Presterende Subretinal Injecties in Knaagdieren om retinale pigment epitheel cellen leveren in Suspension

Samenvatting

Hier presenteren we een door de gemeenschap geaccepteerd protocol in multimedia-formaat voor het subretinaal injecteren van een bolus RPE-cellen bij ratten en muizen. Deze aanpak kan worden gebruikt voor het bepalen van reddingspotentieel, veiligheidsprofielen en overlevingscapaciteiten van getransplanteerde RPE-cellen bij implantatie in diermodellen van retinale degeneratie.

Samenvatting

De omzetting van licht in elektrische impulsen optreedt in de buitenste retina en is grotendeels bereikt door staafjes en kegeltjes fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. RPE bieden kritische steun voor de fotoreceptoren en de dood of disfunctioneren van RPE cellen is kenmerkend voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de voornaamste oorzaak van permanent verlies van het gezichtsvermogen bij mensen van 55 jaar en ouder. Hoewel er geen remedie voor AMD is geïdentificeerd, kan implantatie van gezonde RPE in zieke ogen blijken een effectieve behandeling, en grote aantallen RPE cellen kunnen gemakkelijk worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen. Verschillende interessante vragen over de veiligheid en werkzaamheid van RPE cellen levering kan nog worden onderzocht in diermodellen en goed aanvaarde protocollen gebruikt injecteren RPE ontwikkeld. De hier beschreven techniek is door meerdere groepen in diverse studies en omvat eerst een gat in het oog met een scherpe naald. Dan is een spuit met een blunt naald geladen met cellen wordt ingebracht door het gat en door het glasvocht, totdat deze net tegen de RPE. Met deze injectiemethode, die relatief eenvoudig en vereist minimale apparatuur, we consistente en efficiënte integratie van stamcellen afgeleide RPE cellen bereiken tussen de ontvangst RPE die aanzienlijke hoeveelheid fotoreceptor degeneratie voorkomt in dierlijke modellen. Hoewel geen onderdeel van de eigenlijke protocol, ook beschrijven hoe de omvang van het trauma veroorzaakt door de injectie en Controleren of de cellen werden geïnjecteerd in de subretinale ruimte met in vivo beeldvormende modaliteiten. Tenslotte wordt het gebruik van dit protocol niet beperkt tot RPE cellen; kan worden gebruikt om een ​​verbinding of cel in de subretinale ruimte te injecteren.

Inleiding

Het sensorische netvlies is georganiseerd in functionele lagen van neuronen, gliacellen en endotheelcellen. Fotoreceptoren aan de achterkant van het netvlies worden geactiveerd door licht; via fototransductie zetten ze fotonen om in elektrische signalen die worden verfijnd door interneuronen en worden doorgegeven aan de visuele cortex in de hersenen. Fototransductie kan niet plaatsvinden zonder de gecoördineerde inspanningen van Mueller-glia en retinale pigmentepitheel (RPE) cellen. RPE is georganiseerd in een monolaag direct achter de fotoreceptoren en vervult meerdere en diverse functies die essentieel zijn voor de functie en homeostase van fotoreceptoren. In feite zijn RPE en fotoreceptoren zo onderling afhankelijk dat ze worden beschouwd als één functioneel geheel. De dood of disfunctie van RPE leidt tot verwoestende secundaire effecten op fotoreceptoren en is geassocieerd met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van blindheid bij ouderen^1,2.

Hoewel er nog geen remedie is ontdekt voor AMD, hebben verschillende klinische onderzoeken aangetoond dat RPE-celvervanging een veelbelovende therapeutische optie kan zijn^3-13. Met de komst van stamceltechnologie is het nu mogelijk om grote aantallen RPE-cellen in vitro te genereren uit embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hES en hiPS) die functioneel en anatomisch sterk lijken op hun somatische tegenhangers^14-26. Stamcel-afgeleide RPE is ook aangetoond te functioneren in vivo door meerdere onafhankelijke groepen, waaronder de onze, om retinale degeneratie in ratten- en muislijnen met spontane retinale degeneratie aanzienlijk te vertragen^{16,18,21,22,25,28,29}. Deze combinatie van klinische en preklinische ondersteunende bewijzen is zo overtuigend dat er nu verschillende klinische onderzoeken aan de gang zijn om retinale degeneratie te voorkomen met behulp van stamcel-afgeleide RPE-cellen^30,31.

RPE kan gemakkelijk worden afgeleid van hES en/of hiPS en geïmplanteerd in de subretinale ruimte van knaagdieren met behulp van verschillende afleidings- en injectietechnieken^32,33. (Zie Westenskow et al. voor een methodenartikel in multimediaformaat dat het gedirigeerde differentiatieprotocol weergeven dat we hanteren)³⁴. Er zijn kritische blijvende vragen met betrekking tot de veiligheid, overleving en functionele capaciteit van exogeen toegediende RPE-cellen na implantatie, daarom is het vermogen om subretinale injecties bij knaagdieren uit te voeren een kritische vaardigheid^{16,18,21,29,36,37}. De levering van RPE is niet triviaal en het veld is verdeeld over de meest effectieve injectietechniek. Het protocol dat we hier beschrijven is een eenvoudige en effectieve manier om een bolus van RPE-cellen subretinaal af te leveren en werd gebruikt in het eerste klinische onderzoek voor stamcel-afgeleide RPE-transplantatie³¹. (De lezer kan ook verwijzen naar een ander JoVE-artikel door Eberle et al. voor een alternatieve weergave van subretinale injecties bij knaagdieren.³⁸)

De techniek die in dit manuscript wordt beschreven, kan niet worden gevisualiseerd en trauma is onvermijdelijk (zoals bij elke subretinale injectietechniek). Het wordt uitgevoerd door een gaatje te maken net onder de limbusvaten en een stompe naald langs een transsclerale route in te brengen om een bolus cellen onder de diametrisch tegenoverliggende retina te injecteren. De persoon die de injectie uitvoert zal weerstand voelen wanneer de stompe naald de retina raakt. De cellen kunnen echter direct na de injectie worden gevisualiseerd en de mate van de geïnduceerde retinale loslating kan worden bepaald door de RPE-cellen te labelen met een tijdelijke fluorescerende marker en ze te detecteren met een confocale scanrendoscoop (cSLO). Een optische coherentietomografie (OCT) systeem kan ook worden gebruikt om het trauma te bewaken en de injectieplaats gemakkelijk te identificeren.

Protocol

Opmerking: Alle dieren werden volgens de ethische richtlijnen die door de Scripps Research Institute behandeld.

1. Voorbereiding van Materialen voor de Injectie (~ 20 min)

1. Voorverwarmen cel dissociatie oplossing (bij voorkeur een die wordt geïnactiveerd door verdunning niet met serum), steriel PBS, en kweekmedia (Tabel 1).
2. Steriliseren van de spuit met een stompe naald door het demonteren en het koken van de onderdelen in water gedurende 15 min.

2. Bereiding van de RPE cellen voor injectie (~ 30 min tot 1 uur)

1. Maak de RPE cellen met voorverwarmd cel dissociatie oplossing gedurende 5-8 minuten bij 37 ° C.
2. Schraap de cellen zachtjes om elke dat verbonden blijven los.
3. Verdun de cellen met een groot volume kweekmedium (vullen een 15 ml buisje) de dissociatie oplossing inactiveren en tellen.
4. Centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
5. Resuspendeer de cellen bij 200.000 cellen / ul (100.000 cellen leveren een 0,5 pi volume) in steriele voorverwarmde PBS en overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis.
6. Voeg desgewenst een levende cel voorbijgaande fluorescente merker en incubeer bij 37 ° C gedurende 30-45 min.
7. Plaats de spuit met een stompe naald met 0,5 ul van cellen. Injecteer de cellen zo spoedig mogelijk.

3. Sub-retinale Injectie (~ 5 min per injectie)

OPMERKING: Als het mogelijk is, leren de techniek met volwassen albino ratten sinds de limbus schepen zijn veel gemakkelijker te visualiseren. Injecteer Fast Green oplossing bij het leren (voordat u cellen injecteren) visualisatie van de injectieplaats gemakkelijker vergemakkelijken.

1. Verdoven van het knaagdier. Gebruik intraperitoneale injecties van 100 mg / ml ketamine en 10 mg / ml xylazine (20 gl / 10 g lichaamsgewicht wacht) over isofluorane inhalatie omdat het moeilijk is om het knaagdier manoeuvreren en injecteren in het oog met de snuit in de inhalator.
   1. Zorg ervoor dat het dier diep wordt verdoofd door knijpen een van zijn poten. Als het flinches, wacht u nog enkele minuten en probeer het opnieuw voor het begin van de subretinale injectie.
2. Plaats het knaagdier op zijn zijkant zodat het oog, dat zal worden geïnjecteerd wordt geconfronteerd met het plafond.
3. Onder een dissectiemicroscoop voorzichtig rekken van de huid, zodat het oog springt iets omhoog uit het stopcontact (tijdelijke proptosis) en wordt meer toegankelijk te houden haar hoofd met twee vingers net boven het oor en door zijn kaak en voorzichtig rekken de huid parallel aan de oogleden zodat het oog springt iets omhoog uit het stopcontact (zie figuur 1C). Niet begrijpen het knaagdier te dicht bij de keel.
4. Met een 30 G scherpe wegwerp-pre gesteriliseerde naald, maak een gat direct onder de limbus (als de schepen worden getroffen, zal bloeden be significante en moeilijk zijn om het gat vinden later) en onder een hoek met raak de lens met de naald (figuur 1D). Raak de lens met de scherpe (of stompe) naald of onmiddellijke vorming cataract zal optreden.
   OPMERKING: Injecties werken beter met twee mensen. Op deze manier kan één persoon de spuit pas met de stompe naald naar de persoon die de injectie nadat ze het eerste gat hebt gemaakt met de scherpe naald voor eenmalig gebruik om de focus te houden op waar het gat is.
5. Trek de disposable scherpe naald uit het oog terwijl het handhaven van de grip op het hoofd. Vergeet niet precies waar het gat is.
6. Na ofwel de montage van de vooraf geladen spuit met een stompe naald op een micromanipulator vasthoudt of aan de hand, steek de punt van de spuit met de stompe naald door het gat, het verzorgen wederom de lens niet aanraakt en duw het door het oog heel zachtjes tot het gevoel weerstand (figuur 1D).
7. Keeping alle bewegingen tot een minimum voorzichtig injecteer de RPE cellen langzaam in de subretinale ruimte.
   OPMERKING: RPE / netvlies detachement zal worden opgewekt; dit onvermijdelijk is. Echter, een schonere injectie minimaliseert het losmaken en verbetert de kans heraanhechting (figuur 1E). Elke overdreven bewegingen kan de naald terug te gaan naar het netvlies, en zijwaartse bewegingen kan het netvlies beschadigen. Het gebruik van een injectiepomp optioneel, maar maakt een zeer nauwkeurige levering.
8. Trek de spuit langzaam. Solliciteer oog hydraterende daalt voor het oog gehydrateerd.
9. Blijven toezien op het dier totdat het herwint borstligging. Laat dier niet onbeheerd of terug te keren naar een kooi met andere alert dieren totdat hij herwint borstligging.

Resultaten

We kunnen een opschorting van RPE cellen te leveren in de subretinale ruimte van knaagdieren snel en consistent gebruik van de in dit manuscript beschreven techniek. Terwijl het niet nodig is, kan trauma's sterk worden geminimaliseerd via het getoond met een micromanipulator in figuur 1A & B-setup. Houd het knaagdier zoals getoond in figuur 1C tijdelijke proptosis. De stappen zijn hetzelfde als uitgevoerd met de micromanipulator of met de hand; deze worden afgebeeld in de cartoo...

Discussie

In dit artikel beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige werkwijze voor het uitvoeren subretinale injecties van RPE cellen in suspensie bij ratten en muizen. Het protocol is eenvoudig te leren en ervaring met de techniek zal vertalen in minder trauma (figuur 3; dit is een van de betere injecties), vooral een micromanipulator wordt gebruikt (figuur 1A). Elk trauma kan worden gevolgd in vivo met een cSLO en oktober (zie figuur 2), indien beschikbaar. Als afbeeld...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	Case x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 µg x 20
DPBS, geen calcium, geen magnesium	Gibco	14190-144	500 ml x 1
Fast Green	Sigma-Aldrich	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops Moderate to Severe Lubricant Eye Drops	Walmart	4060941	25 ml x 1
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Spuit x 1
Hamilton Needle 33 G, 0.5", punt 3 (304 roestvrij staal)	Hamilton	7803-05	Naalden x 6
Knockout DMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
Magnetische standaard	Leica Biosystems	39430216	Standaard x 1
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
Micromanipulator	Leica Biosystems	3943001	Manipulator x 1
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
Slip Tip Spuiten zonder naalden BD  (3 ml)	VWR	BD309656	Verpakking x 1
Specialty-Use Naalden BD  (30 G, 1")	VWR	BD305128	Doos x 1
TrypLE Express Enzym (1X), geen fenol rood	Gibco	12604013	100 ml x 1