Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Samenvatting

We presenteren een experimentele procedure van Candida albicans biofilmontwikkeling in een muis subcutaan model. Schimmelbiofilms werden gekwantificeerd door het bepalen van het aantal kleurvormende eenheden en door niet-invasieve bioluminescentie-beeldvorming, waarbij de hoeveelheid geproduceerd licht overeenkomt met het aantal levensvatbare cellen.

Samenvatting

Candida albicans biofilm ontwikkeling op biotische en / of abiotische vlakken vormt een specifieke dreiging voor gehospitaliseerde patiënten. Tot nu toe C. albicans biofilms werden voornamelijk bestudeerd in vitro, maar er is een dringende behoefte aan een beter begrip van deze dynamische proces onder in vivo condities. We ontwikkelden een in vivo subcutane rat model om C. te studeren albicans biofilm vorming. In ons model meervoudige (tot 9) Candida geïnfecteerde inrichtingen worden geïmplanteerd om het rugdeel van het dier. Dit geeft ons een groot voordeel ten opzichte van de centrale veneuze katheter modelsysteem als het ons toelaat om verschillende onafhankelijke biofilms studeren in één dier. Onlangs hebben we aangepast deze model naar C. studeren albicans biofilm ontwikkeling in BALB / c muizen. In dit model, volwassen C. albicans biofilms ontwikkelen binnen 48 hr en tonen de typische driedimensionale biofilm architectuur. Het kwantificeren van schimmels biofilmis van oudsher geanalyseerd post mortem en vereist gastheer opoffering. Omdat dit vereist het gebruik van vele dieren kinetische studies uitvoeren, toegepast worden niet-invasieve bioluminescentie (BLI) longitudinaal volgen in vivo volwassen C. albicans biofilms ontwikkelen in onze subcutane model. C. albicans cellen werden om de Gaussia princeps luciferasegen (GLUC) bevestigd aan de celwand expressie. De bioluminescentie-signaal wordt geproduceerd door het luciferase die het toegevoegde substraat coelenterazine omzet in licht die kan worden gemeten. De BLI signaal leek cel verkregen uit geëxplanteerde katheters telt. Niet-invasieve beeldvorming voor het kwantificeren van in vivo biofilmvorming biedt onmiddellijke toepassingen voor screening en validatie van antimycotica onder in vivo omstandigheden, alsmede voor studies op basis van gastheer-pathogeen interacties hierbij dragen tot een beter begriping van de pathogenese van katheter-gerelateerde infecties.

Inleiding

Candida albicans is een commensaal organisme, te vinden op verschillende plaatsen van gezonde individuen, bijvoorbeeld op de huid of als een deel van de tractus en vaginale flora. Echter, in het ziekenhuis, en vooral immunogecompromitteerde patiënten, kan een groot aantal infecties ¹ veroorzaken. Bij dergelijke individuen, het verzwakte immuunsysteem maakt Candida cellen te verspreiden in de bloedbaan en diepere weefsels binnen te vallen waardoor levensbedreigende infecties. Bovendien is de aanwezigheid van abiotische substraten zoals centrale veneuze en urinaire katheters, kunstmatige hartkleppen en gewrichten kunnen een niche voor Candida bevestiging ² verschaffen. Hechting aan dergelijke substraten is voordat verder biofilm ontwikkeling, waarop een laag gist en hyphal cellen ingebed in extracellulair polymeermateriaal vertegenwoordigt hoofdzakelijk uit polysacchariden ^2. C. albicans katheter-geassocieerde infectiesworden geassocieerd met een hoog sterftecijfer. Een algemeen kenmerk van biofilms is hun verminderde gevoeligheid voor bekende antimycotica, zoals azolen ^3,4. Alleen nieuwere klassen van antimycotica, zoals echinocandinen en liposomale formulering van amfotericine B bleken werkzaam tegen katheter infecties ^5-7 zijn. Door biofilm veerkracht antimycotica zijn therapeutische benaderingen erg beperkt, wat vaak leidt tot verwijdering van de katheter en de daaropvolgende vervanging als enige oplossing.

