Methodenartikel

Snelle Fractionering en isolatie van volbloed componenten in monsters verkregen van een communautair gevestigde instelling

16.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52227

⸱

30 november 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We schetsen een methodologie voor de verwerking van volbloed om een verscheidenheid aan componenten te verkrijgen voor verdere analyse. We hebben een gestroomlijnd protocol geoptimaliseerd dat snelle, hoogwaardige, gelijktijdige verwerking van volbloedmonsters in een niet-klinische omgeving mogelijk maakt.

Samenvatting

Verzameling en verwerking van hele bloedmonsters in een niet-klinische omgeving biedt een unieke kans om te evalueren thuiswonende mensen met en zonder reeds bestaande voorwaarden. Snelle verwerking van deze monsters is essentieel voor de afbraak van belangrijke cellulaire componenten voorkomen. Hier opgenomen zijn methoden voor het gelijktijdig perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC), DNA, RNA en serum isolatie van een enkel bloed trekken uitgevoerd in de huizen van toestemming deelnemers over een grootstedelijk gebied, met verwerking begonnen binnen 2 uur van de collectie. We hebben deze technieken gebruikt worden om meer dan 1.600 bloedmonsters waardoor consistente, hoogwaardige materialen, die vervolgens werd gebruikt in succesvolle DNA-methylatie, genotypering, genexpressie en flowcytometrie analyseert verwerken. Enkele methoden zijn standaard; echter, in combinatie op de beschreven wijze, zij stellen efficiënte verwerking van monsters van deelnemers populatie- en / of community-op basis van studies die normaal niet in een klinische setting worden geëvalueerd. Daarom heeft dit protocol heeft het potentieel om monsters (en vervolgens data) die meer representatief zijn voor de algemene bevolking te verkrijgen.

Inleiding

Meerdere studies hebben gekenmerkt verschillen in genexpressie, DNA methylatie en cel subsets in het bloed bij mensen met en zonder mentale (of andere) ziekten 1-4. Deze studies zijn echter verkregen uit klinische omstandigheden waarin ziektegeassocieerde verschillen kunnen worden vergroot als gevolg van het algemeen ernstiger aard van de aandoeningen waarvoor patiënten om behandeling. Als gevolg van de vooruitgang in de 'omics "aanpak, is de afgelopen tien jaar een explosie van belang bij het ​​verkrijgen van biologische monsters van de gemeenschap en / of epidemiologische instellingen 5-7, met het oog op basis van de bevolking schattingen van de prevalentie van de ziekte te bieden en een breder beeld van de waargenomen omgevingsdeterminanten van deze mentale en / of lichamelijke ziekten.

Een belangrijke uitdaging in dit verband is het vereiste van een snelle verwerking van de verzamelde monsters. Degradatie van mononucleaire cellen, belangrijke immuunsysteem componenten die frequentl zijny gebruikte de gezondheid van een individu begint direct na bloedafname met een significante afname van herstel na 2 uur verzameld 8-10 te beoordelen. Om deze uitdaging aan te pakken, presenteren we een geoptimaliseerd protocol waarin meerdere onderdelen van het menselijk bloed gelijktijdig worden geïsoleerd uit monsters verkregen in huizen van de proefpersonen die in een groot stedelijk gebied. Het protocol is gebaseerd op onze samenstelling en modificatie van de huidige technieken, met inbegrip van opslag van "extra" fracties bij toekomstige technieken een verdere isolatie / analyse. Hoewel alternatieve werkwijzen of kits kunnen worden gebruikt in plaats van de afzonderlijke methoden beschreven, die beschreven zijn bewezen als een betrouwbare en efficiënte middelen voor het verwerken van monsters in een high-throughput manier. Hoogwaardige fracties (PBMC's, DNA, serum en RNA) vers bloed kan worden geproduceerd binnen 2 uur verzameld en alle assay ready monsters beschikbaar zijn binnen 2 dagen (figuur 1 kan worden).

