Methodenartikel

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

18K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52255

⸱

3 maart 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie, Institut de biologie intégrative et des systémes & PROTEO, Université Laval

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Samenvatting

Eiwitten zijn de bouwstenen, effectoren en signaalbemiddelaars van cellulaire processen. De functie, regulatie en lokalisatie van een eiwit zijn vaak afhankelijk van de interacties met andere eiwitten. Hier beschrijven we een protocol voor de gist-eiwitfragment-complementatietest (PCA), een krachtige methode om directe en proximale associaties tussen eiwitten in levende cellen te detecteren. De interactie tussen twee eiwitten, elk gefuseerd met een dihydrofolaatreductase (DHFR) eiwitfragment, vertaalt zich in de groei van giststammen in aanwezigheid van het medicijn methotrexaat (MTX). Differentiële fitheid, resulterend uit verschillende hoeveelheden gereconstitueerd DHFR-enzym, kan worden gekwantificeerd op hoog-dichtheidskolonie-arrays, waardoor interacterende en niet-interagerende aas-prooiparen kunnen worden onderscheiden. Het hier gepresenteerende high-throughput protocol wordt uitgevoerd met behulp van een robotplatform dat het paren van aas- en prooistammen die complementaire DHFR-fragmentfusie-eiwitten dragen en de overlevingstest op MTX paralleliseert. Dit protocol maakt het mogelijk om systematisch duizenden eiwit-eiwit-interacties (PPI's) te testen die aas-eiwitten van belang betreffen en biedt verschillende voordelen ten opzichte van andere PPI-detectietests, inclusief het onderzoek van eiwitten die worden geëxpresseerd vanuit hun endogene promotoren zonder de noodzaak om de eiwitlokalisatie te wijzigen en voor de samenstelling van complexe reporterconstructies.

Inleiding

Eiwit interactie netwerken (PIN's) bieden een lage resolutie kaart van hoe eiwitten functioneel worden georganiseerd in de cel 1. Elke fysieke verbinding tussen twee eiwitten of eiwit-eiwit interacties (PPI), kan een vereniging die stabiel in de tijd, zoals die in eiwitcomplexen vertegenwoordigen en die bijdragen aan de structurele organisatie van de cel. Deze verbindingen kunnen ook vertegenwoordigen voorbijgaande verenigingen die de activiteit, stabiliteit, lokalisatie en interacties van de twee partners te regelen. Het identificeren van de fysieke interactie tussen partners van een bepaald eiwit biedt daarom een rijke informatie over de functie en regulatie van dat eiwit 2,3. Daarom zijn grote inspanningen tot het karteren van pincodes in modelorganismen, zoals Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster / Em> 13, Caenorhabditis elegans 14 en Homo sapiens 15. Deze studies hebben belangrijke inzichten in hoe eiwitten worden georganiseerd in de cel en daarmee de belangrijkste informatie over de eiwitten met voorheen onbekende functies voorzien.

Verschillende strategieën zijn ontwikkeld door de jaren heen om pincodes te bestuderen. Deze technologieën kunnen grofweg worden ingedeeld in drie categorieën op basis van de soort informatie die deze voor protonpompremmers (beoordeeld in 16-18). De eerste is gebaseerd op gist-twee-hybride en zijn derivaten 19. Deze technologieën bieden informatie over de directe associatie tussen paren van eiwitten, die het mogelijk maakt de aanleg van binaire netwerken. De tweede familie is gebaseerd op de affiniteitszuivering van lokaas eiwitten en de identificatie van hun geassocieerde partners, zoals affiniteitszuivering gevolgd door massaspectrometrie 20. Deze benaderingen identificeren groepen eiwitten die directof indirect geassocieerd algemeen op een stabiele wijze, en zijn uiterst krachtig eiwitcomplexen identificeren. De derde benadering is gebaseerd op eiwit fragment complementatie bepalingen (PCA) 11,21. Deze aanpak levert een gemiddeld niveau van de resolutie tussen de twee voormalige benaderingen, omdat het laat detecteren directe en proximale associaties tussen eiwitten. Elke techniek heeft zijn eigen sterke en zwakke punten, zoals onlangs beoordeeld 18.

