS en verwijder alle aangesloten bindweefsel, vet, of vaatstelsel.
   2. Resectie van een deel van het monster en plaats in formaline voor latere histologische onderzoek indien gewenst.
   3. Scheid de resterende slijmvlies van onderliggende muscularis propria door scherpe dissectie.
   4. Snijd slijmvlies in sub centimeter fragmenten en onderworpen aan de hieronder beschreven protocol.
      OPMERKING: Menselijke slokdarm resecties in PBS bewaard worden 6 uur voorafgaand aan de verwerking hieronder beschreven. Bron van slokdarmresectie exemplaren zal preparaatgrootte dicteren en zal het laboratorium afhankelijk zijn.

2. Isoleren van muis en mens Oesofageale stromale cellen

1. Isoleer oesofageale stromale cellen from murine en menselijke weefsel door een combinatie van mechanische en enzymatische digestie.
   1. Mechanisch verteren door hakken het weefsel met een schaar en meerdere wasbeurten met HBSS. Enzymatisch verteren door incuberen van het weefsel met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase 25 min (murine weefsel) of tot 6 uur (menselijk weefsel). Ervoor te zorgen dat instrumenten gebruikt voor hakken zijn geautoclaveerd en gesteriliseerd.
      OPMERKING: Collagenasen zijn enzymen die collageen, een extracellulaire matrix eiwit dat verantwoordelijk is voor het houden van dierlijk weefsel bij elkaar. Collagenase XI heeft hoge collagenase activiteit en heeft succes in dit isolement protocol gezien. Dispase is een bacterieel enzym met proteolytische milde dissociatie activiteit die celmembraan activiteit behoudt en wordt gebruikt in combinatie met collagenase als een secundair enzym.
   2. Plaats mucosale fragmenten respectievelijk verkregen uit muis of menselijk weefsel in 1,7 ml micro-centrifuge of 5 ml buizen, met HBSS. Mince weefsel verderin 2-3 mm stukken met een schaar met een open uiteinde breedte die past in de respectieve buizen. Voldoende tijd om voor slokdarm mucosale fragmenten sedimenteren op de bodem van de buis.
   3. Langzaam decanteren HBSS, dat evenwel niet tot het weefsel per ongeluk weggooien. Vervang met verse HBSS volgende door voorzichtig schudden. Als alternatief, verwijder HBSS met een pipet 1 ml.
   4. Was tissue op deze wijze totaal 8 keer onder zacht schudden tussen wasbeurten waardoor tijd slokdarm fragmenten sediment tussen elke wassing.
      OPMERKING: Human weefsel zal meer nodig hakken die pasgeborene muis weefsel.
2. Incubeer muizen weefsel met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase gedurende 25 min op een schommelende schudder ingesteld op een laag toerental bij kamertemperatuur.
   1. Incubeer lichaamsmateriaal met 300 U / ml collagenase XI en 0,1 mg / ml dispase tot 6 uur, op een schommelende schudder ingesteld op een laag toerental bij kamertemperatuur.
      NB: De beschikbaarheid van menselijke esophagus is variabel. Menselijke oesofageale slijmvlies geïncubeerd met enzymen voor 6 uur leidt tot succesvolle vorming van primaire kweken.
3. Na enzymatische digestie, gehakt weefsel verder met een schaar en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min.
4. Verwijder het supernatant. Breng de pellet bestaat uit een gemengde celsuspensie aan een 5 ml buisje en was 5 keer in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) gesupplementeerd met 2% sorbitol tot levensvatbare cellen en afval te elimineren.
5. Zaad cellen in 6-well platen en cultuur in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS), 10 mg / ml insuline, 10 ug / ml transferrine, 10 ug / ml gentamicine, en 2 ng / ml epidermale groeifactor (EGF) . Vacuum alle componenten behalve EGF die kunnen worden toegevoegd na filtratie filter (0,22 pm). Verdeel cellen verkregen van humane monsters resectie met meerdere 6-well platen, afhankelijk van de grootte resectie.
6. Zodra putten 80% confluent, passage hechtende cellen T25 kolven onsing 0.05% trypsine / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Neutraliseren met media en draaien bij 400 x g.
   1. Voor 6 putjes doorgang naar een T25 kolf passage cellen bij een 1: 1 verhouding. Confluente T25 kolven worden gepasseerd op een 1: 2 of 1: 3 verhouding. Om passage uit een T25 kolf een T75 kolf gebruikt een 1: 1 verhouding. Verandering media om de 2-3 dagen, ongeacht het vaartuig.
   2. Kweek cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% _CO2 incubator en cultuur in myofibroblast media hierboven beschreven.
      OPMERKING: Epitheelcellen niet overleven onder deze cultuur of passage voorwaarden. Cellen voor karakterisering en de hierna beschreven studies tussen doorgangen 5 en 15.
   3. Cryo-behouden cellen in vloeibare _N2 door 10% dimethylsulfoxide het myofibroblast media.