Dit protocol werd ontwikkeld om de efficiënte verwerking van monsters van de gemeenschap-woning, volwassen inwoners van de stad Detroit voor het testen in de Detroit Buurt Health Study staat (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), een populatie-gebaseerde studie van de sociale en biologische determinanten van post-traumatische stress-stoornis (PTSS) en andere psychische aandoeningen. De prevalentie van PTSS in Detroit is meer dan twee keer het nationale gemiddelde 11,12. Het identificeren van de biologische determinanten van PTSS bij deze populatie kan helpen om passende farmacologische en / of cognitieve gedragstherapie interventies om mensen die lijden aan de aandoening te helpen ontwikkelen, zowel in de stedelijke bevolking, en in de andere een hoog risico populaties (bv terugkerende militaire veteranen). Ons laboratorium, voorheen gevestigd aan de Wayne State University in Detroit, Michigan, werd geselecteerd voor de verwerking op basis van onze expertise in het omgaan met verse weefselmonsters afkomstig van een verscheidenheidvan bronnen, de noodzaak om te beginnen met de verwerking van de monsters binnen 2 uur van de collectie, en onze nabijheid van de collectie sites. Met deze unieke gelegenheid voorhanden, ons doel was om de verwerking grootste opbrengst van DNA, RNA, serum en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) van elk monster (totaal N = 1639 monsters na 5 golven specimeninzameling) te optimaliseren. De hier geschetste procedures kunnen gelijktijdig worden uitgevoerd in een niet-klinische omgeving, waarbij verkregen uitgangsmateriaal (zie tabel 1 voor de gemiddelde opbrengst) voor een veelvoud van stroomafwaartse toepassingen zoals microarray, epigenetische, real-time RT-PCR, en flowcytometrie analyse.

figure-introduction-1
Figuur 1. Algemene workflow. Het totale proces hier afgebeelde omvat de logistiek van het verkrijgen van de bloedmonsters van de identificatie toestemming particmers om het bloed te trekken zelf. Hoge kwaliteit, fracties (perifere mononucleaire bloedcellen, PBMCs, DNA, serum en RNA) van vers volbloed kan worden geproduceerd binnen 2 uur van de collectie en alle test-klaar exemplaren kunnen beschikbaar zijn binnen 2 dagen. Bovendien is het door middel van deze werkwijze bereide fracties geschikt voor langdurige opslag als monsters niet direct worden getest. De gehele tijdslijn hier beschreven kan in één dag (~ 5 uur totaal) worden ingevuld. Toch zou zo'n dag zeer arbeidsintensief vooral voor een enkele technicus een aanzienlijke ervaring met de techniek. Dus, adviseren wij het ​​verdelen van de procedures op dag 1 tussen ten minste twee technici en het invullen van het RNA processing op dag 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Detroit Buurt Health Study werd beoordeeld en door de Universiteit van Michigan Institutional Review Board goedgekeurd. Alle deelnemers mits geïnformeerde toestemming voorafgaand aan hun deelname aan het onderzoek.

1. Overzicht

  1. Documenteren alle stadia van rekrutering door analyse van endpoint data. Voer de protocollen op dag 1 tegelijk, schakelen podia en overlappende als de tijd het toelaat. De volgorde van stappen geschreven om de prestaties te optimaliseren. Figuur 1 geeft een overzicht van het gehele proces.
    Opmerking: De term "deelnemer" wordt gebruikt om de hele-de geïdentificeerde bloedmonster getrokken uit een instemmende individu betekenen. De tijden tussen haakjes hieronder geven hands-on tijd. Voorbeelden van de tracking blad en specimen logboek kan worden gevonden in aanvullende tabellen S1 en S2, respectievelijk. Monsters worden verzameld door phlebotomists in woningenindividuen geïdentificeerd als toestemming deelnemers door de studie coördinator en vervoerd naar het laboratorium door een koerier (zie aanvullende informatie (SI) 1 voor verdere voorbewerking details).

2. Dag 1 Setup

  1. Bereid 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Verwarm een ​​warmte-blok tot 56 ºC.
  3. Bereid de protease (zie SI 2) door aliquoting 20 ui in de juiste aantal microcentrifugebuisjes voor de dag van de leveringen (2 per deelnemer).
  4. Zorgen Buffers AW1 en AW2 (wasbuffers die in het DNA isolatie kit die de zuiverheid van het DNA te verhogen) gebruiksklaar zijn, het toevoegen van 100% ethanol zoals aangegeven op het label, indien nodig.
  5. Afkoelen gekoelde centrifuge tot 4 ° C.
  6. Plaats de dop op de fles 1x PBS met de bijgeleverde rubberen septum dop en prik de rubber septum met een transfer spike, met behoud van de schroefdop bovenop de overdracht spike om verdamping te voorkomen. Herhaal dit met de fles RNA stabilisatie oplossing.
  7. Na de bereiding van de buffers, centrifuge en warmte blok, documenteren de tijd van vacutainer levering op het monster volgen plaat (zie Tabel SI).

3. Dag 1: Verwerking volbloedmonster voor DNA, PBMC en Leukocyte RNA (2 uur)

  1. Overzicht
    1. Wijzen voldoende tijd om de vertraging tussen bloedafname en verwerking starttijd minimaliseren. Begin verwerking van de Ficoll bevattende vacutainers binnen 2 uur van bloedafname tot een toename van rode bloedcellen verontreiniging en een daling van mononucleaire cel herstel te voorkomen.
    2. Veronderstellen collectie van 2 vacutainers met Ficoll gradiënt gel, 2 K 2 Ethyleendeniaminetetraacetaat (EDTA) vacutainers en 1 serum vacutainer per volwassene deelnemer. Bij levering van de vacutainers naar het laboratorium, een technicus ondertekenen de tracking vel betekent acceptatie van de monsters. Bedelenin de verwerking onmiddellijk met de starttijd gedocumenteerd op een per vacutainer basis op het monster log.
  2. Serum Isolation Fase 1 (1 min)
    1. Documenteren de starttijd op het monster (zie de tabel SI 2). Centrifuge (met rem en versnelling OFF) de 7,0 ml serum (rood) vacutainer (1 per deelnemer) met een swingende emmer rotor met aerosol caps (bioveiligheidsniveau 2; BSL2 gecertificeerd) gedurende 20 min, 1300 xg, 4 ºC.
  3. DNA-isolatie Fase 1 (15 min)
    Opmerking: Voor meer informatie over dit isolement procedure, zie fabrikant van protocol 13.
    1. Documenteren de starttijd. In een BSL2 celkweek kap, keren de vacutainers met de Ficoll gel 5 keer voeg vervolgens 200 gl volbloed uit de top van een van de vacutainers in elk van twee 20 ul aliquots protease (400 ui totaal per deelnemer). Het verlaten van de protease + bloed microcentrifugebuizen in de kap, blijven de Centrifugation van Ficoll bevatten vacutainers in stap 3.4.1.
      Opmerking: Gebruik Vacutainer de grootste verzamelvolume, rekening houdend met de noodzaak van het balanceren van de centrifuge (ie, kan het nodig zijn om 200 gl verwijderen uit elk van de twee vacutainers) bij het ​​draaien van de vacutainers in stap 3.4.1. Bovendien zorgen voor behoorlijke tijdens de verwerking van de blauwe vacutainers moet het gehalte van het bloed achterblijft in de Vacutainer niet minder dan 2,5 inch boven het Ficoll laag.
  4. PBMC isolatie Fase 1 (1 min)
    1. Noteer de starttijd (moet binnen 2 uur van bloedafname tot een toename van rode bloedcellen verontreiniging en een daling van mononucleaire cel herstel te voorkomen) .Invert de Ficoll bevattende vacutainers 8-10 keer. Centrifuge (met rem en versnelling OFF) de vacutainers (2 per deelnemer) met een swingende emmer rotor met aerosol caps (BSL2 gecertificeerd) gedurende 30 min, 1600 xg, 22 ° C.
  5. DNA Isolation Stage 2 (20 min)
    1. Terug naar de motorkap en voeg 200 ul Buffer AL elk van de protease + bloed microcentrifugebuizen (stap 3.3.1). Cap, verwijderen uit kap, vortex 15 sec en flash spin.
    2. Incubeer 56 ºC in een warmte-blok, 10 min.
    3. Haal de buizen uit de hitte blok. Flash spin. Terug naar de BSL2 kap. Voeg 200 ul 100% ethanol. Cap, verwijderen uit kap, vortex 15 sec en flash spin. De overblijvende stappen kunnen buiten de kap wordt afgesloten.
    4. Breng lysaat (binnen 30 min van stap 3.5.3) een gemerkte spinkolom (in een 2 ml verzamelbuis). Sluit de dop om kruisbesmetting via aerosolen vermijden. Centrifuge 6000 XG, 1 min.
    5. Gooi de verzamelbuis met het filtraat en plaats de spin kolom in een nieuwe 2 ml verzamelbuis.
    6. Voeg 500 ul Buffer AW1 naar de kolom zonder het bevochtigen van de velg, sluit de kap en centrifuge 6000 XG, 1 min.
    7. Gooi de collectie buis met de Filtrate en plaats de spin kolom in een nieuwe 2 ml collectie buis.
    8. Voeg 500 ul Buffer AW2 naar de kolom zonder het bevochtigen van de velg, sluit de kap en centrifuge 20.000 xg, 3 min.
    9. Gooi de verzamelbuis met het filtraat en plaats de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml verzamelbuis (niet in de kit) en centrifuge 20.000 x g, 1 min.
    10. Gooi de verzamelbuis met het filtraat en plaats de spin kolom in een nieuwe 1,5 ml verzamelbuis (niet in de kit).
    11. Voeg 200 ul Buffer AE of water aan elke kolom en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifuge 6000 XG, 1 min.
    12. Herhaal stap 3.5.11 eluerende in dezelfde collectie buis.
    13. Verzamel de geëlueerde DNA van de 2 kolommen per deelnemer. Totale opbrengst ~ 800 ul per deelnemer.
    14. Kwantificeren van de monsters met behulp van een spectrofotometer als de tijd het toelaat.
    15. Hoeveelheid DNA als gewenst in 2 ml cryovials, documenteren van de concentratie van elk van de specimen log. Transfer cryovials een cryobox en plaats bij -80 ° C voor langdurige opslag. Documenteren de vriezer starttijd.
  6. Leukocyt RNA Isolation Fase 1 (30 min)
    Opmerking: Voer in een Biosafety Level 2 gecertificeerd celkweek kap. Voor meer informatie over dit isolement zie instructies van de fabrikant 15.
    1. Doorboren het rubber septum van de K 2 EDTA Vacutainer met een transfer spike. Behoud de schede en schroefdop voor gebruik in stap 3.6.11. Volgende BSL2 standaard praktijken, zorg om de blootstelling aan bloodborne ziekteverwekkers te voorkomen.
    2. Bevestig de witte slip connector naar de top van de overdracht spike.
    3. Label de filter met de bijbehorende deelnemer ID sluit vervolgens de inlaat (uitlopende einde) van het filter aan de witte slip connector.
    4. Bevestig een omhulde 25⅝ G naald naar de uitlaat (tapse uiteinde) van de filter. De voorbereiding van de filter assemblage voorafgaand aan de levering versnelt het proces aanzienlijk en daarom,het bevestigen van de witte slip connector om de overdracht spike, het toevoegen van het filter, dan is de schacht naald en het instellen van de assemblage in een cultuur buis rek tot gebruik, wordt aanbevolen.
    5. Na montage van de K 2 EDTA buizensysteem veilig unsheathe de naald (gebruik het uiteinde van een metalen spatel). Steek de naald in een lege 10 ml geëvacueerd bloedafname (serum ontvanger buis) en draai de K 2 EDTA vacutainer / filter / ontvanger binnenband. Volgende BSL2 standaard praktijken, zorg om de blootstelling aan bloodborne ziekteverwekkers te voorkomen.
    6. Laat het bloed te filteren door totdat de wigvormige delen van het filter hebt verwijderd van het bloed. Filtratie duurt ongeveer 2 minuten en kunnen in een reageerbuis rek geplaatst tijdens het filtreren.
    7. Verwijder het filter uit de montage. Laat de naald in de buis met het filtraat en het geheel weggooien in een naaldencontainer.
    8. Bevestig een 5 ml spuit met de overdracht spike op de fles 1x PBS, invert de fles, en trekken 3 ml.
    9. Bevestig de spuit met PBS om de inlaat van het filter en spoel het filter (3-5 druppels per seconde). Verzamel de doorstroom in een biologisch afvalcontainer. Maak de spuit van de filter zonder het terugtrekken van de zuiger.
    10. Na filtratie en een PBS wassen, trekken 3 ml van het RNA stabilisatie-agent met een nieuwe 5 ml spuit en de in stap 3.6.8 beschreven methode. Spoel het filter zoals in stap 3.6.9. Het RNA stabilisatieagent moet op het filter achterblijven. Maak de spuit van de filter zonder het terugtrekken van de zuiger.
    11. Dicht de filter inlaat en de uitlaat van de schede en schroefdop bewaard van de overdracht spike het verlaten van het filter verzadigd met RNA stabilisatie middel. Het filter kan worden opgeslagen op dit punt. Bewaar het filter bij -80 ° C tot de tijd het toelaat (~ 2 uur) te voltooien stappen 5.3 tot 5.4.7.
      Opmerking: Filters opgeslagen bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar na verzameling verwerkt zonder decrease in RNA kwaliteit.
  7. PBMC isolatie Fase 2 (30 min)
    1. Verwijder de Ficoll bevatten vacutainers uit de centrifuge (stap 3.4.1) en ga verder in een BSL2 kap. Vacutainers moet scheiding weergegeven als in figuur 2. Indien niet, zie tabel 2.
    2. Zodra de Vacutainer wordt teruggegeven aan de BSL2 kap, verwijder de stop en trekken 1,5 ml van de bovenste, gelige, plasmalaag (figuur 2) met behulp van een serologische pipet zonder dat dichtbij het ​​mononucleaire (clear / wit) laag. Transfer het plasma aan een 5 ml cryovial - (Pool van 2 vacutainers - 1 deelnemer). Log de verzamelde volume. Zie stap 3.7.6 voor instructies voor opslag.
      Opmerking: De beste scheiding en grootste PBMC opbrengsten komen uit de deelnemers die minstens 12 uur hebben gevast voorafgaand aan de bloedafname.
    3. Breng de resterende plasma en de wittige, mononucleaire laag (alles boven de gel laag - figuur 2) uzing een serologische pipet, een 15 ml conische buis, bundeling van mononucleaire laag uit elk van de twee Ficoll met vacutainers per deelnemer in een conische buis.
    4. Toevoegen 1x PBS om het totale volume in de conische buis 15 ml te brengen. Cap tube en omkeren 5 keer. Centrifuge (met rem en versnelling OFF) 15 min, 300 xg, 22 ° C.
    5. Terug naar de Ficoll bevatten vacutainers in de kap en het verzamelen van de rode bloedcellen (RBC's) met behulp van een 5¾ "Pasteur pipet om rond te wervelen en maak de buitenkant van de Ficoll gellaag en verwijder deze indien mogelijk. Gebruik een serologische pipet te verzamelen en de overdracht van de RBC (~ 4,5 ml) tot 5 ml cryovial. Log de verzamelde volume.
    6. Meng beide 5 ml cryovials (plasma in stap 3.7.2 en RBC's in stap 3.7.5) tot een gecontroleerde snelheid invriezen en plaats bij -80 ° C gedurende ten minste 24 uur waarna ze kunnen worden overgebracht naar een cryobox en terug naar -80 ºC voor langdurige opslag.
    7. De terugkeer van de conische buis aan de kap, als de centrifugering in stap 3.7.4 is voltooid, en zuig bijna ~ 500 ul van PBS zonder de pellet te verstoren. PBMC opbrengst groter als ~ 200 pl PBS boven de pellet in dit stadium wordt gelaten.
    8. Voeg frisse 1x PBS om het volume op 10 ml te brengen. Resuspendeer de pellet voorzichtig. Cap tube en omkeren 5 keer. Centrifuge (met rem en versnelling OFF) 10 min, 300 xg, 22 ° C.
  8. Serum Isolation Fase 2 (10 min)
    Opmerking: Voer in een BSL2 kap.
    1. Aliquot de bovenste laag serum uit het serum vacutainer na centrifugeren (stap 3.2.1), in 2 ml cryovials zoals gewenst. Typische opbrengst 2,5 ml (tabel 1). Log het volume. Gebruik bijvoorbeeld 4 cryovials aliquoting 200 pl in cryovial 1, 1000 pi in cryovial 2 en vervolgens delen van de resterende in cryovials 3 en 4.
    2. Breng de cryovials een cryobox en plaats bij -80 ° C voor langdurige opslag. Documenteren de vriezer starttijd.
  9. PBMC isolatie Fase 3 (15 min)
    1. Terug naar de kap na centrifugeren (stap 3.7.8), en zuig zoveel supernatant / PBS mogelijk zonder de pellet te verstoren. Resuspendeer pellet door pipetteren in 2,5 ml PBMC Freezing Medium 1 (zie SI 2).
    2. Voeg 2,5 ml PBMC Freezing Medium 2 (zie SI 2) aan de cel / medium in stap 3.9.1. Vortex voorzichtig.
    3. Aliquot 10 ul van de cel oplossing in een 0,65 ml microcentrifugebuis (verdere verdunning noodzakelijk zijn). Voeg 10 ul van 0,4% trypan blauwe vlekken in de 0,65 ml microcentrifugebuis en meng door een paar keer pipetteren. Voor verdere details zie de handleiding van de fabrikant 16.
    4. Pipetteer 10 ul van het mengsel in een cel telkamer glijbaan en plaats schuif in de celtelinrichting binnen 3 min mengen. Zoom in en focus van de cellen. Druk op de "Count Cellen" te verkrijgen PBMC tellen.
    5. Aliquot, indien de levensvatbarePBMC nummer boven 3 miljoen cellen per milliliter (mc / ml), zoals gewenst in cryoflesjes en doorgaan met stap 3.9.9. WINKEL PBMC in maximaal 5 cryoflesjes bij een concentratie van ten minste 3 mc / ml elk.
    6. Als de levensvatbare PBMC nummer dan 3 mc / ml, berekent het totale aantal cellen door vermenigvuldiging van levensvatbare mc / ml met 5 ml. Dat getal van 4, 3, 2 of 1 ml, zodat er ten minste één buis met 3 mc / ml zal zijn.
    7. Centrifugeer de conische buis met cellen / invriezen medium oplossing 5 minuten bij 300 xg (rem- en acceleratie OFF). Na centrifugeren zuig het geschikte volume van ijskoud medium (supernatant) die het volume bovenstaande (4, 3, 2 of 1 ml) berekend.
    8. Resuspendeer de pellet in de resterende supernatant en hoeveelheid ten minste 3 mc / ml in het juiste aantal cryovials (1-4) bij 1 ml / cryovial. Final invriesmedium is 10% dimethylsulfoxide (DMSO) / 20% foetaal runderserum (FBS) / 70% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
    9. Document het celgetal per cryovial. Breng de cryovials een gecontroleerde snelheid bevriezen en plaats bij -80 ° C gedurende ten minste 24 uur na welke tijd de cryovials kan worden overgedragen aan een cryobox en in een vloeibare stikstof tank (dampfase) voor lange termijn opslag. Document vriezer starttijd.

4. Dag 2 Setup

  1. Verhit een monster (220 pl per filter) van nuclease vrij 0,1 mM EDTA in een nuclease-vrije buis tot 80 ° C in een verwarmingsblok.
  2. Bereid wassen oplossingen 1 en 2 (zie SI 2).

5. Dag 2: Lange Termijn Sample Opslag en leukocytfilter Processing (3 uur)

  1. Overzicht.
    1. Voer deze procedure binnen 6 maanden na de toepassing van de leukocyten naar de filter.
      Opmerking: Overall, Dag 2 bewerking duurt ongeveer 3 uur en terwijl het label "dag 2", de belangrijkste vereiste is dat de filter verwerkingsgedeelte worden uitgevoerd op een dag waaroper is geen dag 1 processing plaatsvindt in het lab.
  2. Lange termijn monster opslag (15 min)
    1. Voer deze procedure elke dag voorafgaand aan de aflevering van nieuwe vacutainers naar het lab voor dag 1 processing. Breng de cryovials die werden opgeslagen O / N in gecontroleerde snelheid bevriezen containers op dag 1 in gepaste label cryoboxes en breng ze terug tot -80 ºC of vloeibare stikstof (dampfase) voor lange termijn opslag. Organiseren cryovials basis van monster type (bijvoorbeeld, DNA, PBMC, RBC, etc.) bemonsteringsplaats versnellen tracking voor eindpunt assays.
  3. Leukocyt RNA Filters Processing (45 min).
    Opmerking: Voor meer informatie over deze procedure zie instructies van de fabrikant 17.
    1. Breng het filter aan RT (ontdooien ongeveer 5 min).
    2. Verwijder de huls en schroefdop van de filter. Trek de plunjer van een injectiespuit van 5 ml en sluit deze aan op de inlaat (uitlopende einde) van het filter, de zuigerhet RNA stabilisatieagent verdrijven van de filter-poorten in een biologisch afval container.
    3. Plaats een nieuwe 5 ml spuit met 4 ml van een fenol en guanidine isothiocyanaat oplossing voor RNA-isolatie en bevestigen aan de inlaat van het filter, de zuiger aan de oplossing door het filter te spoelen, het verzamelen van het lysaat in een gelabelde 15 ml conische buis (2 per deelnemer).
    4. Koppel de spuit uit de filter, trek de zuiger, opnieuw koppelen aan het filter, en druk op de zuiger om de resterende monster gevangen in het filter schijf te verdrijven in dezelfde 15 ml conische buis. Gooi filter en spuit.
    5. Voeg 800 ul BCP aan de conische buis, sluit de buis strak en krachtig schud de prep voor 30 sec.
    6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Centrifugeer 10 minuten bij 2000 x g.
    7. Breng de waterige (bovenste) fase naar een vers gelabelde 15 ml conische buis (~ 2,5 ml).
    8. Voeg 0,5 maal het volume van de waterfase van nuclease-vrij water eend meng goed. Voeg dan 1,25 maal het waterige volume van 100% ethanol en meng opnieuw.
      Opmerking: Voor een 2,5 ml waterige volume, voeg 1,25 ml nuclease gratis water, meng, voeg vervolgens 4,7 ml 100% ethanol (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml nuclease gratis water en vervolgens 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml nieuwe waterige volume DAN 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% ethanol). Deze stap maakt isolatie van totaal RNA dat kleine RNA fractie omvat. Een methode om de kleine RNAs uit de isolatie weglaten te vinden in het handboek 17.
    9. Verwijder de zuiger uit een spuit 5 ml en plaats een afdraaipatroon op zijn plaats. Bevestig de cartridge / spuit assemblage om een ​​vacuüm spruitstuk. Voor een veilige verbinding met het vacuüm spruitstuk, plaatst de patroon / spuitset in een 1,5 ml microcentrifuge buis met de onderkant afgesneden.
    10. Breng het monster uit stap 5.3.8 naar afdraaipatroon langzaam het vacuüm, meer monster voorzichtig toe als het wordt getrokken door de patroon.
      Opmerking: Als er geen vacuümaanwezig, zie centrifugeren methode bij http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
    11. Breng de afdraaipatroon een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 750 pl Wash 1. Centrifuge de afdraaipatroon / buisstelsel 5 - 10 sec bij 12.000 x g.
    12. Werp filtraat uit de buis en geeft het afdraaipatroon dezelfde microcentrifugebuis.
    13. Voeg 750 ul van Wash 2 en centrifuge de afdraaipatroon / buis voor 5-10 sec bij 12.000 x g. Gooi filtraat zoals in stap 5.3.12. Zet de afdraaipatroon dezelfde microcentrifugebuis.
    14. Herhaal dit met een ander 750 ul Wash 2 en centrifugeren zoals in stap 5.3.13. Teruggooi filtraat. Zet de afdraaipatroon dezelfde microcentrifugebuis. Centrifugeer de afdraaipatroon / buis bij maximale snelheid gedurende 1 min naar het filter drogen.
    15. Breng de afdraaipatroon om een ​​frisse, gelabeld 1,5 ul microcentrifugebuisje.
    16. Voeg 200 ul nuclease-vrij 0,1 mM EDTA (voorverwarmd tot 80 & #176, C) naar het centrum van de rotatie patroonfilter (2 per deelnemer). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min.
    17. Centrifugeer gedurende 1 min bij 12.000 xg om het RNA te elueren. Bewaar het filtraat. Gooi afdraaipatroon.
    18. Split elke 200 ul filtraat in twee, 100 ul fracties in de frisse 1,5 ml microcentrifugebuisjes, label en blijf op ijs. Op dit punt beginnen met 2 filters per deelnemer opleveren vier 100 ui aliquots van RNA per deelnemer.
  4. DNase behandeling (1 uur)
    Opmerking: Voor meer informatie over deze behandeling zie protocol van de fabrikant 18.
    1. Maak een master mix door het combineren van 10 ul van DNase I Buffer en 2 pl rDNase Ik per portie + 1 (om rekening te houden voor het pipetteren fout).
      Opmerking: Voor vier monsters, 100 ul monsters gebruiken 50 ul DNase I Buffer + 10 pi rDNase I.
    2. Aliquot 12 ul van de master mix in stap 5.4.1 in elk van de RNA-monsters uit stap 5.3.18 en meng voorzichtig. Incubeer bij 37° C gedurende 30 minuten in een verwarmingsblok.
    3. Vortex de DNase inactivatie reagens en voeg 11,2 ul aan elk monster, meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min wervelen 2-3 keer tijdens incubatie.
    4. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1,5 min.
    5. Breng de bovenstaande (RNA) een nieuwe 1,5 ml buis. Porties van dezelfde deelnemer kan hier worden samengevoegd.
    6. Run elk monster op een spectrofotometer bij de concentratie te krijgen. Een analyse van de kwaliteit van het RNA wordt aanbevolen het gebruik van een Bioanalyzer (zie stap 5.5).
    7. Aliquot het RNA in cryovials zoals gewenst. Als een Bioanalyzer analyse niet onmiddellijk wordt uitgevoerd aliquot 1,5 ui monster in een microcentrifugebuis voor latere analyse. Documenteren van de concentraties en de vriezer starttijd. WINKEL monsters bij -80 ° C.
  5. Bioanalyzer analyse (1 uur)
    1. Volg de fabrikant protocol 19. Als de run is voltooid, worden de gegevens automatisch opgeslagen, maar opnieuw opslaan wet een kleinere, meer herkenbare bestandsnaam. Verwachte resultaten (Figuur 3): de ladder moet 6 pieken, moeten de monsters 3 pieken (2 ribosomale pieken bij 44 sec en 50 sec, respectievelijk 1 vroege merker piek bij 25 sec) heeft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het is essentieel dat de totale procedure van hoge kwaliteit materiaal voor analyse in een veelvoud van stroomafwaartse toepassingen, waaronder genexpressie via microarray en RT-PCR-analyse, detectie van epigenetische veranderingen en cel subreeks varianten. Tabel 1 geeft de gemiddelde opbrengst en kwaliteit van materialen van elk van de processen. Figuur 3 geeft een voorbeeld van de uitvoer kwaliteit van de leukocyten RNA isolatie en filter verwerkingsmethoden. Het beeld in de linkerbo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een gestroomlijnde protocol die met succes toegepast voor meer dan 1600 volbloedmonsters verwerken Detroit Wijk Health Study beschreven. Hoewel veel van deze technieken zijn in de literatuur, onze stap voor stap compilatie, waaronder juist getimede wijzigingen tussen elke stap, weerspiegelt een geoptimaliseerd, efficiënt protocol dat succes produceert diverse biologische monsters met uiteenlopende downstreamtoepassingen, waaronder DNA methylatie, mRNA expressie en immunologische analyse. Deze exemplaren zijn a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

We willen Henriette Mair-Meijers bedanken voor haar onschatbare aandacht voor detail en de uren die zij besteedde aan het verwerken van de bloedcollecties. We zijn dankbaar voor de expertise in grafisch ontwerp van Natalie Jameson Kiesling. We waarderen ook de goedkeuring van de fabrikanten (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) die hierin worden genoemd, om het gebruik van hun producten te publiceren zoals beschreven. De financiering voor dit werk werd genereus verstrekt door de National Institutes of Health met de toekenningsnummers DA022720, RC1MH088283 en DA022720-05-S1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104Dag 1: DNA isolatie
Phosphate-buffered saline (PBS)SigmaP5493-1LDag 1: PBMC isolatie
5 ¾” Pasteur pipettenFisher13-678-6ADag 1: PBMC isolatie
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivatedLife Technologies10082147Dag 1: PBMC isolatie
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-500mlDag 1: PBMC isolatie
RPMI Medium 1640, liquidInvitrogen11875119Dag 1: PBMC isolatie
0.4% trypan blue stain InvitrogenT10282Dag 1: PBMC isolatie
Countess Cell Counting ChamberInvitrogenC10283Dag 1: PBMC isolatie
Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometerInvitrogenC10281Dag 1: PBMC isolatie
LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit Ambion1933Dag 1: Leukocyte RNA isolatie
25 G x 5/8 in. naaldenBecton Dickinson305122Dag 1: Leukocyte RNA isolatie
Spuiten (5 ml)Becton Dickinson309646Dag 1 en 2: Leukocyte RNA isolatie
Denaturing Lysis Solution Ambion8540GDag 2: Leukocyte RNA isolatie
5 M NaClLife Technologies24740011Dag 2: Leukocyte RNA isolatie
TRI ReagentAmbion9738Dag 2: Leukocyte RNA isolatie
Bromo-3-chloro-propaan (BCP)SigmaB-9673Dag 2: Leukocyte RNA isolatie
spin cartridges Ambion10051GDag 2: Leukocyte RNA isolatie
0.1 mM EDTAAmbion9912Dag 2: Leukocyte RNA isolatie
DNA-free KitAmbionAM1960Dag 2: DNase behandeling
RNA 6000 Ladder Agilent5067-1529Dag 2: Bioanalyzer analyse
RNA 6000 Nano Series II Kit Agilent5067-1511Dag 2: Bioanalyzer analyse
RNaseZAPAmbionAM8782Dag 2: Bioanalyzer analyse
Ethanol >99%SigmaE7023-500ml
Isopropanol >99% SigmaI9516-500ml
Nuclease-free ultra pure water Invitrogen9938
Pipet tips (nuclease-free)Eppendorf22491253
Pipetter (serological)Eppendorf2223020-4
Pipetters (for volumes under 1 ml)Eppendorf3120000-054
Pipettes (serological)Fisher13-678-27E
Controlled rate freezing containersNalgene5100-0001
Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes)Fisher03-395-464
Test tube rackThermo Scientific14-804-134
15 ml polypropyleenbuizenFisher14-959-49D
1.5 ml en 0.65 microcentrifuge tubesFisher07-200-534 en 07-200-185
2 ml en 5 ml cryovialsFisher10-500-26 en 10-269-88F 
8 ml CPT vacutainerBD Biosciences3627612 buizen
6 ml K2 EDTA vacutainerBD Biosciences3678632 buizen
8.5 ml SST vacutainerBD Biosciences3679881 buis
VortexerFisher2215365
Dry bath incubator with heating block voor microcentrifuge buizenFisher11-715-1250
Filtratievacuümsysteem voor gebruik binnen de celcultuur kapFisher01-257-87
Fixed-angle rotor voor microcentrifuge buizen met aerosol-tight dekselEppendorf22637002
Gekoelde centrifuge met een swing-bucket rotor en aerosol-tight caps voor 16 x 125 mm vacutainers en 15 ml polypropyleen buizenEppendorf226281572, één hoeft niet gekoeld te worden
Nanodrop 2000 (aanbevolen voor nauwkeurigheid van kleine volumes) of ander spectrofotometrisch apparaatFisher13-400-411
Agilent BioanalyzerAgilent TechnologiesG2940CA
Vloeibare stikstoftankThermo Scientific11-676-56
Sharps containerFisher22-037-970
Biologische afval containerThermo Scientific1223P52
Biosafety Level 2  gecertificeerde celcultuur kapThermo Scientific13-261-315

Referenties

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
  14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
  15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
  16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
  17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
  18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
  19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
  20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
  23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
  26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
  27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Verwerking van volbloedperifere mononucleaire bloedcellenDNA isolatieRNA isolatieserumisolatieplasmascheidingverzamelen van rode bloedcellenflowcytometrie analyseniet klinische settinggemeenschapsgebaseerde bemonstering

Gerelateerde artikelen