De best beschreven eukaryote PIN is veruit één van de gist Saccharomyces cerevisiae, deels omdat de proteoom relatief minder complex dan die van andere model eukaryoten en omdat high-throughput assays detecteren protonpompremmers vooraf zijn bepaald en zijn efficiënter geïmplementeerd in dit model organisme 9-12. Een bijzonder krachtige methode voor het gistsysteem is het dihydrofolaatreductase-eiwit fragment complementatie bepaling (DHFR-PCA), een test die isgebruikt in verschillende contexten om de gist PIN in standaard en verstoorde omstandigheden 11,22-26 te bestuderen. Deze werkwijze berust op een survival test die de detectie van directe en bijna direct PPI maakt voor een gegeven aas eiwit zowel endogene expressieniveaus en inheemse subcellulaire lokalisaties van de interactiepartners 11,21 op een kwantitatieve wijze 27. De verkregen met deze assay (dwz koloniegrootte on high-density kolonie arrays) signaal geeft dus de hoeveelheid eiwit complexen gevormd tussen het aas en prooi in een cellulaire omgeving bijna gelijk aan die van wild-type cellen. De assay is gebaseerd op de reconstitutie van een reporter enzym betrokken bij folaat metabolisme, de dihydrofolaatreductase (DHFR), waarbij twee complementaire fragmenten van DHFR die zijn gefuseerd aan de twee eiwitten van belang worden in nabijheid gebracht wanneer de twee eiwitten interageren, waarbij leidt omkeerbaar reconstitutie van de enzymactiviteit 11 en groei van de spanning op een medium dat methotrexaat (MTX Figuur 1). Deze verbinding remt de endogene DHFR enzym, maar niet het gemuteerde gebruikt in de test 28. Twee verzamelingen van PCA stammen, één met ~ 4300 MATa stammen met een ORF gefuseerd aan de DHFR F [1,2] en fragment een met ~ 4800 MAT α stammen met een ORF gefuseerd aan het DHFR [3] fragment kan worden gekocht implementeren DHFR-PCA op kleine of grote schaal in een laboratorium. Hier beschrijven we een algemeen maar gedetailleerd protocol voor het screenen op PPI tussen een lokaas eiwitten en ~ 4800 prooi eiwitten met deze assay.

Protocol

1. Bouw / verificatie van Bait Stammen

  1. Als het aas stam van belang is in de MATa DHFR F [1,2] collectie halen uit de collectie zoals beschreven in stap 1.1.1, de stam anders construct zoals beschreven in stap 1.1.2.
    LET OP: De hier beschreven protocol maakt gebruik van een DHFR- F [1,2] stam als een aas en de DHFR- F [3] collectie als prooien, zoals deze collectie bevat meer stammen dan de DHFR- F [1,2] collectie. Het is echter mogelijk het scherm omgekeerd te voeren als het aas stam alleen in de DHFR F [3] winning of in beide oriëntaties als men vereist hogere dekking van de interactoom.
    1. Ontdooi de glycerol voorraad plaat die het aas stam op ijs bevat gedurende een uur. Steriliseren van de aluminiumfolie die de plaat met behulp van 95% ethanol. Prik de folie met een steriele tip, pipet op en neer naar de cellen en streak 2-3 ul van glycerol voorraad resuspendeer op selectieve gistextract peptondextrose (YPD) + 100 ug / ml Nourseothricin (Nat) om enkele kolonies te isoleren. Incubeer gedurende twee dagen bij 30 ° C.
    2. Bouw van een aas PCA stam (MATa DHFR- F [1,2]).
      1. Met behulp van high-fidelity polymerase en een standaard PCR-protocol, versterken het DHFR- F [1,2] cassette uit plasmide pAG25-linker-DHFR- F [1,2] -ADHterm behulp van oligonucleotiden met overhangende uiteinden homoloog aan de laatste 40 bp van de ORF's 3'-end exclusief het stopcodon (voorwaartse primer) en de eerste 40 bp van het gen 3'-UTR (reverse primer) (Figuur 1A).
      2. Transformeer het PCR product in competente gistcellen (meestal in een BY4741 stam) met standaard LiOAc / PEG gist transformatie protocol in 29 (figuur 1A).
      3. Plaat op selectieve YPD + Nat medium om positieve transformanten te isoleren.
      4. Voer een diagnostische kolonie PCR op geïsoleerde kolonies op de juiste DHFR- F [1,2] fusion bevestigen. Gebruik prIMERs gloeien 1) in het gen coderende sequentie (Forward oligo) ongeveer 100 bp stroomopwaarts van het DHFR fusion en 2) in de ADH terminator van de cassette (omgekeerde oligo) (Figuur 1B).
      5. Sequentie PCR product door Sanger sequentiebepaling juiste genfusie bevestigen.
      6. Archiveer de bevestigde aas stam in 25% glycerol bij -80 ° C.
        OPMERKING: Het protocol kan worden gepauzeerd bij deze stap.