De meeste van onze huidige kennis van C. albicans biofilm ontwikkelen komt uit in vitro naar abiotische substraten zoals polystyreen, of kunststof voor de vervaardiging van bovengenoemde inrichtingen, bijvoorbeeld, silicone, polyurethaan ^2. Deze modellen zijn zeer geavanceerd en proberen de situatie in vivo zo goed mogelijke nabootsen. Echter, deze systemen niet betrekking op de continue bloedstroom en thij immuunsysteem van de host. Dit resulteerde in de ontwikkeling van in vivo modelsystemen, zoals centrale veneuze katheter (CVC) model ^8-10, de prothese stomatitis model van orale candidiasis ¹¹ en een muizenmodel voor katheters candidurie ^12. Bovendien, C. albicans biofilm ontwikkeling werd bestudeerd in vivo op de mucosale oppervlakken, zoals die van de vagina ¹³ en mondholte ^14. Ons laboratorium heeft bijgedragen aan de oprichting van een onderhuidse C. albicans biofilm model, dat is gebaseerd op het implantaat van geïnfecteerde catheter stuks op de achterkant van Sprague Dawley ^15. Dit model werd met succes gebruikt in ons laboratorium biofilm gevoeligheid testen fluconazol en echinocandine medicijnen ^5,16, namelijk combinatoriële therapie van diclofenac en caspofungine ¹⁷ bestuderen. Recenter passen wij deze voor gebruik in BALB / c muizen ^18,19. Invergelijking met andere in vivo modellen, het belangrijkste voordeel van deze subcutaan model is de mogelijkheid om meerdere biofilms per dier ontwikkeld binnen het lumen van geïmplanteerde katheter stukken te bestuderen.

Om het aantal proefdieren verminderen, hebben wij dit model aan de ontwikkeling van C. bestuderen aangepast albicans biofilms niet-invasief met behulp van bioluminescentie beeldvorming (BLI) ^18,19. Deze werkwijze bleek een krachtige techniek die kan worden gebruikt om biofilms kwantificeren meten van de specifieke BLI signaal op het gebied van belang (in ons geval het gebied van geïmplanteerde katheters), het vermijden van dierlijk offer. In vergelijking met bacteriën die zowel het gen en het substraat vereist voor de bioluminescentie reactie kan uitdrukken door de invoering van een specifiek lux operon ²⁰ meeste eukaryote organismen, zoals C. albicans, zijn afhankelijk van de heterologe expressie van een luciferase gen in combinatie met deexterne toediening van een specifiek substraat, zoals D- luciferine of coelenterazine ^21. Waarschijnlijk door de aanwezigheid van de schimmel celwand en C. albicans morfogenese, de intracellulaire aflevering van het substraat voor het enzym luciferase was een grote uitdaging ^21. Om dit probleem op te lossen, Enjalbert et al. ²² gemanipuleerde een stam waarin een synthetisch C. albicans-codon geoptimaliseerde versie van het gen voor de natuurlijk uitgescheiden Gaussia princeps luciferase (Gluc) werd gefuseerd met de C albicans PGA59 gen, een GPI verankerde celwand eiwit. Door de aanwezigheid van luciferase in de celwand, kunnen problemen met de intracellulaire beschikbaarheid van het substraat worden voorkomen. Dit bijzondere systeem werd gebruikt om oppervlakkige infecties veroorzaakt door C. bestuderen albicans ^22. Zeer recent BLI werd ook gebruikt om de progressie van orofaryngeale candidiasis en mogel followe behandeling ^23. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van BLI als een veelbelovende techniek infecties veroorzaakt door vrij levende cellen maar ook device geassocieerde infecties te bestuderen.

In deze studie beschrijven we de C. albicans biofilm ontwikkeling van polyurethaan katheter stukken in BALB / c muizen en kwantificering middels BLI. We geven een gedetailleerd protocol van in vitro kolonisatie van polyurethaan katheters gedurende de adhesie gevolgd door implantatie in muizen en verdere biofilm ontwikkeling in levende dieren. Naast het meten van het BLI-signaal uitgezonden door de C. albicans cellen, ook de kolonievormende eenheden vergelijking met de standaard techniek voor biofilm fungale belasting kwantificering bepalen.

Protocol

OPMERKING: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van de KU Leuven (projectnummer 090/2013). Behouden dieren in overeenstemming met de KU Leuven dierverzorging richtlijnen.

1. C. albicans Growth

1. Vierentwintig uur vóór het begin van het dierproeven voorbereiden YPD platen door 10 g gistextract gegranuleerd, 20 g bacteriologische pepton en 15 g gegranuleerd agar. Make up volume tot 900 ml met Milli-Q water en autoclaaf.
2. Voeg 50 ml steriele 40% glucose. Meng goed en giet het in petrischaaltjes. Laat agarplaten afkoelen en stollen.
   LET OP: In deze studie gebruiken twee stammen, namelijk wild type C. albicans SC5314 - GLUC negatieve stam (aangeduid als WT) en C. albicans SKCA23 stam, die een wild-type C. albicans SC5314 getransformeerd met Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide ^{op 22} .In deze stam (vernoemd SKCA23- ACTgLuc) Gluc werd gefuseerd aan het endogene PGA59 gen onder controle van WERKW1 (actine) promoter (deze promotor actief in gist, en hyfen stadium schimmelgroei). Deze stam kan worden aangevraagd bij het laboratorium van prof Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, België. Plasmide Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide ²² werd gedoneerd door Prof. C. d'Enfert, Instituut Pasteur, Parijs, Frankrijk.
3. Behouden beide stammen in glycerol voorraad winkel en bij -80 ° C.
4. Voorafgaand aan een experiment streak stammen op een YPD plaat. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende de nacht.

2. Catheter Pieces Voorbereiding

1. Voor het experiment bepalen hoeveel katheters nodig. Het is mogelijk om implanteren tot 6 katheter stuks per muis (3 catheters links en 3 catheter aan de rechterzijde van het dier (Figuur 2A).
2. Vierentwintig uur voorafgaand aan het dier een operatie, open de verpakkingleeftijd met drievoudig-lumen katheter onder de bioveiligheidskast. Verwijder alle overbodige delen met steriel pincet en snij het deel verbonden aan de katheter met een steriele scalpel. Plaats liniaal onder de plastic verpakking en snij polyurethaan katheter stukken van exact 1 cm volgens de schaal op de liniaal (figuur 1).
   OPMERKING: Het is belangrijk te vermelden dat deze soort katheter stuk is niet fosforescerende en dus geschikt voor BLI ^18,19.
3. Plaats een maximum van 15 gesneden katheter stukken (stap. 2.2) in 2 ml microcentrifugebuisjes. Bereiden altijd 3 stuks extra, die worden gebruikt om de hoogte van bijgevoegde Candida cellen op inventarisatie van het apparaat na afloop van hechting.
4. Supplement katheters met ongeveer 1,8 ml van 100% foetaal runderserum (FBS).
5. Krachtig vortex en voeg extra 100-200 ul 100% FBS. Volledig toereikend katheter stukken met serum.
6. Incubeer bij 37 ° C geïncubeerd.

3 dieren en onderdrukking van het immuunsysteem

1. Houd vrouwelijke BALB / c-muizen (ongeveer 8 weken oud) in individueel geventileerde filter top kooien met gratis toegang tot de standaard voedsel en water ad libitum.
2. Initiëren onderdrukking van het immuunsysteem 24 uur voor de operatie dier door toevoeging van dexamethason (0,4 mg / l) aan het drinkwater van de dieren. Om elke bacteriële besmetting van de gastheer vermijden, vullen het drinkwater met antibioticum, bijvoorbeeld ampicilline natrium- poeder (0,5 g / l).
3. Blijf immunosuppressie van dieren tijdens het gehele experiment (tot 6 dagen).

4. Ex vivo C. albicans Hechting op FBS-gecoate Polyurethaan Substrates

1. Breng elk serum beklede katheter stuk in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
2. Schraap sommige C. albicans-cellen gegroeid op YPD platen (stap 1) en suspendeer deze in 1 mi PBS.
3. Verdunde Kandida-cellen (1: 100) in een afzonderlijke microcentrifuge buis. Neem 10 pi van de verdunde monster en toe te passen op een mobiele telkamer. Tellen minstens 16 kleine vierkantjes.
4. Bereid Candida cellen (elke stam apart) in RPMI 1640 medium tot een eindconcentratie van 5 x 10 ⁴ cellen / ml.
5. Voeg 1 ml celsuspensie aan elk serum-gecoate katheter stuk.
6. Krachtig Vortex en ervoor te zorgen dat de katheters worden ondergedompeld in het medium en niet drijven op de top.
7. Incubeer katheters bij 37 ° C gedurende 90 min (duur van hechting).
8. Verwijder katheters met steriele pincet en wassen tweemaal met 1 ml PBS. Tijdens deze stap zorgen dat de wasvloeistof gaat door het lumen van de katheter te houden in verticale stand terwijl zachtjes spoelen van de katheters. Belangrijk gebruik geen sterke stromen kan leiden tot het verwijderen van aangehechte cellen.
9. Transfer elk gewassen katheter om een ​​schone microcentrifugebuis (een stuk per tube).
10. Plaats op ijs en blijf daar tot een operatie.

5. Anesthesie

1. Bereid verdoving door mengen van 75 pl ketamine (100 mg / mL) met 100 pl medetomidine (1 mg / ml) en 825 pl steriele zoutoplossing. Dien intraperitoneaal (ip) 60-80 gl anestheticum cocktail per 10 g lichaamsgewicht, resulterend in een dosis van 45-60 mg / kg ketamine en 0,6-0,8 mg / kg medetomidine.
2. Voor omkering van anesthesie, verdun 50 ui atipamezol (5 mg / ml) in 4,95 ml zoutoplossing, toedienen ip 100 ul per 10 g lichaamsgewicht als tegengif, resulterend in een dosis van 0,5 mg / kg.
3. Na injectie van verdoving, plaats het dier in een aparte kooi en wacht tot het volledig in slaap.
4. Bevestig de juiste verdoving van het dier door licht snuifje huid en teen knijpen, die geen schade aan de huid veroorzaken. Alle waargenomen beweging geeft aan dat het dier onvoldoende verdoofd te opereren. Als dit gebeurt, wacht een couple minuten langer totdat het dier geen tekenen van beweging op de huid of teen knijpen tonen.

6. Dierlijke Chirurgie

1. Transfer verdoofd dier uit de kooi op een schoon weefsel geplaatst op het verwarmingselement, voorverwarmd tot 37 ° C (figuur 2A (1)).
   OPMERKING: Een goedkoper alternatief is om elektrisch verwarmde dekens gebruiken. Het is ook mogelijk isothermische pads, die omhoog worden opgewarmd in de magnetron voor het dier operatie gebruikt.
2. Toepassing oogzalf op de ogen.
3. Scheer de lage rug van het dier met een elektrisch scheerapparaat. Verwijder alle haren van dieren en de overdracht van dier op van een schone tissue. Ontsmet de huid (bijvoorbeeld met 1% jood isopropanol of 0,5% chloorhexidine in 70% alcohol) en laat het gedesinfecteerde ruimte drogen ongeveer 1 min (Figuur 2A, (2)).
4. Maak een kleine incisie in de huid (één links en één rechts van het dier) (ongeveer 0,5 &# 8211; 1 cm) (Figuur 2A, (3)).
5. Ontleden de subcutis met een schaar tot twee subcutane tunnels te creëren. Elke tunnel moet ongeveer 1,5 cm lang en 1 cm breed.
6. Plaats drie katheter stukjes, die eerder geïnfecteerd met Candida, in elke tunnel. Zorg ervoor dat de katheters liggen naast elkaar in een horizontale opstelling en dat deze niet op elkaar om de implantatie van zes katheter fragmenten in totaal mogelijk (figuur 2A (4)).
7. Sluiten insnijdingen met hechtingen. U kunt ook gebruik maken van Dermabond om de wond te sluiten.
8. Desinfecteer de wond zeer voorzichtig met 0,5% chloorhexidine in 70% alcohol of jodium isopropanol (1%).
9. Pas lokale verdoving (xylocaine gel, 2%) direct op de wond.
10. Dien omkering van de anesthesie (protocol 5, stap 2): intraperitoneaal 100 ul per 10 g lichaamsgewicht.
11. Transfer dier naar een schone kooi eerder op een verwarmingsplaat geplaatst. Houd het dierafzonderlijke warme tot het dier volledig wakker. Ondertussen blijven met de werking en implantaat van het volgende dier. Zodra alle bediend dieren helemaal wakker. Over te dragen aan een kooi. Regelmatig toezicht op dieren.

7. bioluminescentiebeeldvorming: Voorbereiding van Coelenterazine (CTZ), het substraat voor G. princeps luciferase

1. Bereid vers coelenterazine (CTZ) voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg / ml CTZ in aangezuurde ethanol of volgens de instructies van de fabrikant.
2. Bereid 1,2 mM werkoplossing door verdunning van de stockoplossing 01:10 in steriele PBS.
   OPMERKING: Injecteer 100 ui CTZ werkoplossingen subcutaan in de omgeving van de katheters. Gebruik van insuline spuiten voor subcutane injectie van CTZ.
3. Houden CTZ in het donker Always (bijvoorbeeld betrekking microcentrifuge buisjes met CTZ met aluminiumfolie). Bewaar de stockoplossing bij -80 ° C gedurende de duur van de experimenten.

8. bioluminescentiebeeldvorming

1. Initialiseer de BLI camera.
2. Verdoven het Dieren met behulp van een inductie in. Gebruik een gasmengsel van isofluraan in zuurstof, _N2O / _O2 of lucht bij 2-3%.
3. Na inductie, onderhouden anesthesie in het vak inductie en in de beeldvorming kamer bij 1,5-2%.
4. Voordat de opnamesessie, plaatst de beeldplaat in de stand A, hetgeen overeenkomt met een FOV van 10 cm. Zorg ervoor dat de juiste positie van de anesthesie outlets en dier door het plaatsen van een slapend dier in de doos.
5. Neem paar foto tot dier in de gewenste positie beeldvorming, in het FOV direct onder de camera.
6. Bereid twee insuline injectiespuiten elk 100 pl van de CTZ werkoplossing.
7. Plaats één dier op de bank en houd het in slaap door middel van een neuskegel verstrekken gas anesthesie.
8. Breng de naalden van de spuiten in een plaats rond katheters subcutaan en injecteerde CTZ gelijktijdig bovenop de katheters.
9. Onmiddellijk na de injectie, plaatst het dier op de warme plaat in de doos camera en start de afbeelding bioluminescentie overname.
10. Verwerven opeenvolgende scans met opnametijden van 20 tot 60 seconden (afhankelijk van de signaalintensiteit) totdat de maximale signaalintensiteit wordt bereikt. Tijdens het verwerven van het volgende frame, meet de BLI signaalintensiteit van de eerder verworven beelden door een ROI van elk katheters trio en meten foton flux door deze ROI.
11. Herhaal vanaf stap 7 voor het volgende dier (en).
12. Na beeldvorming terug dieren naar de kooi. Herhaal BLI tijdens een experiment voor longitudinaal, niet- invasieve opvolging van biofilm vorming.
13. Analyseer de BLI gegevens met behulp van Living Image software. Plaats een rechthoekig ROI van vaste grootte over elke katheter trio en meet de fotonflux (straling) door elke ROI. Herhaal dit voor elk dier.
14. Rapportde BLI signaal intensiteit van elke katheter trio als fotonflux per seconde. Vertegenwoordigen de BLI gegevens op een logaritmische schaal door het uitzetten van het gemiddelde en SD van het foton flux per seconde voor elke groep. Uitvoeren statistische analyse op de log ₁₀ getransformeerde gegevens.

9. Catheter Explantatie

1. Bereid microcentrifuge buisjes met 1 ml PBS, één voor elke katheter apparaat en bewaar ze op ijs.
2. Euthanaseren de dieren door cervicale dislocatie (figuur 2B (1)).
3. Ontsmet de huid van de rug met 0,5% chloorhexidine in 70% alcohol of met jodium isopropanol (1%).
4. Maak een insnijding (ongeveer 3 cm) boven de katheters.
5. Knip subcutane weefsel en een verwijder de catheter fragmenten door een onder het subcutane weefsel met steriele pincet (Figuur 2B, (2)).
6. Handvat katheter zachtjes in verticale positie en was het tweemaal met 1 ml steriel PBS. Plaats elke katheterstuk in een aparte microcentrifugebuis (bereid in trap 1).

10. De kwantificering van de biofilm-geassocieerde cellen door Colony Forming Units Graaf (CFU's) en statistische analyses van de resultaten

1. Ultrasone trillingen katheters eerder in 1 ml PBS gedurende 10 min bij 40000 Hz in een waterbad ultrasoonapparaat en plaats ze op ijs.
2. Na sonicatie, krachtig vortex gedurende 30 seconden en plaats weer op ijs.
3. Bereid twee extra microcentrifugebuisjes met 900 ul van PBS.
4. Maak 1:10 en 1 100 verdunningen van uw oorspronkelijke monster (degene die de katheter bevat) en houdt al microcentrifugebuisjes op ijs.
5. Plaat 100 pl van de oorspronkelijke monsters, 1:10 en 1: 100 verdunningen op YPD agar platen in tweevoud.
6. Incubeer de platen gedurende 2 dagen bij 37 ° C en tellen CFU.
7. Tel de kolonies gegroeid op YPD agarplaten (telbare hoeveelheid kolonies, maximaal 300 kolonies / plaat) en vermenigvuldigt deze vervolgens met de juiste Dilutie factor (1x-origineel, 10x of 100x verdunning). Verder vermenigvuldigen elke katheter stuk 10x, hetgeen overeenkomt met de uiteindelijke hoeveelheid kolonies in 1 ml buisje met de katheter. Breng het uiteindelijke bedrag van de kolonies tot ₁₀ cellen / katheter stuk met standaarddeviatie (SD) log. Versneld gegevens als gemiddelde ± SD.
8. Plaats alle waarden voor elke katheter en specifieke groep in een spreadsheet en / of statistische programma voor de bovengenoemde berekeningen en statistische analyses. Geef aan specifieke groepen te vergelijken, dwz WT versus mutant of 2 dagen vs. 6 dagen biofilmvorming en het uitvoeren van ongepaarde t-toets en ANOVA met Tukey post-test op de log10-getransformeerde gegevens.
   1. Versneld het niveau van significantie door een p waarde. In deze studie geven betekenis als p waarde <0,05, als volgt weergegeven: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0.0005.

