De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

Samenvatting

De neuromusculaire junctie (NMJ) wordt gewijzigd in een verscheidenheid aan omstandigheden die soms kunnen resulteren in synaptische falen. Dit rapport beschrijft op fluorescentiemicroscoop gebaseerde methoden om dergelijke structurele veranderingen te kwantificeren.

Samenvatting

De neuromusculaire junctie (NMJ) is de grote, cholinerge relais synaps waardoor zoogdieren motorische neuronen controle vrijwillige spiersamentrekking. Structurele veranderingen op de NMJ kan resulteren in neurotransmissie falen, wat resulteert in zwakheid, atrofie en zelfs de dood van de spiervezels. Vele studies hebben onderzocht hoe genetische modificaties of aandoening de structuur van de muis NMJ kan veranderen. Helaas kan het moeilijk zijn direct vergelijken resultaten van deze studies, omdat ze vaak gebruikt verschillende parameters en analysemethoden. Drie protocollen worden hier beschreven. De eerste maakt gebruik van maximale intensiteit projectie confocale beelden op het gebied van acetylcholine receptor (AChR) te meten rijke postsynaptische membraan domeinen bij de eindplaat en het gebied van de synaptische blaasjes kleuring in de bovenliggende presynaptische zenuwuiteinde. Het tweede protocol vergelijkt de relatieve intensiteiten van immuunkleuring voor synaptische eiwitten in het postsynaptische membraan. De derde protocol gebruikt Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) veranderingen in de verpakking van postsynaptische AChRs aan de eindplaat detecteren. De protocollen zijn ontwikkeld en verfijnd over een reeks van studies. Factoren die de kwaliteit en de consistentie van de resultaten beïnvloeden worden besproken en normatieve gegevens zijn bedoeld voor NMJs bij gezonde jonge volwassen muizen.

Inleiding

De neuromusculaire junctie (NMJ) is de kritische relais synaps dat de communicatie tussen het zenuwstelsel en de skeletspieren bemiddelt. Het is vereist voor alle vrijwillige beweging. Fluorescentie microscopie al lang gebruikt om de effecten van transgenen bestuderen op muis NMJ ^1-3 of de effecten van leeftijd, dieet, lichaamsbeweging en ziekte vergelijk bij knaagdieren NMJs ^4-11. Dergelijke studies hebben ons veel geleerd over de fysiologie en pathofysiologie van de NMJ, maar de diverse parameters gerapporteerd (bv AChR gebied, eindplaat oppervlakte, omtrek lengte, fragmentatie indices) maken het vaak moeilijk om de resultaten van deze studies te vergelijken. Er is een toenemende verwachting voor preklinische onderzoekers kunnen reproduceerbaar zijn, vooral in studies met diermodellen voor ziekten ^12. De hier beschreven protocollen werden verfijnd door een reeks studies die ontwikkeling, fysiologie en pathofysiologische ch onderzochtanges naar de NMJ. Dergelijke studies vereisen meting van het gebied van de synaptische specialisaties op de muis motorische eindplaat en de relatieve dichtheid van de verpakking van synaptische eiwitten binnen postsynaptische specialisaties ^13-15.

De bruikbaarheid van deze methode wordt geïllustreerd door recente studies in een muismodel van anti-MuSK myasthenia gravis. Dagelijkse injecties van IgG uit anti-MuSK-positieve myasthenia gravis patiënten in volwassen muizen zorgde ervoor dat ze zwak worden binnen 2 weken ^16. Confocale maximale projectie beelden spier secties werden dubbel gelabeld voor synaptofysine (in zenuw-terminals) en postsynaptische AChRs toonde een geleidelijke afname van het gebied van AChR kleuring als primaire verandering. Belangrijk is het tempo van de daling was voldoende om vergelijkbare dalingen in de amplitude van synaptische potentialen, falen van synaptische transmissie en spierzwakte ^17,18 verklaren. Kwalitatief vergelijkbaar bevindingen werden gerapporteerd door andere onderzoeksgroepen^10,19. Dezelfde NMJ meetmethoden zijn sindsdien gebruikt om het effect van drie geneesmiddelen te beoordelen voor het behandelen van anti-MuSK myasthenia gravis in dit muismodel ^20,21.

Sedentaire veroudering kan leiden tot verlies van de neuromusculaire verbindingen. De hier beschreven protocollen hebben een leeftijdsgebonden achteruitgang op het gebied van zenuwuiteinde synaptofysine bij motorische eindplaten geopenbaard als muizen vooruitgang tot op hoge leeftijd. Dezelfde methoden bleek dat vrijwillige uitoefening grotendeels kon voorkomen dat de vermindering van de presynaptische zenuwuiteinde gebied ^22, in overeenstemming met eerder werk van andere groepen ^4. Verlies van neuromusculaire verbindingen komt ook voor in de SOD1G93A muismodel van amyotrofische lateraal sclerose ^9,23.

De bovengenoemde studies tonen aan dat een verscheidenheid van gezondheidsproblemen kan leiden tot vermindering van het gebied van een van beide pre- of post-synaptische specialisaties op het NMJ. Dit kan resulteren in een verminderde synaptische functie of kunnen inluiden volledig verlies van de neuromusculaire verbinding. Drie protocollen worden beschreven dat kwantificering van het gebied en de dichtheid van synaptische specialisaties mogelijk te maken. Het doel van het eerste protocol is een praktische en reproduceerbare meting van de oppervlakken van pre- en postsynaptische specialisaties en hun aanpassing aan zoogdieren NMJs indienen waarbij fluorescentiemicroscopie. Tweedimensionale maximum projectie confocale beelden en beeldanalyse met NIH ImageJ om wijzigingen in het gebied van synaptophysine kleuring (synaptische blaasjes), postsynaptische AChRs en synaptische overlappingsgebied detecteren. Confocale beeldvorming parameters (gain en offset niveau) worden geoptimaliseerd voor elke NMJ om de visuele informatie gebruikt om het gebied van synaptische specialisatie onderscheiden maximaliseren. Neuromusculaire mislukking kan ook resulteren uit veranderingen in de dichtheid van postsynaptische AChR en / of andere synaptische eiwitten. Het tweede protocol kan worden toegepast om de veranderingen in de relatieve dichtheid van postsynaptische eiwitten detecterenals muskus, rapsyne, dystroglycan, gefosforyleerd Src kinase en gefosforyleerd AChR ^18,21.

In gravis myasthenie, een verminderde dichtheid van AChR binnen de postsynaptische membraan is de directe oorzaak van synaptische mislukking en spierzwakte. Het derde protocol beschrijft een Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) gebruikt om veranderingen in de nabijheid van aangrenzende AChRs op postsynaptische membranen ^14,15 beoordelen. Deze methode detecteert energieoverdracht tussen naburige AChRs gelabeld met fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET alleen gebeurt wanneer de fluorescerende donor en acceptor probes minder dan 10 nm uit elkaar. Dit kan (submicroscopic) veranderingen in de dichtheid van AChR verpakking die rechtstreeks betrekking kunnen hebben op de amplitude van synaptische potentialen onthullen.

Deze drie protocollen, verfijnd in het afgelopen decennium, bieden aanvullende maatregelen van NMJ integriteit op een consistente en reproduceerbare wijze. Het gebruik van gestandaardiseerde protocollen eennd parameters dienen vergelijking van de effecten van genen en milieu-ingrepen op het zoogdier NMJ vergemakkelijken.

Protocol

OPMERKING: Ontwerp, uitvoering en rapportage van dierproeven moeten rekening houden met de huidige richtlijnen ^24. Dergelijke werkzaamheden moeten vooraf worden goedgekeurd door de lokale dierenwelzijn gezag (in ons geval de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Sydney).

1. Euthanasie van de dieren en de Muscle Dissection

1. Breng de muis van het dierenverblijf naar een aparte kamer waar het geëuthanaseerd met een intraperitoneale injectie van pentobarbiton oplossing (30 mg / kg) met de muiswerkzaamheden methode beschreven door Shimizu ^25. Plaats de muis weer in de kooi.
2. Zodra de ademhaling van de muis is gestopt voor meer dan 1 min, test de voet-terugtrekking reflex door zachtjes te knijpen de voet, en de cornea reflex door licht borstelen het hoornvlies. Alleen als reflex reacties afwezig zijn kan de muis worden voorbereid voor dissectie.
3. Raadpleeg een atlas van de anatomie van knaagdieren zoals Chiasson ²⁶ en / of zoeken naar de hulp van een experienced anatoom voordat dissectie van de spier van belang. In elk geval te verwijderen haren uit de bovenliggende huid met behulp van een kleine elektrische scheerapparaat voor het openen van de huid om de spieren bloot.
   OPMERKING: De dissectie zal verschillen per anatomisch afzonderlijke spier.
4. Met behulp van botte tang gratis de spier van bovenliggende membranen en omliggende weefsels. Pak en snijd de distale pees om de spier te scheiden van haar inbrengen.
5. Zachtjes plagen en knip de spier vrij van omliggend weefsel direct terug naar zijn oorsprong. Kort plaats de nieuwe spier ontleed in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing of Ringer's oplossing voorafgaand aan verdere verwerking.

2. Voorbereiden van de Spier voor cryosectioning

OPMERKING: Optimale structurele conservering kan worden bereikt door volledige dier perfusie zoals eerder beschreven ²⁷ of onderdompeling fixatie (kleine spieren) zoals beschreven in optionele stap 2.1. Echter,4% paraformaldehyde fixatie daaropvolgende kleuring beïnvloeden vele antilichaam probes en met fluorescerende-BGT. Glutaraldehyde bijzonder moet worden vermeden. Als spieren niet vast te stellen moeten ze onmiddellijk worden snel bevroren (ga naar 2.3).

1. Optioneel onderdompeling fixatie: Speld de spier om de was in een petrischaal bij rust lengte. Bedek de spier met 2% w / v paraformaldehyde (vers opgelost in PBS) gedurende 2 uur bij KT. Wassen met 3 veranderingen van PBS gedurende 30 min (3 x 10 min) plaats de PBS met 30% w / v sucrose in PBS en geïncubeerd O / N bij 4 ° C.
2. Voeg mallen ("boten") vooraf door vouwen 2 cm x 1.5 cm stukjes aluminiumfolie zoals weergegeven in figuur 1. Leg een vel nitrocellulosemembraan in de bodem van de boot. Giet langzaam een cryostaat inbedden matrix (Materials tabel) in de boot tot een diepte van 2 mm, de zorg om luchtbellen te voorkomen. Plaats de spier in de boot, gelijk met de balpen lijnen opde nitrocellulose. Voeg meer inbedden matrix teneinde volledig te bedekken de spier (figuur 1).
3. Pre-label polypropyleen buizen met een onuitwisbare stift. Plaats een druppel water in elke buis en relaxen de buis in vloeibare stikstof.
   OPMERKING: De bevroren waterdruppel handhaaft de dampdruk en voorkomt uitdroging tijdens langdurige -80 ° C bewaren
4. Met behulp van een vizier, dikke beschermende handschoenen en een grote paar stompe tang, gedeeltelijk verlagen van een kleine metalen beker (3 cm doorsnede, 8 cm diep) met 2 cm diepte van isopentaan in een container van vloeibare stikstof voor 30 sec. Verwijder het bekerglas en zet hem op de bank top. Met behulp van een kleinere paar stompe pincet plaats de mal met de spieren en het inbedden van matrix in de gekoelde isopentaan. Zorg ervoor dat vloeibare stikstof mengen met de isopentaan te voorkomen.
5. Laat 2 min voor het blok volledig bevriezen voordat u botte tang om de bevroren blok uit te tillen en sluit deze in de juiste pre-gelabelde en voorgekoelde buis (stap 2.3).
6. Bewaar de buizen tijdelijk in de vloeibare stikstof alvorens naar -80 ° C. Log alle monsters in een spreadsheet van de inhoud vriezer.

3. cryosectioning en Fluorescentie kleuring voor En Face afbeeldingen van NMJs

1. Schil de aluminium mal weg. Binnen de -20 ° C cryostaatkamer bevestigen het bevroren blok aan de cryostaat klem om snijden 20 urn vriescoupes evenwijdig aan de lange as van de spiervezels (figuur 1). Pak de secties op poly-L-lysine of gelatine gecoate microscoop dia's.
2. OPMERKING: Sla deze stap over als het weefsel voorafgaand aan het bevriezen is bevestigd. Nadat men 30 min bij gedeelten drogen op de glijbanen, bevestig ze door een druppel van 2% paraformaldehyde in PBS gedurende elke sectie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
3. Was slides 3 x 10 min in PBS in een Coplin jar, en dompel de objectglaasjes in PBS met 0,1 M glycine gedurende 30 min om resterende aldehydegroepen blokkeren.
4. Was objectglaasjes gedurende 10 minuten in PBS, vervolgens ondergedompeld in methanol (gekoeld tot -20 ° C) gedurende 7 min. Dit permeabilisatie stap is een routine-onderdeel van dubbele labeling met tl-BGT en anti-synaptofysine maar het kan een negatieve invloed hebben immuunkleuring voor een aantal andere eiwitten.
5. Was glijdt 2 x 10 minuten in PBS plaats dan elke dia in een stabiele en geëgaliseerd bevochtigde kamer. Die onmiddellijk elke sectie met 20 ui blokkerende oplossing (0,2% Triton X-100, 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS) gedurende 1 uur bij KT. Secties mag niet uitdrogen in elk stadium van de immunokleuring proces.
6. Het uitvoeren van de primaire incubatie: Het nemen van een dia in een tijd de overtollige blokkerende oplossing te verwijderen voorzichtig uit meer dan elke sectie en te vervangen door 20 ul van konijnen anti-synaptofysine (verdund 1: 200 in de blokkerende oplossing).
7. Neem een ​​negatieve controle dia die worden geïncubeerd met alleen blokkeringsoplossing. Deze 'no-primaire antilichaam controle'Is essentieel in elk immunokleuren run.
8. Zorg ervoor dat het primaire antilichaam blijft op zijn plaats dan elke sectie, sluit de vochtige kamer en incubeer gedurende 1-2 dagen bij 4 ºC.
9. Inspecteer elke sectie om te bevestigen dat het primaire antilichaam op zijn plaats blijft. Gebruik een Pasteur pipet om voorzichtig te spoelen elke dia met PBS en plaats deze in een Coplin pot. Was de schuiven 3 x 10 min in PBS.
10. Het uitvoeren van secundaire incubatie. Het nemen van een dia op een moment, verwijder voorzichtig overtollige PBS, leg het in de vochtige kamer en bedek elke sectie met 20 pi van een mengsel dat FITC-geconjugeerd ezel anti-konijn IgG en BGT geconjugeerd aan rhodamine Tetramethyl of een andere rode fluorofoor (TRITC- / redBGT, 5 g / ml) verdund in blokkerende oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
11. Was glijdt 3 x 10 min in PBS in Coplin potten.
12. Het nemen van een dia op een moment, verwijder voorzichtig overtollige PBS en monteer met een dekglaasje met behulp van een minimaal volume, glycero-l gebaseerde, fade-weerstand montage medium. Dicht de randen van de dekglaasjes met heldere nagellak. Laat het moeilijk drogen.
13. Bewaar de objectglaasjes in het donker bij 4 ° C gedurende maximaal een week, of bij -20 ° C voor langere opslagtijden (tot enkele maanden).

4. Aanbevelingen bemonstering en En Face Imaging van Motor Eindplaten

1. Verblindt de dia's door het labelen van elk glaasje met een willekeurige code die alleen bekend is blijft een tweede onderzoeker (niet betrokken in de analyse). Hierdoor blijft de exploitant blind behandelingsgroepen tot kwantificering van NMJ parameters is voltooid voor alle monsters.
2. Plaats de dia op de microscoop podium en bekijk het onder brede veld belichting met de TRITC filter set (63x olie 1.3 NA objectief). Verplaats progressief (veld voor veld) van links naar rechts en weer tot een eindplaat verschijnt in het veld (Figuur 2A).
   OPMERKING: Sampling criterium: Elke AChR-gekleurd structuur die relatiefvlak en tegenover het objectief (dwz uitstrekt <15 m in de z-dimensie) wordt beschouwd als een eindplaat en wordt afgebeeld voor analyse (halvemaantjes van AChR kleuring doorsneden door eindplaten en worden daarom uitgesloten).
3. Met de confocale pinhole op 1,0 Airy eenheid en lage laservermogen optimaliseren versterking en offset niveaus TRITC / rood-BGT (532 nm laser) en de eindplaat dat moet worden afgebeeld. Volgende optimaliseren FITC / synaptofysine fluorescentie met behulp van de 488 nm laser. Verzamel een z-stack van de eindplaat met een 0,7 urn interval tussen elke optische segment. Sla de beelden met een bestandsnaam die de datum van de opnamesessie, de codenaam van de glijbaan en het nummer van de eindplaat omvat.
   OPMERKING: De scans met de 488 nm en 532 nm lasers (FITC en TRITC) worden verzameld opeenvolgend (niet tegelijkertijd) verontreiniging van het FITC kanaal fluorescentie van het rode fluorofoor en vice versa (doorbloeding) voorkomen.
4. Herhaal de bemonstering eennd beeldvorming van stappen 4,2-4,3 tot 20 eindplaten worden verzameld uit de dia / monster.
5. Ga naar de volgende gecodeerde glijbaan en herhaal 4,2-4,4. Herhaal deze procedure voor elk van de gecodeerde objectglaasjes.
6. Verzamel een paar beelden van de eindplaten van de regelschuif (no-primair antilichaam controle) met behulp van confocale instellingen die optimaal zijn voor de experimentele dia's (de FITC fluorescentie kanaal moet donker zijn) werden gevonden.
7. Aan het einde van de confocale sessie overdracht van de beeldbestanden naar een andere computer en een back-up van de originele bestanden op een externe schijf of server.

5. Het meten van de ruimte van Synaptic Specialisaties in En Face Afbeeldingen

1. Gebruik NIH ImageJ freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) voor maximale projectie (MIP) beelden te bereiden van elkaar z-stack. Opslaan als tiff-bestanden (Figuur 2A & B). Bestandsnamen moeten de datum afbeelding sessie, voorbeeldcode, eindplaat aantal en tl-kanaal (bijv 060414_57 omvatten23_7_FITC.tiff).
2. Open de z-projectie afbeelding in ImageJ. Selecteer de acetylcholine receptor afbeelding kanaal (figuur 3A) en selecteer: Image> Type> 8-bits naar 24-bits RGB-afbeelding gekleurd om te zetten in drie 8-bits grijswaarden beelden op het scherm.
3. Met behulp van de ImageJ polygoon gereedschap trek een ruwe schets rond de eindplaat van belang in de redBGT gekleurd (AVRM) kanaal, zodat alle schijnbare gebrandschilderde gebieden van de specifieke individuele eindplaat, met uitsluiting van alle vlekken die niet afkomstig zijn van de eindplaat van belang zijn ( Figuur 3C).
4. Breng een minimale intensiteit drempel om het beeld door het selecteren van: Image> Adjust> Threshold (Figuur 3E en bijbehorende ImageJ screenshots).
5. Pas de drempel om zo de AChR-gekleurd gedeelten te isoleren terwijl exclusief omliggende achtergrond signaal als sub-drempel (Figuur 3E). Open een tweede window met het originele beeld (continue toon) direct naast het raam ter vergelijking, om de beslissing over de drempelwaarde te vergemakkelijken. Noteer de drempelwaarde voor later gebruik in colokalisatie analyses.
6. Behoud van de veelhoek omtrek rond de eindplaat selecteren: Analyseren> Analyseren Deeltjes. In het pop-up menu geeft u het bereik van maten: 50 tot oneindig pixels (dit elimineert kleine artefacten als gevolg van elektrische ruis in de photomultiplier).
7. Analyseer Deeltjes commando genereert een venster met een lijst van discrete supraliminaire gebieden en hun fluorescentie-intensiteit waarden genummerd zoals ze in het binaire beeld (Figuur 3G en bijbehorende ImageJ screenshot). Kopieer deze gegevens in een gelabelde spreadsheet.
8. Meet de totale eindplaat (gebied binnen de polygoon) door het selecteren van: Analyze> Meet. Dit levert de totale eindplaat gebied. Kopieer en plak de gegevens voor AChR gebieden en intensiteiten ineen spreadsheet en zorg ervoor dat de kolommen op de juiste wijze etiketteren, zal rijen worden gebruikt voor individuele eindplaten voor specifieke dia's.
9. Schakelen naar de anti-synaptofysine fluorescentie kanaal en herhaal de stappen 5,1-5,5, maar voor de FITC kanaal (figuur 3B, D en F). Het doel is de drempel aan te passen zodat een binair beeld dat zo dicht mogelijk overeenkomt met de grenzen van kleuring zoals waargenomen door het oog ontstaat. Noteer de drempelwaarde.
10. Meet het gebied van overlap door toepassing van de volgende stappen: Open het oorspronkelijke bestand met de tweekanaals afbeeldingen en opgesplitst in twee afzonderlijke afbeeldingen door het selecteren van: Image> Stapels> Stapel naar afbeeldingen.
11. Met behulp van de colokalisatie plugin (gedownload en geïnstalleerd vanaf de ImageJ webpagina) Selecteer: pluggin> colocalization en input van de drempelwaarden eerder opgenomen voor de AChR en zenuwbanen in het desbetreffende kanaal query-bos. Dit zal een overlap afbeelding in witte pixels (Figuur 3H en bijbehorende ImageJ screenshots) opleveren.
12. Deze afbeelding converteren nieuw gecreëerde overlap in een grijstinten formaat en een drempel van toepassing op de maximale waarde. De maximumgrens alleen selecteert de witte pixels, corresponderend met het overlappende gedeelte van de twee voorgaande kanalen. Record in de spreadsheet de resulterende gebied waarde van 'colokalisatie', die het gebied van overlap in beeldpunten.
13. Bereid een spreadsheet van data steekproefgemiddelden, berekenen en plotten standaarddeviaties en standaard fouten histogrammen of scatterplots ^20,22. Ook de waarde van n in het algemeen het aantal muizen per steekproef voor statistische doeleinden.
14. Plot eindplaat AChR gebieden scatterplots of frequentiehistogrammen te bepalen of de gegevens normaal verdeeld voor statistische test (figuur 6).

6. Relatieve kleuringIntensiteiten vergeleken met behulp van Dwarse optische secties

LET OP: Voor dit protocol proces worden alle spieren monsters bij elkaar en het beeld in een enkele confocale sessie. Bij de planning van een experiment te laten tot 30 min beeldvorming keer per spier monster.

1. Snij 15 urn vriescoupes dwars op de lange as van de spiervezels en het verzamelen op objectglaasjes zoals beschreven in stap 3.1.
2. Het uitvoeren van fluorescentie kleuring, zoals beschreven in de stappen 3,2-3,13.
3. Code de gekleurde coupes, zodat beeldvorming en analyse wordt uitgevoerd met de exploitant blind voor de behandeling groep, zoals beschreven in stap 4.1.
4. Met behulp van een 40X fluorescentie doelstelling (NA 0,75) enquête kort een deel van elke dia om een ​​enkele winst te bepalen en offset-niveau-instelling voor AChR die geschikt zijn voor alle eindplaten in alle sample dia's zullen zijn. De helderste eindplaat moet dan net onder 256 grijs op de schaal. Deze optimalisatie moet afzonderlijk worden gedaan voor de tweede fluorescence kanaal (achtereenvolgens verzameld). Noteer de vaste gain en offset instellingen van het niveau en ze niet veranderen gedurende de opnamesessie.
5. Verzamel beelden van een fluorescentie standaardglaasje (bijvoorbeeld niet-blekende fluorescerende beads) met dezelfde parameters aan het begin en einde van de confocale sessie eventuele fluctuatie in laserintensiteit detecteren.
6. Gebruik de AChR kanaal naar de dia progressief scannen naar eindplaten lokaliseren.
7. Focus op de enkele optische sectie vliegtuig in elke microscoop gebied dat het meeste aantal AChR-gekleurd eindplaten bevat te vinden.
8. Scan deze enkele optische gedeelte twee keer en bespaart de gemiddelde afbeelding (figuur 4G).
9. Met behoud van hetzelfde focal plane schakelaar naar het tweede fluorescentie kanaal (eiwit van belang) en het verzamelen van het beeld als bij stap 6.8. Sla het image-bestand, ook in de bestandsnaam: datum van de opnamesessie, voorbeeldcode, afbeelding nummer en een symbool voor de tl-kanaal aan te geven. Figuur 4A - F toont voorbeelden van de eindplaat distributie van AChR vergelijking met rapsyne, muskus of -dystroglycan (-DG).
10. Verplaats de etappe naar het volgende veld dat een of meer eindplaten bevat en herhaal stap 6,8-6,9. Herhaal dit tot een totaal van 60 eindplaten worden afgebeeld.
11. Aan het einde van de opnamesessie overdracht van alle bestanden naar een andere computer en een back-up.
12. Open elke originele beeldbestand en tijdens het bekijken van de AChR kanaal, selecteert: Image> Stapels> Stapel naar afbeeldingen, om kanalen te splitsen.
13. Selecteer: Afbeelding> type> 8bit te converteren naar 8-bits grijstinten formaat op het scherm. Doe dit voor beide fluorescentie kanalen.
14. Selecteer: Beeld> Stapels> afbeeldingen te stapelen. Open een nieuwe stapel van twee eerder gescheiden 8-bits afbeeldingen. Men kan dan overschakelen gunstig tussen de twee fluorescentie kanalen binnen de enkel venster.
15. Gebruik de polygoon gereedschap om een ​​lin trekkene strak rond de grens van de AChR kleuring (figuur 4I).
16. Selecteer: Analyze> Meet de gemiddelde pixelintensiteit voor AChR binnen het afgesloten gebied te meten (let op het belang van het tekenen van de lijn strak). Kopieer deze waarde in een gelabelde spreadsheet.
17. Behoud van dezelfde veelhoek omtrek (om het gebied te definiëren te meten), over te schakelen naar de tweede fluorescerende kanaal (bijvoorbeeld figuur 4B, D, F) en selecteer: Analyze> maatregel. Dit zal de gemiddelde kleurintensiteit oplevert voor het eiwit van belang in de synaptische gedefinieerd door AChR kleuring.
18. Kies een gebied uit de buurt van zichtbare eindplaat vlekken selecteer vervolgens: Analyze> Meet de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit te meten. Herhaal dit voor de andere fluorescentiekanaal / s en kopieer de achtergrond waarden in de spreadsheet van fluorescentie waarden.
19. Subdarmkanaal de gemiddelde achtergrondwaarden van eindplaat waarden om de gecorrigeerde intensiteiten voor AChR en het eiwit van belang op elke eindplaat verkrijgen.
20. Deel de gecorrigeerde eindplaat intensiteitswaarden voor het eiwit van belang door de gecorrigeerde BGT fluorescentie intensiteit van de fluorescentie-intensiteit ratio ^14,21 opleveren

7. Vergelijking van de Postsynaptische Membrane AChR Dichtheid Met behulp van FRET

Opmerking: Dit protocol beoordeelt de mate waarin AChRs nauw verpakt (<10 nm gemeten) in het postsynaptische membraan. De precieze donor en acceptor fluorofoor combinatie is essentieel voor dit FRET assay. Namen en gegevens van de fluoroforen worden gegeven in de tabel Materials. De spectrale eigenschappen met betrekking tot FRET, worden besproken in onze vorige papieren ^14,15.

1. Bereid je vast dwars cryocoupes zoals beschreven in paragraaf 6.1. Alle sample groepen moeten samen en imago worden verwerktd dezelfde confocale sessie.
2. Meng 2,5 g / ml rood-BGT (FRET donor) met 10 g / ml ver rood-BGT (FRET acceptor) met blokkerende oplossing in een kleine plastic buis pipetteren en neer 12 keer. Deze 1: 4 molair mengsel maximaliseert de efficiëntie van FRET ^14.
3. Plaats elke dia in een bevochtigde kamer zorgvuldig bedekken elke sectie met een druppel (12 pl) van het bovenstaande mengsel en incubeer gedurende 1,5 uur bij KT.
4. Controle secties: dekking klein aantal secties met 2,5 g / ml rood-BGT (alleen donor, gelabeld C1 controles) en ook enkele secties met 10 g / ml ver-rood-BGT (alleen acceptor; gemerkte C2 controles). Incubeer deze controles als bij stap 7.3.
5. Was glijdt 3 x 10 min in PBS en monteren in-glycerol gebaseerde, fade-weerstand montage medium (zie stap 3.12).
6. Voeren bemonstering van eindplaten als in stap 6.7. De fluorescentie van de donor en acceptor dienen perfect op elkaar gelokaliseerd op eindplaten door de willekeurige binding van de fluorescerende moleculen BGT.
7. Controle beelden: Met behulp van de 40x objectief en lage laservermogen optimaliseren redBGT gain en offset niveau instellingen voor eindplaten uit een controle dia C1. Optimaliseer ver-redBGT gain en offset niveaus voor eindplaten van controle dia C2. Bevestigen de afwezigheid van fluorescentie doorbloeding.
8. Zonder wijziging van het laservermogen, winnen of offset-niveau-instellingen te verplaatsen naar de experimentele dia's en het verzamelen van beelden (pre-photobleach) voor zowel fluorescentie kanalen.
9. Selectief photobleach de ver-rode-BGT over een gedeelte van een eindplaat van inzoomen het scangebied dan scannen 10 maal met de 633 nm laser bij 100% vermogen. De fluorescentie in het gescande gebied moet gedimd worden.
10. Reset het laservermogen en zoom en het verzamelen van post-bleach beelden op beide fluorescerende kanalen met de confocale instellingen op 7,7 vastgesteld.
11. Bereken de FRET efficiëntie (E) van de procentuele stijging van de donor (rood-BGT) fluorescentie na photobleach van de acceptor (ver-rood-BGT) volgens de volgende formule *:
    
    * Voor alle situaties waarin de fluorescentie van de donor vergroot na fotobleken de acceptor.

Resultaten

Meting van Synaptic Area op de NMJ

Elk geraamde gebied vertrouwt op de tekening van een grens aan de mate van synaptische specialisaties definiëren. Bij gezonde jonge volwassen spieren moeten NMJ beelden goed gedefinieerde grenzen voor zowel AChR en synaptofysine kleuring (Figuur 2A en B) weer te geven. Fluorescentie-intensiteit voor zowel AChR en synaptofysine stijgt scherp aan de grens tussen de peri-synaptische en synaptische gedeelte van...

Discussie

De hier beschreven protocollen hebben ons in staat om betrouwbaar te meten en te kwantificeren veranderingen in de eigenschappen van de NMJ in een heel scala van voorwaarden, met inbegrip van de normale veroudering en de ziekte van staten. De beschreven voor en methoden geconfronteerd NMJ beelden kunnen de onderzoekers het gebied van pre- en postsynaptische specialisaties en het gebied van de synaptische overlap / uitlijning te vergelijken. Het vergelijken van de relatieve intensiteit van pre- en postsynaptische eiwitte...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Scanning confocal microscope	Leica	DM 2000 met  TCS SP2 systeem	De meeste scanning confocal microscopen zouden geschikt moeten zijn.
	Zeiss	LSM 510 Meta
	Leica	SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (rood-BGT)	Life technologies	B35451	Gebruikt voor het labelen van AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (ver-rood-BGT)	Life technologies	B35450	Ver rood fluorescentie: nauwelijks zichtbaar door het oculaire
konijn anti-synaptophysin	Life technologies	18-0130	Verschillende batches van primaire antilichamen verschillen in effectieve werkverdunning
FITC-anti-rapsyn mab1234	Milipore	FCMAB134F	Monoklonaal antilichaam geconjugeerd aan FITC
FITC-donkey anti-konijn IgG	Jackson	711-095-152	Polyklonale secundaire antilichamen kunnen in kwaliteit variëren volgens bron en batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.)	ProSciTech	IA018	Cryostat-inbeddingsmatrix voor het invriezen  spieren
DABCO	Sigma	10981	Montagemedium dat het fotobleken van fluoroforen vertraagt