2. Pin-instrument Sterilisatie en Drukkerijen Procedures

OPMERKING: De hieronder beschreven sterilisatie procedure werd geoptimaliseerd voor de pen-gereedschap gemanipuleerd door de BM3-BC (S & P Robotics) robotplatform, maar kan worden aangepast aan andere platforms ook. Dit hoofdstuk beschrijft de Pin-instrument sterilisatie en afdrukken procedures die worden gebruikt om cellen van het ene medium naar het andere voor de rest van het protocol. In-house scripts gebruikt om deze routines uit te voeren kan worden verkregen op aanvraag. Opmerking that alle stappen kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak van een robot platform met een handmatige pen-gereedschap 30.

  1. Monteer de juiste pin-tool op de robot platform.
  2. Bereid reinigen en nat stations als volgt:
    1. Voeg 500 ml steriel water in het waterbad station.
    2. Voeg 320 ml van steriel water in de borstel station.
    3. Voeg 380 ml van 70% ethanol in de sonificator bij het repliceren van agar plaat (86 x 128 mm omnitray, met 35 ml gestolde gemiddeld) om agar plaat, of 400 ml bij het repliceren van een microtiterplaat met vloeibare culturen om een ​​agarplaat.
    4. Voeg 35 ml steriel water in het natte station (bestaande uit een steriele lege omnitray).
  3. Aan het begin van elke dag dat de robot platform vereist, steriliseren de pen-gereedschap vijf keer gedurende één minuut in de sonicator bad. Ondertussen zet de UV-lamp voor vijf minuten naar de robot behuizing steriliseren.
    NB: Dit is niet nodig als het berovenot is ondergebracht onder een steriele kap.
  4. Tussen elke pin-instrument replicatie ronde, steriliseren van de pin-instrument als volgt:
    1. Week de pin-instrument vijf keer voor 10 sec in het waterbad station naar cel klonten te verwijderen.
    2. Week de pin-instrument twee keer heen en weer in de borstel station.
      OPMERKING: De roterende borstel zal de resterende cellen te verwijderen.
    3. Week de pin-instrument tweemaal voor 20 sec in de sonicator station.
      OPMERKING: resterende cellen op de pennen worden verwijderd door sonicatie of gedood door ethanol.
    4. Zorg ervoor dat het dompelen diepte van de pinnen verhoogt bij elke opeenvolgende bad om een ​​goede sterilisatie te verzekeren.
  5. Droog de pin-instrument in de lucht droger station voor 25 sec.
  6. Alvorens cellen op de bronplaten Bevocht pennen in de natte station, die 35 ml steriel water in een omnitray bevat.
  7. Dompel de pennen tweemaal in de kolonies van de bronplaat.
  8. Afdrukken op een vers gegoten bestemming plaat door het aanraken van de agar oppervlak tweemaal (hierna de werking van "printing" een matrix).