3. karakteriseren van muis en mens Oesofageale stromale cellen

1. Onderzoek de morfologie van cellen met een omgekeerde microscoop. Let op de spindel-vormigemorfologie van hechtende cellen (Figuur 1).
2. Karakteriseren gekweekte cellen door evaluatie van de volgende cytoskelet markers: α-SMA, vimentine, desmine, en cytokeratine. Stromale cellen met een myofibroblast fenotype expressie cytoskelet myofibroblast markers α-SMA en vimentine (figuur 2).
   1. Om verder te onderscheiden gekweekte stromale cellen van spiercellen, immunostain voor desmine. Om immunokleuren op gekweekte cellen uit te voeren, plaat 1,5 x 10 ⁴ cellen in 4-goed kamer dia's en groeien in myofibroblast media voor 24 uur. Stromale cellen met een myofibroblast-achtige fenotype zal zwak of afwezig desmine expressie hebben. Stromale cellen missen expressie van de epitheliale marker pan-cytokeratine (gegevens niet getoond).
      OPMERKING: Evaluatie van culturen omvat de evaluatie van het cytoskelet markers door immuuncytochemie en celoppervlaktemerkers door flowcytometrie. Immunocytochemie wordt gebruikt als de primaire methode van karakterisering als de expression profiel van cytoskeleteiwitten is uniek voor de fibroblast, myofibro- of spiercel. Flowcytometrie wordt cultuur zuiverheid evalueren celoppervlak van epitheliale, endotheliale en hemopoëtische cellen markers. CD90 is nuttig als een aanvullende werkwijze voor het identificeren humane stromale cellen zoals gezegd zowel humane fibroblasten en myofibroblasten. CD90 is nuttig in karakterisering van muizen bindweefselcellen zoals Ook van muizen T-cellen.
3. Nadat de cellen 60% confluentie bereiken, spoel dia's met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en bevestig met methanol. Incubeer cellen in methanol gedurende 10 minuten bij -20 ° C en bewaar in PBS bij 4 ° C tot gebruik.
4. Volg standaard immunostaining protocol.
5. Kort vooraleer de primaire antilichaam, blokkeren de gefixeerde cellen met 5% goatserum in PBS. Verdunnen primaire en secundaire antilichamen in 5% geitserum ook.
   1. Voor detectie van α-SMA en vimentine, gebruik maken van dena antilichamen en concentraties: muis mAb α-SMA bij 1: 250 verdunning en konijn pAB te vimentine 1: 500 verdunning.
   2. Incubeer met primaire antilichaam bij kamertemperatuur overnacht bij 4 ° C, spoelen 3 maal met PBS en voeg secundaire antilichamen rhodamine geconjugeerd geit anti muis bij een verdunning van 1: 200 en Cy2 geconjugeerd geit anti konijn bij een verdunning van 1: 1000 1 uur bij kamertemperatuur.
   3. Tegenkleuring kernen met 4 ', 6-diamidino-2Phenylindole (DAPI) bij een concentratie van 1 ug / ml gedurende 1 min en vervolgens wassen met PBS. Analyseer dia met een omgekeerde microscoop.
6. -zuiverheid Culturen door onderzoek van muizen en menselijke slokdarm cellen voor hematopoïetische (CD45) en endotheliale (CD31) celoppervlaktemarkers door flow cytometrie (figuur 3). Karakteriseren menselijke cellen verder door expressie van de stromale celoppervlak marker CD90.
   OPMERKING: CD90 kan niet worden gebruikt om murine stromale cellen zoals muizen T cel identificerenls ook uiten CD90.
   1. Maak gekweekte muizen oesofageale stromacellen uit de kolven door behandeling met niet-enzymatische cel dissociatie oplossing bij 37 ° C gedurende 10 min, gewassen met FACS-buffer tweemaal geteld en gekleurd met FITC-CD45 en CD31-APC relevante isotype controles volgens standaard kleuringen.
   2. Verzamel cellen met FACS Calibur en gegevens FlowJo software geanalyseerd. Vóór gekleurde cellen, optimaliseren antilichamen en titreer door gebruikmaking isotype controles normale muis milt en beenmerg cellen.

