Nutrient verordening door continue toevoer voor grootschalige uitbreiding van zoogdiercellen in sferoïden

Samenvatting

Voedingsregulatie met behulp van continu aangepaste groeivoeding verbetert de groeisnelheid van zoogdiercelsferoïden in vergelijking met intermitterende batchvoeding voor culturen in geroerde suspensiebioreactoren. Deze studie toont de methoden die nodig zijn voor het vestigen van eenvoudige aangepaste voedingsculturen.

Samenvatting

In deze demonstratie werden sfëroïden gevormd uit de β-TC6 insulinoomcellijn gekweekt als een model voor de productie van een zoogdier-eilandcelproduct om aan te tonen hoe het reguleren van nutriëntniveaus de celopbrengsten kan verbeteren. In eerdere studies bevorderden bioreactoren verhoogde kweekvolumes ten opzichte van statische culturen, maar er werd geen toename in celopbrengsten waargenomen. Beperkingen in belangrijke nutriënten zoals glucose, die tussen batchvoedingen werden geconsumeerd, kunnen leiden tot beperkingen in celexpansie. Grote schommelingen in glucoseniveaus werden waargenomen, ondanks de toename van glucoseconcentraties in het medium. Het gebruik van continue voedingssystemen elimineerde schommelingen in glucoseniveaus en verbeterde de celgroeisnelheden in vergelijking met batch-gevoede statische en SSB-kweekmethoden. Extra toenames in groeisnelheden werden waargenomen door de voedingssnelheid aan te passen op basis van berekende nutriëntenconsumptie, wat het mogelijk maakte om fysiologische glucose gedurende drie weken in cultuur te handhaven. Deze methode kan ook worden aangepast voor andere celtypen.

Inleiding

Om grote aantallen levensvatbare en functionele humane cellen voor transplantatie genereren regeling van de kweekomstandigheden is noodzakelijk. Uitputting van voedingsstoffen, samen met de opbouw van metabole afval zijn belangrijke bijdrage aan de veroudering en metabole veranderingen die de kwaliteit van de cel product ¹ te verminderen ^{- 3.} Deze procedure wordt een methode om niercellenkweek zoogdieren in sferoïden met een geroerde bioreactor gecombineerd met een aangepaste snelheid perfusie toevoersysteem om glucose in een fysiologisch bereik ⁴ regelt de duur van de kweek. Ten behoeve van deze onderzoeken, werd het fysiologische bereik gedefinieerd tussen 100 en 200 mg / dl. Dezelfde werkwijzen kunnen worden gebruikt om andere voedingsstoffen en metabole afvalstoffen zoals lactaat reguleren.

Statische kweken in kleine hoeveelheden (1-30 ml) worden gewoonlijk gebruikt in de laboratorium omgeving te onderhouden en te differentiëren cellijnen experimental doeleinden. Cel passage wordt uitgevoerd met volledig medium gewenste wijzigingen regelmatig. Meest "klassieke" kweekmedium heeft een hoge glucoseconcentratie (450 mg / dl voor DMEM die in deze studies) om minder frequent mediumveranderingen zonder het risico van nutriënten beperkingen. Echter, deze batch-feeding werkwijze vereist nog steeds frequent manipulatie introduceert variabiliteit in de celomgeving, en verhoogt het risico van besmetting ^5-9. Geroerde suspensie bioreactoren (SSB) zorgen voor een betere menging en verminderde de behandeling van ^{3,10 - 20,} maar net als statische culturen, vereisen handmatige medium veranderingen die bijdragen aan potentieel schadelijke schommelingen in de voedings- en afvalproduct niveaus. Perfusie voederen van SSB culturen vermindert deze problemen door continue infusie en verwijdering van medium, maar grote veranderingen in nutriënten als gevolg van de celgroei een probleem blijven. Het gebruik van een aangepaste voeding rate uit berekeningen van nutriënten gebruik op basis van geschatte cel eisen kan de stabiele cel milieu nodig is om levensvatbaarheid van de cellen te optimaliseren te bieden en te functioneren ^21-24.