3. Condensatie van de DHFR- F [3] Collection in 1536 Arrays behulp van een geautomatiseerd Robotic Platform

  1. Ontdooi op ijs de DHFR F [3] verzameling (60 96-well platen) en een extra 96-well plaat gevuld met de L-DHFR F [3] controlestam (figuur 1C), waarbij de DHFR F bevat [3] fragment en de stroomopwaartse linker alleen uitgedrukt als een negatieve controle.
    Opmerking: In principe fragment niet communiceren met elk DHFR-fragment-fusie-eiwit (zie bespreking voor details).
  2. Centrifuge platen (snelle draai) voordat u de aluminiumfolie om het risico van kruisbesmetting tussen putten te vermijden.
  3. Condensatie de verzameling op 16 reeksen 384 stammen (Figuur 2A). Om dit te doen, voor elke 384 serie, print vier glycerol platen op de vier kwadranten van een selectief YPD- + 250 ug / ml Hygromycine B (hygB) omnitray behulp van the 96 pin gereedschap (hier een 384 matrix kan worden onderverdeeld in vier gelijke kwadranten afstand van elkaar, elk bestaande uit 96 posities in een 2 x 2 matrix lay-out). Plaats vier platen met 96 putjes bevattende de L-DHFR F [3] negatieve controle tussen de 60 andere platen teneinde een definitieve reeks van 64 platen die precies vullen vier 1536 arrays. Steriliseer het pen-gereedschap tussen elke replicatiecyclus zoals beschreven in stap 2.
    OPMERKING: Plaats de L-DHFR F [3] platen om zo'n plaat hebben op elk van de vier uiteindelijke 1,536 arrays.
  4. Incubeer de platen gedurende twee dagen bij 30 ° C. Opmerking: In dit stadium kan de DHFR collectie worden opgeslagen in een formaat 384 bij 4 ° C gedurende maximaal een maand op agarplaten.
  5. Condensatie de verzameling in vier reeksen 1536 stammen (Figuur 2A). Om dit te doen, voor elke 1.536 array, afdrukken vier reeksen van 384 stammen op de vier kwadranten van een plaat van hetzelfde medium als in stap 3.2 met behulp van de 384 pin-instrument (hier kan een 1536-array worden onderverdeeld in vier eQually elkaar gelegen kwadranten die elk bestaan ​​uit 384 posities in een 2 x 2 matrix lay-out).
  6. Incubeer de platen gedurende twee dagen bij 30 ° C. Opmerking: In dit stadium kan de DHFR collectie worden opgeslagen in een 1536 formaat op 4 ° C gedurende maximaal een maand op agarplaten.
  7. Repliceren de vier arrays op hetzelfde medium te koloniegrootte standaardiseren met behulp van een 1536 pin-tool.
  8. Incubeer de platen gedurende twee dagen bij 30 ° C.

4. High-throughput DHFR--PCA Procedure

  1. Inoculeer een cultuur van het aas stam (DHFR F [1,2] fusie) verkregen uit stap 1.1.1 of 1.1.2 in 20 ml vloeibaar YPD + Nat in een 50 ml buis (figuur 2B).
  2. Incubeer gedurende twee dagen bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm om de kweek tot verzadiging bereiken.
  3. Na twee dagen incubatie plaat 5 ml van de kweek op een YPD + Nat omnitray. Laat cellen adsorberen op het oppervlak voor 5-10 minuten en verwijder de overtollige vloeistof (Figuur 2B). Herhaal tWice tot drie replica's te maken.
  4. Incubeer gedurende twee dagen bij 30 ° C.
  5. Print het aas stam uit stappen 4.3 en 4.4 op 12 YPD platen (genoeg om de paring vier borden van de DHFR- F [3] verzameling × drie duplo) met een 1536 pin-instrument met behulp van elk gazon cel niet meer dan vier keer.
  6. Druk de array van de DHFR F [3] verzamelen boven het aas cellen met de 1536 pen-gereedschap (figuur 2C).
  7. Laat de stammen mate door incubatie gedurende twee dagen bij 30 ° C.
  8. Selecteer diploïde cellen door drukken kolonies op omnitrays met YPD + hygB + Nat (figuur 2C).
  9. Incubeer gedurende twee dagen bij 30 ° C.
  10. Herhaal diploïde selectie zoals beschreven in stap 4.8 en 4.9 (figuur 2B).
  11. Bereid platen met media met MTX (MTX gemiddeld) een dag voor gebruik de volgende stappen 21 (LET OP:. Wees voorzichtig bij het ​​werken met MTX, omdat het een giftige stof Draag altijd handschoenen, protectie bril en een laboratoriumjas bij het ​​hanteren van het) (figuur 2C):
    1. Bereid de 10x-Lys / met / ade aminozuur drop-out in gedeïoniseerd water. Filter-steriliseer de drop-out in een steriele fles met een 0,2 urn spuitfilter steriele of, indien nodig in grote hoeveelheden, een 0,2 urn dop filtratietrechter (Tabel 1).
    2. Bereid een 10 mg / ml MTX voorraadoplossing in dimethylsulfoxide (DMSO). Onmiddellijk na bereiding van de oplossing en vries de rest bij -20 ° C. Bescherm het tegen licht, omdat het lichtgevoelige. Laat MTX weer niet na ontdooiing bevriezen.
    3. Bereid de media als volgt (gemiddeld ingrediënten en hoeveelheden zijn dezelfde als die in Tarassov et al. 11):
      1. Voor één liter medium, meng twee kolven: 1) 6.69 g giststikstofbase zonder aminozuren en zonder ammoniumsulfaat en 330 ml gedeïoniseerd water; 2) 25 g nobel agar en 500 ml gedeïoniseerd water.
      2. Autoclaaf kolven bij 121 ° C gedurende 20 min.
      3. Equilibreer temperatuur in een waterbad bij 55 ° C gedurende ten minste één uur.
      4. Meng de twee flessen bij elkaar en voeg 50 ml steriel 40% glucose, 100 ml 10x steriele drop-out, en 20 ml van MTX 10 mg / ml.
      5. Giet 35 ml (zie opmerking hieronder) van het medium in omnitrays. Laat stollen voor minstens een uur en een half. Schild platen tegen licht.
        OPMERKING: Hier gieten 35 ml medium per omnitray kritisch gelijke dikte plaat, wat belangrijk is voor alle daaropvolgende stappen garanderen.
  12. Opslagfolies van de tweede ronde van diploïde selectie met robotica platform of met een gewone digitale camera uniforme plaat verlichting. Gebruik deze foto's om lege posities op de arrays te identificeren bij het uitvoeren van de downstream-analyse. Zorg ervoor dat de parameters van de camera zijn altijd hetzelfde en dat de robot licht is ingeschakeld.
  13. Print diploïde cellen op MTX media using van de 1536 pin-tool.
  14. Incubeer gedurende vier dagen bij 30 ° C in plastic zakken om uitdroging te voorkomen.
  15. Bereid een tweede partij van omnitrays met MTX medium zoals beschreven in stap 4.11.
  16. Na vier dagen incuberen opslagfolies met de robot platform of gewone digitale camera. Zorg ervoor dat de parameters van de camera zijn altijd hetzelfde en dat de robot licht is ingeschakeld.
  17. Voer een tweede ronde van MTX selectie door repliceren de cellen op de tweede partij van MTX medium.
    LET OP: Dit zal de achtergrond groei van PCA spanningen verminderen en daarmee de kwantitatieve resolutie.
  18. Incubeer gedurende vier dagen bij 30 ° C in plastic zakken om uitdroging te voorkomen.
  19. Afbeelding platen zoals beschreven in stap 4.16.

5. Image Analysis

  1. Analyseer beelden van kolonie arrays met aangepaste ImageJ 31 scripts of met behulp van gepubliceerde software, zoals kolonisator, Ht kolonie raster analyzer, Cell profiler, Kolonie Imager, ScreenMill, YeastXtract en gitter (gecompileerd in 32). Afbeelding analyse moet de uitgang van een of meerdere spreadsheets bevatten kolonie maten voor elke positie van elke array, gebruik maken van deze kolonie grootte voor alle downstream-analyses.
    OPMERKING: In deze studie hebben we gebruik gemaakt van een aangepaste ImageJ script in Leducq et al 33 (zie discussie sectie voor meer details)..

6. Data Analysis

OPMERKING: Resultaten van beeldanalyse kan in een tabulator worden verwerkt, zoals Excel of met behulp van een scripttaal zoals R 34. De volgende stappen beschrijven de procedure met behulp van een aangepaste ImageJ 31 script.

  1. Met behulp van een aangepast script, aaneenschakelen output bestanden van beeldanalyse en annoteren elke rij met de plaat en zeef informatie als bij het ​​tweede Aanvullend tabel 1.
  2. Log 2 transformeren de kolonie grootte waarden (Integrated dichtheid of kolonie gebied, hier, kolom "IntDenBackSub & #8221; van aanvullende Tabel 1 werd gebruikt).
    OPMERKING: Waarde distributie zal zien zoals in figuur 3A.
  3. Normaliseren deze waarden door het aftrekken van de gemiddelde waarde van elke plaat.
    OPMERKING: Deze stap controles voor plaat vooroordeel dat kan het gevolg zijn van ongelijke media hoeveelheid of variatie in de automatische beeldopname, en vermindert de inter-repliceren variantie (Figuur 3B).
  4. Controleer replica correleren met elkaar (figuur 3C) de reproduceerbaarheid van de proeven te beoordelen.
  5. Om onderscheid interactie van niet-interagerende lokaas-prooi paren, stellen een veel vertrouwen grenswaarde, zijnde de 95e percentiel van de verdeling van de L-DHFR F [3] controles.
    Opmerking: In dit experiment komt dit overeen met 3.39 (Figuur 3D). Alternatief kan een drempel op basis van de overlap met bekende fysieke interactors zoals vermeld in de Biogrid 35 worden gebruikt.Zie de bespreking voor meer details.
  6. Voor elke aas, prooien filter geïdentificeerd als betrokken bij vals positieve interacties in DHFR-PCA-schermen (zie bespreking voor meer details) en in aanvullende tabel 2 (aangeduid als "1" in de kolom "gefilterd") vermeld.
  7. Middel de Log2 genormaliseerde kolonie maten van de drie herhalingen van elke interactie (kolom 'Gemiddelde score "in aanvullende tabel 2).

7. Validatie van Physical Interactors Met behulp van kleinschalige experimenten

OPMERKING: Elke PPI van bijzonder belang met een score boven of in de buurt van de toegepaste drempel kan worden gevalideerd met het DHFR-PCA-test in een kleinschalig experimenteel design met een groei assay op vaste of vloeibare MTX medium. De onderstaande stappen tonen de procedure om diploïde PCA stammen handmatig te bouwen en uit te voeren ter plekke testen op MTX medium. De experimentator moet deze stappen uit te voeren voor alle necessary controles (aas-DHFR F [1,2] x L-DHFR F [3], Zipper-linker-DHFR diploïde stammen en linker-DHFR diploïde stam).

