Proteomics Profilering van macrofagen door 2D-elektroforese

Samenvatting

Macrofagen zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij de pathogeniteit van de gastheer. Macrofagen vertonen fenotypische en functionele diversiteit die kan worden geanalyseerd en gedetecteerd door middel van proteomische analyse. Dit artikel beschrijft hoe je 2D-elektroforese uitvoert van primaire culturen van humane macrofagen die zijn gedifferentieerd in M1- of M2-fenotype.

Samenvatting

Het doel van het hier beschreven tweedimensionale (2D) elektroforeseprotocol is om te laten zien hoe het fenotype van gekweekte menselijke macrofagen kan worden geanalyseerd. De belangrijke rol van macrofagen is aangetoond bij verschillende pathologische aandoeningen zoals inflammatoire, immunologische en infectieziekten. In dit protocol gebruiken we primaire culturen van menselijke monocyte-afgeleide macrofagen die kunnen worden gedifferentieerd in de M1 (pro-inflammatoire) of de M2 (anti-inflammatoire) fenotypus. Dit in vitro model is betrouwbaar voor het bestuderen van de biologische activiteiten van M1 en M2 macrofagen en ook voor een proteomische aanpak. Proteomische technieken zijn nuttig voor het vergelijken van het fenotype en gedrag van M1 en M2 macrofagen tijdens gastheerpathogeniciteit. 2D gelelektroforese is een krachtige proteomische techniek voor het in kaart brengen van grote aantallen eiwitten of polypeptiden gelijktijdig. We beschrijven het protocol van 2D elektroforese met behulp van fluorescerende kleurstoffen, genaamd 2D Differentiële Gel Elektroforese (DIGE). De M1 en M2 macrofagen eiwitten worden gelabeld met cyanine kleurstoffen voorafgaand aan scheiding door iso-elektrisch focusseren, volgens hun iso-elektrisch punt in de eerste dimensie, en hun moleculaire massa, in de tweede dimensie. Gescheiden eiwit- of polypeptidische vlekken worden vervolgens gebruikt om verschillen in eiwit- of polypeptide expressieniveaus te detecteren. De hier beschreven proteomische benaderingen maken de onderzoek van macrofaag-eiwitveranderingen geassocieerd met verschillende aandoeningen zoals gastheerpathogeniciteit of microbiële toxines mogelijk.

Inleiding

Macrofagen zijn heterogeen en plastic cellen die kunnen verschillende functionele fenotypes verwerven. In vivo, deze cellen reageren op een grote verscheidenheid aan micro milieu signalssuch microbiële producten, cytokines, etc. ^1. In vitro, de pro-inflammatoire fenotype (M1) macrofagen kunnen worden geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) en de anti-inflammatoire fenotype (M2) van bepaalde cytokines zoals interleukine-4 (IL-4). Bovendien kunnen macrofagen schakelen van een geactiveerde M1 M2 fenotype, en omgekeerd, op specifieke signalen ^2.

Afhankelijk van het fenotype, zal macrofagen verschillende functies. M1 macrofagen cellen die pro-inflammatoire cytokines zoals tumor necrose factor α (TNF-α) produceren, micro-organismen of tumorcellen ³ doden. Daarentegen M2 macrofagen voorkomen dat deze ontstekingsreactie zoals in wondgenezing en fibrose van die anti-inflammatory factoren zoals TGF-β ^3,4.

Humane perifere bloed mononucleaire cellen van gezonde donoren werden geïsoleerd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie zoals eerder beschreven ⁵ met een techniek aangepast van Boyum ^6. Macrofagen in cultuur kan worden onderscheiden in M1 of M2 fenotype na 6 dagen van de primaire cultuur ^7.

Analyse van eiwitexpressie of eiwit bij de twee subtypes van macrofagen bij verschillende gecontroleerde stimuli, zoals gastheer pathogeniteit of microbiële toxinen, zal nuttig zijn om de functionaliteit van de pro- en anti-inflammatoire macrofagen ontcijferen.

Proteomics zijn unieke instrumenten voor directe controle van eiwitten die specifiek up- of down-gereguleerd in menselijke gekweekte macrofagen onder verschillende stimuli. Fluorescerende kleurstoffen opgelost aantal beperkingen van 2D gel elektroforese, zoals lage gevoeligheid en beeldanalyse ^{8 <} / Sup>. De kleurstoffen reactie met cysteïne residuen de detectiegevoeligheid vergeleken met die reageren met lysineresten ⁹ verhoogd. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat de bruikbaarheid van DIGE verzadiging etikettering van de analyse van schaarse monsters ¹⁰ met de klassieke zilvergevlekte 2D electroforese ^11. Deze techniek is nuttig bij het snel analyseren eiwitmodificaties tussen de twee subtypes van macrofagen of tussen onbehandelde en behandelde macrofagen uit hetzelfde subtype.

De voordelen van deze techniek zijn proteomische toegang tot de informatie van eiwitgrootte en post-translationele modificaties die door analyse van de 2D gel ^12. Er moet rekening mee dat dit geen hoge doorvoer techniek worden gehouden, waardoor het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd. De ontwikkeling van high throughput assays op basis van massaspectrometrie als beoordeeld onlangs ¹³ kan dit verbeteren.

_content "> Hier presenteren we hoe 2D DIGE analyse van het eiwit extractie van gekweekte macrofagen te voeren door middel van de processen van elektroforese, isoelectrofocusing, en SDS-PAGE, evenals informatie over het nut van adequate 2D software.

Protocol

Het protocol volgt de richtlijnen van onze instellingen menselijk-ethische toetsingscommissie. Buffy coat van gezonde menselijke donoren werden verkregen uit het Regionaal Bloedtransfusie Center (Lille, Frankrijk). Monsters uit de buffy coats worden gedeclareerd als een Inserm collectie (n ° DC2010-1209).

1. Materiaal en Cultuur Media Voorbereiding

1. Verdun 10x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) in steriel gedestilleerd water tot 1x PBS verkrijgen.
2. Voeg RPMI 1640 medium aangevuld met gentamicine (40 ug / ml) en L-glutamine (2 mM), met en zonder 10% gepoold humaan serum.

2. Primaire culturen van Monocyt afgeleide macrofagen (MDM)

1. Verdun buffycoat (25 ml) met 1x PBS. Vul voorzichtig op een Ficoll / Leucosep buis en centrifugeer bij 1600 xg gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
2. Verzamel monocyten aan het grensvlak in een nieuwe buis. 3x wassen met 10 ml 1x PBS dat 0,1% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) door opeenvolgende centrifugeren bij 1000 xg, 370 xg en 160 xg gedurende 10 min elk, en vervolgens eenmaal in 1x PBS alleen bij 160 xg gedurende 10 min.
3. Resuspendeer de celpellet in 5 ml RPMI-1640 medium zonder serum en zaden de cellen in 35 mm schalen bij een dichtheid van 1 x 10 ⁶ cellen per schaal.
4. Na sedimentatie gedurende 90 min in de incubator, gooi het supernatant dat de niet-hechtende cellen. Was de hechtende cellen, bestaande uit monocyten, 3x met 1 ml PBS; voeg 1 ml vers medium bevattende 10% (v / v) humaan serum de eerder serumvrije cellen.
5. Na 6 dagen kweken alternatieve gedifferentieerde macrofagen (M2) wordt verkregen, voeg recombinant humaan IL-4 (15 ng / ml) en handhaven 6 dagen. Daarna kunt gedifferentieerde macrofagen met lipopolysaccharide (100 ng / ml) op dag 12 gedurende 4 uur tot M1 macrofagen te verkrijgen.

3. Extractie van M1 en M2 Macrophage Eiwitten voor 2D-elektroforese

1. Wash macrophleeftijden driemaal met 25 mM Tris, pH 7,4, en afval in buffer die 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat (CHAPS), 2 M thioureum en 7 M ureum.
2. Lyse cellen met een geschikte mixer gedurende 1,5 ml microcentrifuge buisjes gedurende 5 min in ijs en bewaar bij -20 ° C.
3. Bepaal eiwitconcentratie met een commercieel Bradford reagens. WINKEL 100 ul aliquots van de eiwitten bij -20 ° C tot gebruik.

4. Isoelectrofocusing

OPMERKING: Voer alle procedures etikettering in het donker.