Resultaten

In deze studie tonen we de operatie van katheter implantaat en explantaat tijdens de in vivo C. albicans biofilm ontwikkeling in een muis. Bovendien geven we de kwantificering van volwassen biofilms niet alleen klassieke CFU opsomming, maar ook door BLI.

Zoals getoond in figuur 1A, werden niet-fosforescerende polyurethaan katheter stukjes gesneden in 1 cm inrichtingen en vervolgens bekleed met serum. Deze stap is zeer belangrijk omdat het laat Candida-cellen

Discussie

De toepassing van diermodellen en vooral knaagdiermodellen, voor studies gewijd aan microbiële biofilms zeer belangrijk als gastheer immuunsysteem is een essentiële factor bij biofilmvorming die in vitro modellen kunnen niet verklaren. In deze studie beschrijven we een relatief eenvoudige subcutane C. albicans biofilm muismodel, die gemakkelijk in een onderzoekslaboratorium kan worden vastgesteld en geen sterke technische vaardigheden vereist. Dit model is aanvankelijk ontwikkeld Staphylococcus epi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gist extract gegranuleerd	Merck	MERC1.03753.0500
Bacteriologische peptonen	Oxoid	LP037B
Agar gegranuleerd	Difco	214530
D-(+)-glucose	Fluka	49159-5KG
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Bereidt in het laboratorium		voor 1L van 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4
RPMI1640 met L-glutamine en zonder natriumcarbonaat	Sigma	R6504-1L	Bereid volgens het protocol voor Candida albicans geneesmiddelgevoeligheidstesten
3-(N-Morpholino)propaansulfonzuur (MOPS)	Sigma	M1254	MOPS wordt gebruikt om de pH van het RPMI-medium (pH 7,0) aan te passen
Fétaal runderserum (FBS)	Sigma	F7524
Polyurethaandompelbuis voor intraveneuze toediening (2,4 mm diameter, Certofix Trio S730)	BBraun	CV-15703	Polyurethaangedeelte gesneden in stukken van 1 cm
Dexamethason	Fagron SAS, Frankrijk	611139	Immunosuppressivum (voorraadoplossing 10 mg/ml)
Ampicilline	Duchefa Biochemie, Nederland	A0104	Antibacteriële profylaxe
Ketamine 1000	Pfizer	804 119	Anestheticum
Domitor	Pfizer	134737-1	Anestheticum
Antisedan	Pfizer	134783-2	Reversie van anesthesie
Xylocaine gel (2%) - dit is Linisol	AstraZeneca	352 1206	Lokaal verdovingsmiddel voor de huid
Terramycin/ polymyxine-b oogzalf			Om uitdroging en infectie van ogen te voorkomen
Coelenterazine	Prolume (Nanolight)	NF-CTZ-FB	Lichtgevoelig middel (moet in het donker worden bewaard)
Jodium isopropanol (1%)	3M™ DuraPrep™		Ontsmettingsmiddel voor de huid
0,5 % chloorhexidine in 70 % alcohol.	Cedium		Ontsmettingsmiddel voor de huid
Uitrusting
Celtelkamer
Insulinespuitjes (0,3 ml)	Terumo Myjector 29G	324826	Voor injectie van coelenterazine
Elektrische scheerapparaat			Voor kleine dieren
Steriele chirurgische werktuigen			Scharen, 2 paar pincetten, scalpel
Verwarmingskussen	Leica	14042321474
Huidnaald	Johnson&Johnson	K890H	Chirurgisch draad, naald
Waterbadsonicator	Branson 2210
BLI-camera (IVIS Spectrum)	Perkin Elmer, Alameda	IVISSPE
Living Image-software	Perkin Elmer, Alameda		(versie 4.2)