  1. Plaat 2-3 ul van de glycerol voorraad van het aas stam gegenereerd in 1.1.2.6), de L-DHFR- F [3] controle stam, de Zipper-linker-DHFR en linker-DHFR- diploïdestammen op YPD + Nat, YPD + hygB en tweemaal YPD + Nat + hygB media resp.
  2. Haal de prooi van belang in de DHFR- F [3] inzameling en volg de instructies in stap 1.1.1, maar streak de druk op YPD + hygB medium in plaats van YPD + Nat medium.
  3. Voer een diagnostische PCR zoals in 1.1.2.4 aan de DHFR- F bevestigen [3] fusie op de prooi locus en volgorde van het product.
  4. Inoculeer 1 ml vloeibaar YPD-medium met de haploïde stammen te paren (aas x Prooi, Aas x L-DHFR F [3] controle) en groeien ten minste twee dagen bij 30 ° C om de diploïden te vormen.
  5. Selecteer diploïden door uitstrijken 4-5 ul van de cultuur in 7.4 op vaste YPD- + hygB + Nat medium. Groeien twee dagen bij 30 ° C.
  6. Select een geïsoleerde kolonie en te groeien 's nachts in vloeibare cultuur (1 ml) om de groei analyse uit te voeren.
  7. Bereid MTX en DMSO (dezelfde ingrediënten als MTX medium, maar zonder MTX) platen per dag voor gebruik. Zie stap 4.11 voor meer details.
  8. Voer groei assay door het spotten van seriële verdunningen van de verschillende culturen over de controle (DMSO) en selectieplaten (MTX).
    1. Verdun voorkweken OD = 1.
    2. Voer vijfvoudige verdunningen (tot een verdunningsfactor van 625) in een steriele 96-well plaat.
    3. Spot 4 pi van elke verdunning op de PCA media (DMSO en MTX).
    4. Incubeer bij 30 ° C in plastic zakken om uitdroging te voorkomen.
    5. Afbeelding platen van dagen 1-7 van incubatie met behulp van de robot platform of een gewone digitale camera.

Resultaten

Aanvullend Tabel 2 is een voorbeeld van representatieve resultaten verkregen met de gisteiwit Nup82 gefuseerd aan de DHFR F [1,2] fragment als lokaas. De drempelwaarde van de L-DHFR F [3] controles kunnen worden gebruikt als empirische drempel veel vertrouwen treffers (Figuren 3D en 3E) te bepalen. Als alternatief kan de score ranking worden gebruikt om Gene Ontology verrijkingen te voeren of andere functionele analyses 36 gebaseerd op goud normen 37. De bekende fysieke interactoren van het aas kan worden opgehaald uit databases zoals Biogrid 35 en overlay op de gegevens (figuren 3E en 3F). In dit voorbeeld werden vijf van de acht groot vertrouwen treffers eerder gerapporteerd als Nup82 interactorenen twee behoren tot de Nup82 subcomplex, Nup116 en Nup159 (Figuur 3F en 3G). Het andere lid van het complex, nsp1, geen interac tonentie in ons experiment. Twee prooien, Ade17 en Tef2 (niet in figuur 3F getoond) hadden scores boven de vaste drempel toegepast, maar deze zijn waarschijnlijk vals positieven als ze interageren met bijna elke aas eiwit in PCA schermen we (ongepubliceerde resultaten) uitgevoerd. Anderzijds kan Pex30 een nieuwe fysieke bindingspartner van Nup82 vertegenwoordigen en konden we de interactie met DHFR PCA lage doorvoer (figuur 3G) bevestigen. Pex30 een peroxisomale membraan eiwit en enkele directe interacties gemeld tussen de nucleaire porie complex (NPC) en dit organel. Een twee-hybride scherm geïdentificeerd twee andere NPC eiwit, Nup53 en Asm4 (Nup59), als fysieke interactoren van Pex30 38, en een genetische interactie tussen Pex30 en Nup170 is gemeld 39. Twee andere interactiepartners gedetecteerd, Nup120 en Nup85 (Figuur 3F & 3G), maken geen deel uit van de Nup82 sub-complex, ter illustratie van het vermogenvan de DHFR-PCA om interacties te detecteren binnen en tussen subes in grotere complexen 11.