1. Verminder 5 pg van elk monster (M1 en M2 macrofagen) ingesteld op 9 ul met lysis buffer met 2 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
2. Cyanine 3 (Cy3) M1 en M2 extract sulfhydryl-reactieve kleurstof extract toe in een concentratie van 0,8 nM / ug eiwit. Cyanine 5 (Cy5) aan M1 en M2 onttrekt in een concentratie van 0,8 nM / ug eiwit en incubeergedurende 30 min bij 37 ° C.
3. Stop de reactie met de toevoeging van een gelijk volume van monsterbuffer bevattende 7 M ureum, 2 M thioureum, 4% CHAPS, 130 mM dithiothreitol (DTT) en 2% pharmalytes.
4. Mix Cy3-gelabeld M1 monsters met een Cy5-gelabelde M2 ​​monsters per hand en Cy3-gelabeld M2 monsters met een Cy5-gelabelde M1 bemonsteringen in een andere hand.
5. Rehydrateren een geïmmobiliseerde pH-gradiënt (IPG) strip (240 mm, pH 3-10 lineaire gradiënt) met 450 pl gemerkte gemengde monsters in buffer bevattende 7 M ureum, 2 M thioureum en 4% CHAPS op een isoelektrisch focusseren (IEF) celsysteem gedurende 24 uur zonder dat enige stroom.
6. Voer scherpgesteld bij 300 volt (V) gedurende 3 uur en vervolgens met een gradiënt tot 1000 V gedurende 6 uur, bij een verloop op 8000 V gedurende 3 uur en tenslotte bij 8000 V gedurende 3 uur.

5. Tweede dimensie

OPMERKING: Voer alle elektroforese procedures in het donker.

1. Incubeer de IPG strips in equilibratiebuffer bevattening 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M ureum, 2% (w / v) natriumdodecylsulfaat (SDS) en 30% (v / v) glycerol gedurende 10 min.
2. Breng de geëquilibreerde IPG strips voor de tweede dimensie (SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE)) op 12,5% PAGE gels en afdichting met laagsmeltende agarose.
3. Voeren elektroforese bij 20 ° C met een Ettan-Daltsix systeem een ​​constante spanning van 70 V overnacht gevolgd door 300 V tot de broomfenolblauw achterkant onderkant van de gel bereikt.

6. Image Acquisition en Bioinformatica analyse

1. Scan gels geworpen tussen de twee lage fluorescentie glasplaten met een DIGE Imager scanner bij excitatie / emissie golflengten van 532/580 nm voor Cy3 en 633/670 nm voor Cy5 om beelden te leveren met een pixelgrootte van 100 micrometer.
2. Voer beeldanalyse met commerciële software zoals eerder beschreven ^12.
3. Bereken en normaliseren spot volumes in elk beeld. Wijs een genormaliseerde spot volume als stutortion van de totale waarde van elke vlek waargenomen in de gel.
4. Analyse van de verschillen in eiwitpunt volumes elk van macrofagen door de genormaliseerde plaatse volumewaarde tussen de twee groepen (M1 en M2) vergelijken. Beschouw het verschil tussen de vlekvolumes significant beschouwd als de verandering 1,5- (p <0,05, eenzijdige ANOVA).

Resultaten

Om passende differentiële proteomics analyses uit te voeren, moet de verwerking van de te analyseren monsters worden geverifieerd.

In de gepresenteerde voorbeeld, wordt de celkweek kwaliteit van macrofagen die voor morfologische en moleculaire aspecten eerder gepubliceerd ^5. De differentiatie van monocyten in macrofagen en de homogeniteit van de kweek werd gevolgd door fase-microscopie. Figuur 1 vertoonde een voorbeeld van primaire, M1 en M2 macrofagen. Zoals geto...

Discussie

De hierin beschreven protocol Gegevens methode om de invloed van verschillende stimuli van de twee subtypes van macrofagen, M1 (pro-inflammatoire) en M2 (anti-inflammatoire) geanalyseerd. Primaire, M1 en M2 macrofagen werden verkregen van de differentiatie van monocyten als eerder gepubliceerd ^7.

De procedure van 2D DIGE gelelektroforese speciale materialen en uitrusting, zoals IEF cel isoelectrofocusing lage fluorescentie platen voor de SDS-PAGE om tweemaal de gel bij excitatie /...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-glutamine-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
gentamycin 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
human serum	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1,077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
6-wells plate PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Research Organics	3.00E+01
Filter 0.22 µm	Millipore	SCGPTORE
100 ml cylinder	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford reagent	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-reactive dye	GE Healthcare	25-8009-83
IPG strip 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean IEF cell	Bio-Rad	165-4000
Low-melting agarose	Invitrogen	15517-014
Ettan-Daltsix system	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Non linear dynamics
50 ml tubes	any supplier	n/a
15 ml tubes	any supplier	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
Urée	Merk	108484-500
Thiourée	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	114391
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Acrylamide 40%	Bio-Rad	161-0148
2D clean Up	GE Healthcare	80-6454-51
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Diméthylformamide	Sigma-Aldrich	22705-6
electrode wicks	Bio-Rad	165-4071