Er is een grote hoeveelheid literatuur beschrijft werkwijzen voor schaalbare SSB kweken van zoogdiercellen specifiek voor kweek en groei van pluripotente cellen ^{25 - 32,} met andere gericht op islet (beta) cellen ^17,33,34 of productie van biologische producten ^{24, 35-38.} Veel van deze onderzochte celtypen kunnen worden gekweekt in bolvormige culturen en specifieke procedures voor het celtype wordt gebruikt, moet voorafgaand aan de uitvoering van een continue toevoer systeem worden geoptimaliseerd. In deze demonstratie, werd een perfusie voederen methode die wordt gebruikt om een beta cellijn gegroeid als bolletjes in een geroerde bioreactor ³⁹ uit te breiden ^{- 43.} De werkwijze hierin beschreven is, eeneenvoudige uitvoering van het voeden van tariefaanpassingen gebaseerd op off-line glucose metingen om gerichte cultuur omstandigheden te bereiken. Aanpassen van de voeding met deze methode om handhaven van een fysiologische glucose-niveau wordt aangetoond dat het verhoogt cel opbrengsten. Zoogdiercellen afhankelijk van een belangrijke voedingsstof, glucose, energieproductie, zodat het gebruik van deze cellijn is een voorbeeld voor veel gekweekte zoogdiercellen ^44. Bovendien is deze lijn een voorbeeld van de verdere complexiteit van beta-cellen, die gevoelig zijn voor chronische hoge glucose ⁴⁵ zijn. Voor deze studie werden β-TC6 cellen mogen sferoïden in de cultuur te vormen om de gemiddelde grootte van de eilandjes van Langerhans in vivo benaderen. De perfusie bioreactorsysteem ^{17 - 19,21,46} met een voeding aangepast aan het verbruik glucose, resulteerde in het handhaven van fysiologische omstandigheden en hogere opbrengsten cel zonder veranderingen in de levensvatbaarheid.

Protocol

1. Cell Line en onderhoud

1. Verkrijgen van β-TC6 cellen (of andere gewenste hechtende zoogdiercellijn). Ter voorbereiding van de studie, cultuur, passage, worden ingevroren cellen volgens de instructies provider.

2. Monteer de Continuous voersysteem

LET OP: De continue voersysteem ontwerp in de onderstaande methode is gebaseerd op vergelijkbare systemen in de literatuur ¹⁷ beschreven ^{- 19,21,47 - 49.} Assemblage van het hier gebruikte systeem is beschreven in een eerdere publicatie ^3.