Resultaten

Esophageal stromale cellen geïsoleerd met behulp van mechanische en enzymatische digestie worden eerst uitgeplaat en gekweekt in platen met 6 putjes. Onderzoek van cellen met een omgekeerde microscoop binnen uren na plating toont een gemengde celsuspensie losjes hechtend aan de onderste plaat (Figuur 1A). In de volgende 24 uur, worden spoelvormige cellen stevig hechtende de plaatbodem waargenomen schieten uit het gemengde celsuspensie (Figuur 1B) .Deze kiemen cellen het gehele gebied va...

Discussie

De technieken voor het primaire cultuur generatie zijn over het algemeen gelijk bij het gebruik van muizen of menselijk weefsel met hakken en spijsvertering tijden aangepast voor weefsel grootte. Onze ervaring met murine weefsel suggereert dat volgens de hierboven beschreven werkwijzen consequent leiden succes een primaire kweken. Kritische stappen in het protocol zijn onder sterilisatie van chirurgische apparatuur en volgende standaard steriele technieken van weefselkweek. De leeftijd van de muizen ook een kritische st...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Weefselkweekreagentia
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
Dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
Collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma-Aldrich	F42442
Transferrine	Roche	10-652-202-001
trypsine/EDTA	Corning	25-052-Cl
Epidermaal groeifactor	Sigma-Aldrich	E9644
Reagentia voor immunokleuring
Geitenserum	Sigma Aldrich	G9023
Muis mAB naar α-SMA	abcam	ab7817
Konijn pAB naar vimentine	abcam	ab45939
Cy2 geconjugeerd Geiten anti Konijn	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	Sigma-Aldrich	D8417
CD31 geconjugeerd aan eFluor 450	eBioscience	48-0319-41
CD90 geconjugeerd aan APC	eBioscience	17-0909-41
Annexin V en 7AAD	BD Pharmigen	559763
Muis Fc-blok voor CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Apparatuur
5 ml buis	Eppendorf	30108310
Omgekeerd microscoop	Motic	AE31
Bioveiligheidskast en incubators	Nuaire		http://www.nuaire.com/products/
4-kamer kamer slides	Thermo Scientific	177437
Gekoelde centrifuge	Eppendorf	5810R
Olympus Vacuum-Driven Filter System	Genesee Scientific	25-227
Fluorescentiemicroscoop	Nikon	Eclipse TE300
6-wells platen	Corning	3516
T25 Flacons	TRP	90026
T75 Flacons	Corning	43064
Dissectie schaar
Dissectie pincet
Single tipped Q-Tips	Kendall	540500
Software
Metamorph software (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience