Methode voor de evaluatie van de effecten van een golflengtebereik en intensiteiten van Rood / nabij-infrarood Lichttherapie op oxidatieve stress In Vitro

Samenvatting

Niet-coherent xenonlicht werd door smalbandige interferentie en neutrale dichtheidsfilters geleid om licht met verschillende golflengten en intensiteit aan gekweekte cellen te leveren. Dit protocol werd gebruikt om de effecten van rood/nabij-infrarood lichttherapie op de productie van reactieve soorten in vitro te beoordelen: er werden geen effecten waargenomen met de geteste parameters.

Samenvatting

Rood / nabij-infrarood licht therapie (R / NIR-LT), laser of licht emitterende diode (LED) afgeleverd, verbetert de functionele en morfologische resultaten bij verschillende centraal zenuwstelsel letsels in vivo, waarschijnlijk door het verminderen van oxidatieve stress. Echter, zijn effecten van R / NIR-LT op oxidatieve stress is aangetoond variëren naargelang de golflengte of sterkte van de straling. Studies behandeling parameters te vergelijken ontbreken, door het ontbreken van commercieel beschikbare apparaten die meerdere golflengtes of intensiteiten, geschikt voor high-throughput in vitro optimalisatie studies leveren. Dit protocol beschrijft een techniek voor de levering van licht bij verschillende golflengten en intensiteiten therapeutische doses die voor een bepaalde traumamodel optimaliseren. Onze hypothese was dat een werkwijze voor het afgeven licht, waarbij golflengte en intensiteit parameters eenvoudig kunnen worden veranderd, kan bepaling van een optimale dosis van R / NIR-LT voor het verminderen reactieve zuurstof species bevorderen(ROS) in vitro.

Niet-coherente Xenon licht werd gefilterd door smalband interferentie filters aan variërende golflengten (centrum golflengtes van 440, 550, 670 en 810nm) en invloeden te leveren (8,5 x 10 ^-3 tot 3,8 x 10 ^-1 J / ^cm2) van het licht gekweekte cellen. Lichtopbrengst van het apparaat werd gekalibreerd om therapeutisch relevante, gelijk quantale doses van licht uitzenden bij elke golflengte. Reactieve soorten werden gedetecteerd in glutamaat gewezen cellen behandeld met het licht, met DCFH-DA en H ₂ O ₂ fluorescente kleurstoffen.

We succesvol afgeleverd licht bij diverse fysiologisch en therapeutisch relevante golflengten en intensiteiten gekweekte cellen blootgesteld aan glutamaat als een model van CNS letsel. Hoewel de invloeden van R / NIR-LT gebruikt in de onderhavige studie geen effect op ROS geproduceerd door de gekweekte cellen te oefenen, de wijze van licht levering voor andere systEMS waaronder geïsoleerde mitochondria of meer fysiologisch relevante organotypische slice cultuur modellen, en kan worden gebruikt om effecten op verschillende uitkomstmaten van oxidatief metabolisme te beoordelen.

Inleiding

Reactieve zuurstof species (ROS) zijn vereist voor verschillende signaaltransductieroutes en normale reacties van cellulair metabolisme, waaronder neuroprotectie ^1. Wanneer echter endogene antioxidant mechanisme in staat zijn de productie van ROS controleren kunnen cellen bezwijken oxidatieve stress ^2,3. Na letsel aan het CZS, zijn de stijgingen van de aanwezigheid van ROS en oxidatieve stress gedacht een belangrijke rol in de progressie van schade ^4,5 spelen. Ondanks het grote aantal strategieën voor het verzwakken van oxidatieve stress die ervan zijn er nog geen volledig effectief klinisch relevante anti-oxidant strategieën voor het verzwakken ROS productie en geassocieerde oxidatieve stress in klinisch gebruik na neurotrauma ^6. Daarom is de demping van oxidatieve stress blijft een belangrijk doel voor therapeutische interventie ^7.

Verbeteringen volgening R / NIR-LT gemeld bij diverse verwondingen en ziekten waaronder vermindering cardiale infarctgrootte, nier- en hepatische complicaties bij diabetes, retinale degeneratie, CNS letsel en beroerte ^8, bijvoorbeeld door het verminderen van oxidatieve stress. Met bijzondere aandacht voor CNS letsel, hebben preklinische studies van werkzaamheid van 670nm licht goede effecten in modellen van retinale degeneratie ^9-11, dwarslaesie ^12, neuronale dood ¹³ getoond. Klinische studies zijn uitgevoerd voor de droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie en zijn momenteel aan de gang voor een beroerte ^14, maar de uitkomsten van deze onderzoeken niet lijken veelbelovend, misschien te wijten aan een gebrek aan effectieve behandeling in dienst parameters ^15. Als zodanig R / NIR-LT niet wijd goedgekeurd als onderdeel van de normale klinische praktijk in neurotrauma, ondanks een gemakkelijk toe te dienen, niet-invasieve en relatief goedkope behandeling. Belemmeringen voor de klinische vertaling verschillende ontbreken van een clvroeg begreep werkingsmechanisme en het ontbreken van een gestandaardiseerd effectieve behandeling protocol ^16,17. Huidige literatuur over lichttherapie blijkt dat er een overvloed aan variatie in de behandeling parameters met betrekking tot de bestraling bronnen (LED of laser), golflengte (bijvoorbeeld 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), totale dosis (joules van bestraling / oppervlakte-eenheid), de duur (belichtingstijd), timing (pre- of post- belediging), behandeling frequentie en wijze van levering (puls of continue) ^8. De variabiliteit in behandeling parameters tussen studies maakt vergelijking moeilijk en heeft bijgedragen aan de scepsis ten aanzien van de werkzaamheid ^16.

Daarom wordt de optimalisatie van R / NIR-LT duidelijk vereist, met celkweek systemen in staat om de high-throughput screening mechanisme nodig om de meerdere variabelen te vergelijken bieden. Er zijn echter weinig in de handel verkrijgbaar verlichting systemen die voldoende flexibiliteit en controle over wa kan biedenvelength en intensiteit van dergelijke optimalisatie experimenten. Commercieel verkrijgbare LED inrichtingen algemeen niet in staat om meerdere golflengten of intensiteiten, waardoor onderzoekers gebruik meerdere LED-inrichtingen van verschillende fabrikanten, die kunnen variëren niet alleen de intensiteit leveren, maar ook het spectrum van de golflengte van het uitgestraalde licht. We hebben dit probleem aangepakt door het gebruik van een breedband Xenon lichtbron gefilterd door smalbandinterferentie filters, waardoor een gebied van golflengten en invloeden van licht genereren, waardoor afsluiten, nauwkeurige regeling van de parameters van R / NIR-LT.

Het is belangrijk op te merken dat de therapeutische dosis van de behandeling wordt bepaald door het aantal fotonen interactie met de photoacceptor (chromofoor), die, in het geval van R / NIR-LT is gepostuleerd om cytochroom c oxidase (COX) ^18. Foton energie geleverd varieert met de golflengte; betekent gelijke doses van energie bij verschillende golflengten zal comgewaardeerde verschillende aantallen fotonen. Daarom is het licht uitgezonden door de inrichting werd geijkt met een gelijk aantal fotonen uitzenden voor elk van de gekozen golflengten te testen. We hebben een systeem dat kan worden gebruikt om R / NIR-LT leveren tegen een gebied van golflengten en intensiteiten cellen in vitro ontwikkelde en de mogelijkheid aangetoond om de effecten van de geleverde R / NIR-LT op ROS productie in cellen blootgesteld meten glutamaat stress.

Protocol

1. Optische Calibration: Meten Light Output

1. Aan het licht leveringapparaat bereiden, sluit een lichtbron breedband (bv Xenon of wolfraam lamp) op een geschikte voeding. Plaats een collimatorlens voor de lichtbron een gecollimeerde lichtbundel te produceren. Leid de licht door een vloeistof warmtefilter de meeste warmte uit de lichtbundel te verwijderen. Afhankelijk van de toepassing, de focus van de gerichte lichtstraal op naar de ingang opening van een vloeistof lichtgeleider, die voorziet in meer flexibele levering van het licht (bijv., In een incubator).
2. Aan het andere uiteinde van het vloeibare lichtgeleider achtereenvolgens een tweede collimatorlens en een houder voor interferentie en grijsfilters. Controleer dat deze regeling levert een gelijkmatig verlichte plek van het licht van de gewenste golfgebied en intensiteit.
   Opmerking: De afstand tussen het uiteinde van de lichtgeleider en het monstervlak wellicht afhankelijkhet gebied dat moet worden verlicht, maar vergeet dat naarmate de afstand tot het einde van de lichtgeleider toeneemt, zal de lichtintensiteit afnemen. In de onderhavige studie, deze afstand is 14 cm en vormt een balk dwarsdoorsnede die gelijkmatig verlicht een 3x3 putruimte op een 96-well plaat.
3. Zorg ervoor dat strooilicht van de lamp en de bijbehorende optische componenten niet in staat is om het monster te bereiken.
4. Zet de waterkoeler voor de vloeibare hitte filter en zorgen voor uitwisseling van water door het filter jas. Zet de lamp voedingsbron en wacht minstens 5 minuten voor de breedband-lichtbron te stabiliseren. Opmerking: Het gebruik van de waterkoeler moet oververhitting van het apparaat te voorkomen.
5. Selecteer een smalbandinterferentie filter (gewoonlijk beschreven door de centrale golflengte, piek transmittantie en breedte op halve hoogte (FWHM) bandbreedte) om het gewenste golfgebied van verlichting genereren. Opmerking: de smalbandige interferentiefilters gebruikt in de huidige studie werden 442 nm, 550 nm, 671 nm en 810 nm.
6. Meet de door de lamp op het gebied waar het monster tijdens de behandeling te worden gepositioneerd licht. Meet licht met behulp van een gekalibreerde bestralingssterkte probe (cosinus collector) aangesloten aan een spectroradiometer behulp correctheid software volgens de instructies van de fabrikant.
7. Gebruik grijsfilters om de lichtintensiteit te passen totdat het gewenste resultaat wordt verkregen. Opmerking: In de huidige studie, wordt de intensiteit van het licht dat door elke interferentie filter ingesteld tot een gelijke quantale uitgang te geven aan elk van de vier behandeling golfgebied. Het is belangrijk om de kalibratie regelmatig, zoals het lampvermogen wordt gewijzigd.
   Opmerking: Na de set-up van het apparaat, de cellen zijn klaar om te worden verlicht Figuur 1 is een weergave van het licht levering apparaat gebruikt in de huidige studie..

Figuur 1. Beeld van het licht leveringapparaat. Illustrated zijn het licht energiebron, xenon lamp met behuizing, collimatielens, waterfilter, entree diafragma, vloeibare lichtgeleider, tweede collimatielens, filterhouder, behandeling frame en mat zwarte kaart. Merk op dat de smalbandige golflengte en intensiteit filters niet worden getoond.

2. Celbereiding

1. De beschreven R / NIR-LT levering methode kan worden toegepast op elk type cel of in vitro modelsysteem; als zodanig de volgende beschrijvingen van celcultuur zijn algemeen, met behulp van gevestigde technieken om cultuur feochromocytoom (PC12), Müller (RMC1) en primaire gemengde retinale cellen.
2. Voorafgaand aan de cel zaaien voor lichte behandeling en oxidatieve stress test, cultuur vereeuwigd cellen in hun respectieve groeimedia die geschikte supplementen (bijv., FBS, antibiotica) in T75 flasks tot 70-80% samenvloeiing.
3. Maak geïmmortaliseerde cellen van T75 kolven, volgens de methode geschikt is voor het celtype te testen bv., Trypsine. Indien nodig, alvorens het zaaien van cellen in 96-well testplaten, laag putjes met 10 ug / ml poly-L-lysine gedurende 1 (bijv., Voor PC12 cellen) of 10 ug / ml poly-L-lysine voor 1u gevolgd door een O / N incubatie met 10 ug / ml laminine (bijv., voor gemengd retinale cellen).
4. Centrifugeer cellen eventueel verzamelen (bijv., 3 min bij 405 xg gedurende PC12 cellen of 10 minuten bij 218 xg gedurende RMC1 cellen), verwijder het supernatant en resuspendeer in 8 ml passende celkweekmedium.
5. Als gemengd retinale cellen worden gebruikt, te bereiden van P0-5 neonatale rat pups door enzymatische vertering (papaïne) volgens de vastgestelde procedures ¹⁹
6. Tel het aantal levensvatbare cellen exclusief 0,4% (w / v) trypan blauw kleurstof met behulp van een hemocytometer.
7. Pas celdichtheid such dat cellen ongeveer 70-80% samenvloeiing zal zijn na 24 of 48 uur in de cultuur. (Voor PC12 cellen het zaaien dichtheid 4,0 x 10 ⁵ levensvatbare cellen / ml voor RMC1 cellen is 2,5 x 10 ⁵ levensvatbare cellen / ml en gemengd retinale cellen is 8 x 10 ⁵ levensvatbare cellen / ml). Na toevoeging cellen ofwel helder of zwarte 96-well platen (gebruikt voor de H ₂ O ₂ respectievelijk DCFH-DA-test) in 100 pl geschikte groeimedia, laat de plaat zitten op een vlakke ondergrond bij 37 ° C, 5 % _CO2 (of alle omstandigheden geschikt zijn voor het specifieke celtype) gedurende ten minste 24 uur om celhechting mogelijk.
8. Kweekcellen in groeimedia in de juiste 96 putjes schalen tot ze 70-80% confluent (24 voor PC12 en RMC1 cellen 48 voor gemengd retinale cellen).

3. Het toevoegen van glutamaat Stressor naar Cells

1. Bereid L-glutaminezuur mononatrium zouthydraat stressor concentraties van 0-10mm in de juiste volledige kweekruimteste cultuur media.
2. Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen en voorzichtig te wassen cellen 3 keer met PBS (PC12) of HBSS (RMC1 en gemengde retinale cellen). Na wassen, add-glutamaat bevattende media tot een totaal volume van 100 ul / putje.

4. Eerste Doseringen van Light Treatment

1. Onmiddellijk na toevoeging van glutamaat of de stressor van keuze, cellen aan het licht behandeling in de gewenste golflengtes en intensiteiten bloot door het plaatsen van onder de voorbereide licht levering apparaat. Zorg ervoor dat u de quantale uitgang van de lichtbundel met behulp van de gevestigde combinaties van grijsfilters, afhankelijk van de golflengte wordt toegediend veranderen.
   Opmerking: In de huidige experimenten cellen bloot aan lichtbehandeling gedurende 3 min werd de temperatuur te handhaven door te rusten met 96 putjes op een 37 ^{° C} warmte pad. Behandeltijd kan naar behoefte worden gevarieerd.
   1. Plaats een matte zwarte kaart onder de cellen aan het licht te voorkomen als gevolg van in de aangrenzende putten in de 96-well tray toegewezen aan andere behandelingsparameters.
2. Als de behandeling wordt gewenst voor langere tijdsperioden, voeg 25 mM Hepes buffer pH van de celkweek media handhaven of idealiter plaats de inrichting en behandeling platen in een incubator met _{CO2-concentratie} geregeld tot 5% _CO2, of omstandigheden die optimaal zijn voor het specifieke celtype.
3. Na voltooiing van de lichtbehandeling, plaatst de cellen op een vlakke ondergrond en incubeer bij 37 ° C en 5% _CO2 (of alle omstandigheden optimaal zijn voor het celtype) gedurende 24 uur.
   Opmerking: Extra doseringen van R / NIR-LT kan worden toegediend zoals hierboven beschreven, zoals gewenst.

5. Definitieve Dosering van Licht Behandeling en Detectie van ROS

1. Voordat de laatste ronde van lichtbehandeling, bereid de reagentia te gebruiken voor ROS detectie. Bereid 50 mM citraatbuffer (pH 6,0), Triton X100 en H ₂ O ₂ detectiereagens werkenoplossing (1: 2: 97 verhouding van 10 mM H ₂ O ₂ detectiereagens voorraadoplossing, 10 U / ml mierikswortelperoxidase, 50 mM natriumcitraat (pH 6,0)). Bereid DCFH-DA in een eindconcentratie van 100 uM in geschikte media.
   Opmerking: DCFH-DA reagens voor PC12 cellen in RPMI media, DCFH-DA reagens voor RMC1 cellen in DMEM media. Merk op dat commercieel verkrijgbaar detectie reagentia differentiële gevoeligheid voor bepaalde ROS en reagentia moeten zorgvuldig worden gekozen om de gewenste voor individuele toepassing informatie.
2. Dien lichtbehandeling aan de cellen, zoals beschreven in stap 4.1-4.1.2. Zorg ervoor dat de cellen worden behandeld met de gewenste invloeden / golflengten van het licht.
3. Onmiddellijk na lichtbehandeling, verwijder de glutamaat-bevattende media en tweemaal wassen met geschikte buffer-oplossing (voor PC12 cellen, PBS wordt gebruikt en voor RMC1 cellen, wordt HBSS gebruikt). Voer de ROS assays op de cellen als volgt:
   1. H ₂ O ₂ assay: voeg 45 ul van 50 mM citraatbuffer (pH 6,0) en 5 pl Triton X100 aan elk van de putjes. Schud de cellen op een orbitale schudder gedurende 30 seconden en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% _CO2 gedurende 15 min. Voeg 50 ui _{H2O 2} detectie werkende oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meet fluorescentie met een plaatlezer bij een excitatiegolflengte van 530 nm en een emissiegolflengte van 480 nm.
   2. DCF test: voeg 100 ul van 100 uM oplossing van DCFH-DA aan elk van de putjes en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% _CO2. Verwijder het medium dat 100 uM DCFH-DA en wassen met geschikte bufferoplossing (zoals hierboven beschreven) tweemaal. Voeg 90 pl bufferoplossing en 10 pl Triton X100 aan elk van de putten en schud op een orbitale schudder gedurende 30 seconden voor 15 min incubatie bij 37 ° C. Meet DCF afgeleid fluorescentie met behulp van een plaat reader met een excitatie golflengte van 480 nm en een emissie wavelength van 530nm.
   3. Express ROS waarden ten opzichte van de eiwitconcentratie van cellen die overblijven in de putjes met behulp van een colorimetrische kit om eiwitconcentratie kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant met betrekking tot een standaardcurve mg proteïne berekenen.

Resultaten

De lichtopbrengst afgegeven bij een golflengte van 670 nm werd gekalibreerd met grijsfilters om cellen te bestralen met verschillende invloeden omvat een dosis van 670 nm licht eerder gebleken bij vivo (0,3 J / ^{cm2) 20} zijn. Aangezien het aantal grijsfilters voor de lichtbron vergroot, de intensiteit (W / ^m2) verlaagd, waardoor minder licht door te geven aan het doelgebied. Tabel 1 presenteert de kalibratiegegevens van 670 nm licht gegenereerd door de lichtbron voorzien van een golflengtef...

Discussie

We hebben met succes aangepast nauwkeurig en gekalibreerd licht afgiftesysteem een mechanisme voor onderzoek optimalisering van R / NIR-LT in vitro. Golflengte en intensiteitswaarden van R / NIR-LT kunnen nauwkeurig en efficiënt worden gemanipuleerd met dit systeem. We stelden vast dat de lichtbehandeling van de cellen niet tot celdood, alhoewel ROS niet golflengten en doseringen geleverd verlaagd, in de celtypen getest. De maximale bereikt door het huidige systeem op 670nm (20.11W / m ²⁾ intensiteit...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Zeer intense lichtbron, kijk niet direct in de lamp. Zorg voor voldoende koeling van de lamp terwijl deze aan staat
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxiciteit, draag handschoenen bij het hanteren.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot en bewaar bij -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot en bewaar bij -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Opwarmen tot 37 °C in waterbad voor gebruik
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab apparatuur
Centrifuge	Standard lab apparatuur
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B