1. Het verzamelen van de componenten die nodig zijn voor het voederen systeem dat bestaat uit vijf primaire componenten: een medium reservoir, peristaltische pomp, geroerde bioreactor, afvalreservoir, en op maat ontworpen slang / sampling set.
   1. Bepaal het medium reservoir met behulp van een 1 liter glazen fles, het afvalreservoir met behulp van een 2 L glazen fles, en de stirred bioreactor met behulp van een 250 ml volume glazen reactor (off the shelf-versie).
   2. Gebruik een digitale peristaltische pomp of dergelijke pomp met een 8 kanaals opvoerhoogte tot medium-uitwisseling te controleren.
   3. Fabricage het reservoir en gewijzigde bioreactor deksels van de harde en autoclaveerbaar plastic met roestvrij stalen buis pass-through-poorten aan ventilatie door steriele filters, en zorgen voor middelgrote overdracht tussen reservoirs en bioreactoren. Als alternatief, de aankoop van gespecialiseerde deksels met stroom havens van verschillende leveranciers.
      LET OP: De bioreactor deksel kan extra doorwerking poorten voor optionele instrumentatie en monitoring sondes (bijvoorbeeld zuurstof monitor) bevatten.
   4. Bevestig een uitstroombuis (OT) vervaardigd uit poreuze glazen beluchting buizen met een gemiddelde poriegrootte van 40 urn tot 60 urn en een poriedichtheid van 40% voor het gemodificeerde SSB deksel. U kunt ook kiezen voor een ander uitstroom buis op basis van de specifieke eisen van de cultuur.
      LET OP: Kies deOT poriegrootte om enige medium en celresten te verwijderen, waardoor de cel aggregaten in de cultuur (zoals beschreven in hoofdstuk 6 en publicatie ³ voor meer informatie).
2. Monteer autoclaveerbaar perfusieslang sets van polyvinylideenfluoride (PVDF) slangconnectoren en duurzaam pompslangen. De lengte van de sectie is afhankelijk van de afstand tussen de verschillende componenten.
   LET OP: Wees extra voorzichtig bij het selecteren van buizen verscheidenheid aan duurzaamheid en betrouwbaarheid voor de lange termijn experimenten te garanderen.
3. Monteer de set uit drie delen buis: een toevoerleiding, een verspilling lijn, en een monster lijn.
   1. Monteer de toevoerleiding met behulp van twee buizen diameters (L / S 14 en L / S 13). Gebruik de L / S 14 voor het primaire buizenstelsel dat de afstand van de bioreactor aan het medium reservoir uitstrekken, en plaats een kort stuk L / S 13 in het midden van de buislengte van het pompgedeelte met de juiste PVDF adapters.
   2. Gebruik Standard PVDF-slang weerhaken Tubing adapters twee stukken van L / S 14 buis mee aan weerszijden van de kortere pompsectie (L / S 13) buizen.
      Opmerking: Als alternatief kan de gehele buislengte kunnen kleinere diameter L / S 13 buizen, en de gehele buislengte kan worden vervangen als de pomp-gedeelte integriteit is betrokken.
4. Monteer de tweede buis sectie voor afvalverwijdering gebruik van grotere diameter (L / S 16) buizen en plaats een kort gedeelte van L / S 14 slang in het midden voor het verpompen sectie. Dit gebeurt op dezelfde manier als de toevoerleiding samenstel behulp PVDF-slang weerhaken adapters of alternatief toepassing van een continue lengte van de pompslang gewenste grootte en vervangen indien nodig.
   LET OP: Als dezelfde pomp en de kop van de pomp worden gebruikt voor de voeding circuit en het afval circuit, moet het pompgedeelte van de afvalverwijdering buis lijnen een grotere diameter dan het pompgedeelte van de voeding lijn. Dit zorgt ervoor dat de verwijdering pompsnelheid sneller is dan de toevoersnelheid en de krachtige voorkomenIal voor grote veranderingen in het kweekvolume, en het risico van overstroming te verminderen.
5. Monteer het laatste onderdeel van de buis set: een monster collectie montage.
   1. Deze procedure beschrijft een aangepaste samengestelde bemonstering poort systeem; alternatief kan een steriele bemonsteringspoort verkrijgbaar van verschillende leveranciers.
   2. Construct de set van drie korte (~ 6 cm) L / S 14 buisstukken onderling verbonden met een T-type PVDF connector en twee kleine slangklemmen op twee van de buisstukken.
   3. Bevestig een steriel gasfilter gas ventileren één van de geklemde lengte, en de andere wordt gebruikt voor het aansluiten van een steriele bemonstering injectiespuit (steriel gasfilters moet in een biologische veiligheidskast worden toegevoegd na sterilisatie zoveel steriele filters zijn niet autoclaveerbaar).
   4. Sluit het derde uiteinde aan een roestvrij stalen monster connector bevestigd aan het deksel van de bioreactor.
   5. Autoclaaf de bemonstering assemblage terwijl verbonden met de bioreactor voorafgaand aan het beginhet experiment (zie onderstaande stap 3).
   6. Gebruik deze assemblage tot steriele monsters te verzamelen van de bioreactor als nodig is, zonder verstoring van de continuous feed proces.

3. autoclaaf Alle Materialen

1. Bereid alle bioreactor componenten autoclaaf sterilisatie.
2. Verzamel individuele componenten voor sterilisatie. Medium en afval reservoirs (samengesteld uit stap 2.1.1), 250 ml centrifugekolf (samengesteld uit 2.1.1), nodig aangepast deksels (samengesteld uit 2.1.3), uitstroom buis (in 2.1.4 beschreven), drie slangen sets ( geassembleerd in secties 2.2 through2.5), uitstroom buis (als dat nodig is voor continue voeding).
   1. Monteer centrifugekolf met alle onderdelen en zorg ervoor dat de uitstroom buis stevig bevestigd in de spinner fles (beschreven in paragraaf 2.1.4), en bevestig de aangepaste geassembleerde bemonsteringspoort (paragraaf 2.5), of andere bemonstering poort naar de top van het deksel .
   2. Wikkel de gehele spinner kolf assemblage met autoclave wrap materiaal, en de autoclaaf met vermelding van tape. Zorg ervoor dat de wrap luchtdicht. OPMERKING: aluminiumfolie of soortgelijk materiaal kan worden gebruikt om de individuele einden van elke toegangsopening in de bioreactor deksel betrekking tot steriliteit van de connector behouden / eindigt wanneer uitpakken en wanneer niet aangesloten op de slangensets in de couveuse.
   3. Monteer de gewijzigde deksels van het medium en afval reservoirs en vervolgens hechten aan de respectievelijke glazen flessen. Bedek ze met behulp van aluminiumfolie en autoclaaf aangeeft tape.
   4. Individueel wikkel de buis sets (sectie 2,2-2,5) met autoclaaf wrap en tape om te helpen bij de eindmontage. Aluminiumfolie of soortgelijk materiaal kan worden gebruikt om de individuele einden van elke set op steriliteit van de connector behouden slanghoes / eindigt wanneer uitpakken.
   5. Autoclaaf allemaal verpakt items met behulp van een standaard droge autoclaaf cyclus (bijv, "Gravity" instelling met ~ 15 psi bij 121 ° C gedurende 30 minuten of meer).
      LET OP: Wees niet steriel hechtenfilters voorafgaand aan autoclaveren uitdrukkelijke bevestiging te autoclaaf veilig.

4. Sferoïde Formation

OPMERKING: Deze techniek is vergelijkbaar met die in de literatuur ¹⁷ beschreven ^{- 19,21,50 - 52} andere zoogdierlijke celkweken. Alle procedures na sterilisatie worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap en met steriele handschoenen steriele omstandigheden voor celkweek handhaven.

1. Voor alle omstandigheden, de cultuur en uit te breiden β-TC6 cellen in standaard hechtende culturen (beschreven door vendor) totdat voldoende cel hoeveelheden worden verkregen om het gewenste aantal bioreactoren zaad.
   1. Monteer de continue toevoer bioreactor met uitlaatbuis zoals getoond in figuur 1 en punt 2 beschreven, en sluit bemonsteringspoort steekproeven deksel. LET OP: De uitstroom buis en bemonstering poort assemblage moeten worden toegevoegd aan de bioreactof continue toevoer vóór sferoïde vorming en worden uitgerukt uit het kweekmedium tot continue toediening wordt gestart.
   2. Steriliseer de gewijzigde SSB montage door autoclaaf (beschreven in hoofdstuk 3).
   3. Bevestig steriele vents (0,22 pm of kleiner steriele filters) naar de juiste locaties op de deksels van de spinner kolf, en middelgrote en afval vaten.
      Opmerking: Dit is belangrijk dampblokkering voorkomen en gasuitwisseling tussen de incubator _(5% CO2) omgeving en de bioreactor mogelijk. De gasuitwisseling is noodzakelijk om de juiste pH te handhaven bij het gebruik van bicarbonaat gebufferde media.
2. Verzamel de cellen door behandeling met trypsine zachte behulp 0,25% (w / v) trypsine 0,53 mM EDTA oplossing bij kamertemperatuur geholpen door mechanisch roeren gedurende 2-3 min, en zaden in bioreactoren met een dichtheid van ongeveer 1,3 x 10 ⁶ cellen / ml in 200 ml kweekmedium.
   1. Verplaats aangewezen kolven uit de incubator enin een Bio-Safety kast.
      OPMERKING: Alle celkweek en manipulaties moet worden gedaan in een Bio-Safety kabinet met de juiste steriele techniek.
   2. Verwijder kweekmedium uit kolven door opzuigen.
   3. Was de cellen door pipetteren 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (zonder Ca ⁺⁺ en Mg ^++), in kolf en spoel in de cellen op het oppervlak, en zuig het PBS.
   4. Voeg 3 ml trypsine-EDTA oplossing aan elke kolf die wordt verzameld (typisch ongeveer 10 x 175 ^cm2 T-kolven).
   5. Sta geoogste cellen te incuberen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 min in biologische veiligheidskast.
   6. Schud voorzichtig met de hand om cellen los te maken van het oppervlak kolf en laat cellen door toevoeging van 6 ml kweekmedium (met serum) aan de kolf, en breng de cellen om een ​​50 ml buis. Wanneer een 50 ml buis vol, gebruik een andere 50 ml buis totdat alle benodigde cellen werden verzameld (ongeveer een 50 ml buis nodig voor elke 5 T-175 kolvenverzameld).
   7. Voorzichtig centrifuge (ongeveer 50 x zwaartekracht) de verzamelde celsuspensies om de cellen te pelleteren.
   8. Zuig het medium waardoor de resterende pellet intact.
   9. Verzamel alle cellen in een enkele buis door het opnieuw suspenderen van de pellets in kweekmedium (met serum) met een pipet, en de overdracht van deze korrels in dezelfde buis.
   10. Tel de celdichtheid met een standaard hemocytometer met trypan blauw kleuring zoals beschreven in de literatuur ^53.
   11. Voeg gewenste totale aantal cellen om steriele SSB voor elke aandoening (1,3 x 10 ⁶ cellen / ml was de beoogde start celdichtheden voor deze demonstratie).
   12. voeg medium (met de gewenste glucoseconcentratie, in dit geval gebruik gemaakt medium glucoseniveaus in het fysiologische bereik) SSB met een pipet om de gewenste totale kweekvolume (200 ml cultuurvolume werd gebruikt voor deze studie) te bereiken.
       LET OP: Voor deze continu gevoed SSB bestudeert de cu ltures werden geënt met een aangepaste "laag glucosegehalte" versie van het kweekmedium (100 mg / dl). Hierdoor konden de kweken beginnen bij het gewenste doel glucoseconcentratie dan beginnen met een "hoog glucosegehalte" medium en wachten op de glucose consumptie de glucoseniveaus afvoeren in het fysiologische bereik voeding te beginnen. Alle andere drager voor het toevoeren van deze studies gebruikt de standaard "hoog glucosegehalte" medium (500 mg / dl).
   13. Beweeg SSB met cellen aan een roer plaat in een celkweek incubator.
3. Kweekcellen in de bioreactoren zonder voeding voor 3 dagen bij 37 ° C met _5% CO2, 100% relatieve vochtigheid, en een roersnelheid van 70 rpm om sferoïden te vormen.
   LET OP: Geen significante proliferatie moet gedurende de drie dagen bolvormige formatie worden ingelast.
4. Na sferoïde formatie, verdeel sferoïden onder bioreactoren met de gewenste kweekomstandigheden.

le "> 5. continue toevoer Cultuur en Adjusted Feed Rate

1. Autoclaaf of gas steriliseren alle componenten en assembleren in een biologisch veiligheidskabinet met behulp van steriele technieken (stappen 2-4).
2. Na sferoïde formatie, verwijder de SSB uit de incubator en monteren van de componenten voor de continue voersysteem in een biologisch veiligheidskabinet.
   1. Vul eerst de verse medium reservoir met de gewenste cultuur medium, en sluit vervolgens aan één zijde van de toevoerleiding. Ook voor zorgen dat het vers medium reservoir goed geventileerd met een steriele filter.
   2. Sluit het ene uiteinde van de toevoerleiding naar de voeding inlaatpoort van de bioreactor in een steriele wijze. Een steriele filter moet worden geïnstalleerd tussen de toevoerleiding en de bioreactor inlaatpoort om het medium te filteren voordat het de bioreactor binnendringt.
   3. Sluit het afval lijn naar de bioreactor uitstroom buis en de medium afvalreservoir, en ervoor te zorgen dat het afval reservoir goed geventileerd met een sterielee filter.
3. Verplaats de montage uit de biologische veiligheid kabinet (dit zal waarschijnlijk twee mensen voor nodig zijn om alle schepen en leidingen te dragen), en zet alle onderdelen uit voor de lange termijn cultuur.
   1. Zet de SSB op het roer plaat in de incubator met dezelfde kweek parameters sferoïde formatie (37 ° C, _5% CO2, 100% vochtigheid en 70 rpm). Opmerking: Het kan nodig zijn de buissegmenten van de bioreactor tijdelijk los als de lijnen moet lopen door gaten in de zijkant van de incubator plaats via de afdichting van de deur. Dit kan op een aseptische wijze worden uitgevoerd door het wikkelen van de uiteinden van de buis toestellen met aluminiumfolie voorafgaand aan autoclavering (stap 3) en wachten om de bioreactor zijde van de aan- en afvoersysteem buissecties bevestigen totdat de bioreactor in de couveuse. De metrolijnen kunnen worden ingevoerd, en de aluminium folie kan worden verwijderd in de couveuse en snel aan de bioreactor.
   2. Run resterende uiteinden van de slang sets (die niet is aangesloten op de bioreactor deksel) via de incubator toegangspoort (pass-through), of door middel van een inkeping in de incubator deur pakking.
   3. Buiten de incubator (in een nabijgelegen bioveiligheid kast indien mogelijk), snel verbinding van de toevoerleiding naar de vers medium reservoir, en het afval lijn naar het medium afvalreservoir, en ervoor te zorgen dat het afval reservoir goed geventileerd met een steriele filter. LET OP: Om dit te doen in een aseptische wijze, verwijder het aluminium folie van de slangen en vat op en sluit aan de respectieve schepen zo snel mogelijk (vooral als dit verband moet worden gedaan buiten de bioveiligheid kast).
   4. Zet vers medium reservoir (gevuld met de gewenste toevoer medium) in de omgeving van mini-koelkast. Controleer of de aan- en afvoersysteem lijnen kunnen de incubator verlaten en de koelkast zonder dat dit de deuren op elke van sluiten. Het is ook van cruciaal belang dat het diervoeder lines worden niet geknepen gesloten door de deuren van zowel de koelkast of de couveuse.
      OPMERKING: Het medium gebruikt voor deze studies was de standaard hoog glucosegehalte (500 mg / dl) kweekmedium aanbevolen door de leverancier voor dit celtype. Elke hoge glucose medium gebruikt kan worden op basis van de specifieke behoeften van het celtype wordt gekweekt. De glucoseconcentratie van het voedingsmedium redelijkerwijs hoger (2x of meer) dan de gewenste concentratie in de cultuur als het voersysteem gebaseerd op een toename van de toevoersnelheid van hoge glucosemedium adequate glucose in de kweken handhaven bij redelijke toevoersnelheden .
   5. Vervolgens kan het afval medium reservoir op de bank top worden geplaatst buiten de incubator op een gunstige locatie.
   6. Plaats vervolgens de 'pomp gedeelte "van de voeding en afval lijnen in de pomp kop zorgen voor de juiste richting, zodat de voerlijnen medium zal pompen uit de verse medium reservoir in de SSB, en het afval lijnenzal medium van de SSB en de afval medium reservoir pompen.
4. Schakel de pomp op de gewenste aanzet.
   1. Bereken de voeding met de aangepaste voeding vergelijking in de literatuur ³ en de ontvangen representatieve resultaten hieronder beschreven.
   2. Met de meest recente informatie cellen (procedure beschreven in stap 5) samen met de groei voorspelling, en het medium glucose metingen om de voedingssnelheid die nodig is om de gewenste glucoseconcentratie in de kweek te handhaven schatten.
      LET OP: De celgroei tarieven en glucose verbruik tarieven zullen moeten voorafgaand aan het doen van deze procedures te verkrijgen.
   3. Stel de pompsnelheid op basis van de berekende aanzet.
5. Herhaal de aanzet berekening en pas de pompsnelheid voor elk bemonsteringspunt (om de drie dagen voor de beschreven methode).

6. Cel Tellingen, levensvatbaarheid en glucoseconcentratie Metingen

1. Verzamelen monsters van drie dagen, of naar wens elke bioreactor.
2. Neem kweekmonsters van SSB continu kweken met de gespecialiseerde bemonsteringspoort hierboven beschreven.
   1. Het verlaten van de continu gevoed SSB in de bioreactor, bevestig een steriele injectiespuit (5 ml volume spuit werd gebruikt voor deze studies) to-un gefilterd aansluiting van de bemonstering poort.
   2. Verplaats de monsterbuis naar beneden in het kweekmedium.
   3. Ontspanschakelaars de buis gedeelte gaat naar de spuit, en de gewenste totale steekproef te trekken.
   4. Beweeg de bemonstering buis, zodat het niet meer wordt ondergedompeld in de cultuur, en blijven de spuit totdat de lucht is verwijderd.
   5. Klem de buis die de spuit-feeds en maak de spuit met het monster, en zet apart.
   6. Pre-laden van een tweede verse steriele spuit met lucht, en hechten aan de steriele filter kant van de bemonstering poort.
   7. Ontspanschakelaars de buis naar de spuit-filter kant vande bemonstering poort en zuiveren de bemonsteringspoort door voorzichtig het verdrijven van de lucht in de spuit door het steriele filter. Dit zorgt ervoor dat de bemonsteringspoort vrij van resten van het medium zal zijn.
   8. Re-klem de buis naar het filter, koppelt de steriele spuit en gooi deze weg.
3. Neem de spuit die de cel monster van de cultuur bevat, en verdrijven het in een 10 ml buis. Sub-monsters van bekende volumes kan direct vanaf deze buis worden genomen.
4. Voor celtellingen, verwijderen van een bekend volume van cellen en overbrengen naar een micro-centrifugebuis en centrifugeer zachtjes 1-2 min (ongeveer 50 x de zwaartekracht).
5. Breng de bovenstaande vloeistof over in een afzonderlijke buis voor glucosemetingen en resuspendeer de pellet met hetzelfde volume trypsine-EDTA-oplossing (0,25% (w / v) trypsine, 0,53 mM EDTA), en tel in drievoud met een standaard hemocytometer met trypan blauw kleuring zoals beschreven in de literatuur ^53.
   1. medium (met serum) toe te voegen aanhet monster voor verdunning nodig.
   2. Tel de cellen en het berekenen van de levensvatbaarheid van de cellen door het opnemen van live (onbesmet) cellen, en dood (gekleurd) cellen onafhankelijk (levensvatbaarheid% = levende cellen / totaal cellen).
6. Meet medium glucose in drievoud met behulp van een bloedglucosemeter en single use test-strips.
   1. Neem glucose metingen zoals beschreven in de instructies glucose meter substitueren het kweekmedium voor bloed.
   2. Dompel de teststrip in het medium te testen (verzameld van telling monsters hierboven), en herhaal voor het gewenste aantal herhalingen (drie herhalingen wordt aanbevolen).
   3. Test zowel de vers medium en afval medium voor glucose concentraties.
      OPMERKING: Bij sommige meters metingen lager dan 20 mg / dl (detecteerbare drempel van de meter) kan worden waargenomen als een fout in de meter output.

7. Sferoïde bezinkingssnelheid Metingen

1. Dat CEL waarborgenl clusters worden niet verwijderd door het continu voeden systeem, het meten van de afwikkeling snelheid van β-TC6 bolletjes door het observeren van hun sedimentatie in een grote diameter plastic pipet.
2. Cultuur β-TC6 cellen SSB bioreactoren tot sferoïden gevormd zoals hierboven beschreven.
3. Na 3 dagen van cultuur, neem 30 ml monsters van de bolvormige schorsing en plaats in een 50 ml buis.
4. Voorzichtig pipet op en neer met een brede diameter 25 ml pipet gelijkmatig in suspensie te verdelen, dan stoppen pipetteren met de suspensie bij een bekend niveau in de pipet (bijvoorbeeld 20 ml mark), en tekent een keer voor de sferoïden te vestigen 5 cm.
5. Herhaal deze procedure vaak genoeg om statistische betrouwbaarheid te bereiken (meestal n> 3).
   LET OP: Voor biologische studies, ap waarde van minder dan 0,05 wordt als statistisch significant te zijn bij het vergelijken van de metingen. De standaardafwijking van het gemiddelde werd gebruikt voor de rapportage fouten, en de tweezijdige-un gepaarde student-t-testwerd gebruikt om de omstandigheden voor de gepresenteerde gegevens te vergelijken.

Resultaten

Medium Glucose Levels en schommelingen beperken celexpansie in Standard SSB Cultures

Glucose niveaus fluctueren in statische culturen en SSB culturen over de hele kweekperiode ^3. Deze fluctuaties intensiveren met toenemend aantal cellen tijdens de 21-daagse kweekperiode en was bijna identiek in zowel statische als SSB culturen. Deze waarnemingen worden gepresenteerd in onze vorige publicatie ^3. De glucose kan super-fysiologische voor de duur van de kwee...

Discussie

Genereren van zoogdiercellen voor de productie van biologische agentia en celtherapie vereist cultuur en bewaking van zoogdiercellen in grote ^55-58. Verder zijn deze toepassingen vereisen gedefinieerd en gevalideerd kweekomstandigheden. Gewoon verhoging van cellen met behulp onderzoekstechnologieën niet al deze eisen voldoen. Handmatige medium veranderingen veroorzaken schommelingen in voedingsstoffen en ophoping van afvalstoffen te verminderen cel kwaliteit, leefbaarheid en de opbrengst...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
β TC-6 Cellen	ATCC, Manassas, VA	CRL-11506	Muis Insulinoom cellijn (adhesief celtype)
DPBS Zonder Ca, Zonder Mg	Invitrogen, Carlsbad, CA	14190-144	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
Dulbecco's Aangepast Eagles Medium	Invitrogen, Carlsbad, CA		Zie hieronder voor productnummers
DMEM Hoog Glucose (500 mM)	Invitrogen, Carlsbad, CA	11965-092	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
DMEM Laag Glucose (100 mM)	Invitrogen, Carlsbad, CA	11885-084	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (let op dat dit medium al pyruvaat bevat)
L-glutamine	Invitrogen, Carlsbad, CA	25030081	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
Natrium Pyruvaat	Invitrogen, Carlsbad, CA	11360070	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
Hitte Geïnactiveerd Porcine Serum	Gibco - Life Technologies	10082147	http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
Trypsine-EDTA	Invitrogen, Carlsbad, CA	25200056	https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
T-150 Weefselcultuur Behandelde Flessen	Corning, Corning, NY	430825	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname=
NuAire Celcultuur incubator	Princeton, MN		US Autoflow. Elke watermantel CO2 regulerende celcultuur incubator kan worden gebruikt.
Centrifuge			Sorvall RT 7 (Elke vergelijkbare tafelcentrifuge mag worden gebruikt)
Koelkast			Elke laboratoriumkoelkast kan worden gebruikt (een kleine tafelversie werd gebruikt voor deze studies)
1 L Glazen Fles	Corning, Corning, NY	1395-1L	Elke leverancier kan worden gebruikt. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname=
2 L Glazen Fles	Corning, Corning, NY	1395-2L	Elke leverancier kan worden gebruikt
250 ml geroerde bioreactoren	Corning, Corning, NY	4500-250	http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname=
Rolplaat	Fisher Scientific	11-496-104A	Elke incubatorveilige roerplaat kan worden gebruikt, elke leverancier
Weefselcultuur Schotels 100 mm Diameter	Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)	1256598	Elke leverancier kan worden gebruikt (besteld via Fisher Sci)
FALCON 50 ml Conische Buizen	Falcon, San Jose, CA	1256598	Elke leverancier kan worden gebruikt
Delran Plastic Gebruikt voor Aangepaste Onderdelen	McMaster Carr	Various	Elk materiaal naar keuze kan worden gebruikt, maar Deran is gekozen omdat het autoclaafveilig, niet-reactief en gemakkelijk te bewerken is. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
Roestvrijstalen Pijp voor aangepaste deksels	McMaster Carr	Various	Elke leverancier kan worden gebruikt. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
Aangepaste Gemodificeerde Delran Bioreactor Deksels voor Continue Voeding	Op maat gemaakt		Niet op de hoogte van leveranciers die een soortgelijk product produceren
Aangepaste Gemodificeerde Glazen Fles Deksels voor Continue Voeding	Op maat gemaakt		Sommige leveranciers (bijv., Fischer Sci, Corning) maken vergelijkbare producten in de onderstaande links.
Masterflex Digitale Peristaltische Pomp	Cole Parmer, Vernon Hills, IL	EW-77919-25	Elke nauwkeurige peristaltische pomp kan worden gebruikt. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25
PVDF Slangverbinders (diverse)	Cole Parmer, Vernon Hills, IL	zie link	Elke leverancier kan worden gebruikt. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889
Pharmed BPT Slang L/S 16	Cole Parmer, Vernon Hills, IL	WU-06508-16	Elke leverancier kan worden gebruikt. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16
Pharmed B