figure-results-1
Figuur 1:. Technische giststammen voor high-throughput DHFR-PCA (. Figuur aangepast van Leducq et al 2012 33) (A) Bouw van haploïde Mata en MAT α stammen te fuseren Gene1 (G1) en Gene2 (G2) met het DHFR F [1,2] -NatMX en de DHFR F [3] -HPH cassettes resp. Cassettes worden versterkt uit plasmiden pAG25-DHFR- F [1,2] en pAG32-DHFR- F [3] met forward primers G1-5 'en G2-5', en reverse primers G1-3 'en G2-3', en dan ingevoegd in het genoom aan het 3'-uiteinde van het doelwitgen door homologe recombinatie. De resulterende eiwitten, P1 en P2, respectievelijk gefuseerd aan de DHFR F [1,2] fragment (MATa) en de DHFR F [3] fragment (MATa) via een flexibele linker. (B) Controle van de constructie in (A) wordt uitgevoerd door sequentiëren de verbindingen tussen Gene1 en Gene2 ORF's en de DHFR cassette. De geconstrueerde PCA stammen van tegengestelde voortplantingstypes worden vervolgens gekoppeld aan een diploïde vormen. Diploïde stammen groeien op MTX medium als de twee complementaire DHFR fragmenten in nabijheid gebracht door een interactie tussen P1 en P2, die de activiteit van het DHFR enzyme reconstrueert. (C) Constructie van controle PCA diploïde stammen voor DHFR PCA-schermen. De negatieve controles (L-DHFR) vervaardigd door transformeren afzonderlijk haploïde MATa en MATa stammen met plasmiden p41-linker-DHFR F [1,2] en p41-linker-DHFR F [3] 11 resp. De twee stammen zijn gekoppeld met een negatief controle diploïde stam waarin het DHFR fragmenten nietelkaar (boven) aan te vullen. Positieve controles worden gebouwd met behulp van dezelfde aanpak als voor de negatieve controles, maar de plasmiden getransformeerd in haploïde stammen (p41-rits-linker-DHFR- F [1,2] (p41-ZL-DHFR- F [1,2]) en p41 -zipper-linker-DHFR F [3] (p41-ZL-DHFR F [3])) bevatten twee parallelle GCN4 leucine zipper fragmenten gefuseerd aan de complementaire DHFR fragmenten, hetgeen leidt tot een sterke en constitutieve interactie die DHFR activiteit reconstitutes (bottom ). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: High-throughput DHFR PCA-werkwijze (figuur aangepast van Leducq et al. 33) (A) De MAT α DHFR F [3] collectie. wordt gecondenseerd in een 1536 formaat door twee opeenvolgende ronden van condensatie. Eerst worden glycerol voorraad platen gecombineerd door groepen van vier op selectieve YPD + hygB medium in een 384 formaat met behulp van de 96-pins-tool. Ten tweede worden 384 arrays gecombineerd door groepen van vier op selectieve YPD + hygB medium in een 1536-formaat met behulp van de 384 pin-tool. (B) Cel gazons van het Mata PCA aas stam worden bereid door het kweken van een verzadigde cultuur van het aas stam in selectieve YPD + Nat medium en uitplaten de kweek op een YPD + Nat omnitray. (C) Deze gazons worden gebruikt om het aas stam met de DHFR F [3] collectie YPD medium paren. Cellen worden achtereenvolgens tweemaal overgedragen op YPD + hygB + Nat medium te selecteren voor diploïden en tweemaal op MTX medium tot PCA voeren. De groei zal slechts worden waargenomen op MTX medium als de DHFR- fragmenten elkaar aanvullen na een interactie tussen het aas en de prooi eiwitten.e.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3:.. Data analyse door middel van trappen van normalisatie, het bepalen van een significantiedrempel en de identificatie van positieve interacties (A) Dichtheid verdeling van de kolonie grootte op elke plaat (log 2) (B) Normalisatie door de mediaan van elk beeld corrigeert voor biases geassocieerd met plaat-to-plate effecten. (C) Temperatuurkaart die de Spearman correlatiecoëfficiënt tussen de platen, hetgeen de reproduceerbaarheid van de procedure. (D) Verspreiding van scores voor de geteste PPI en L-DHFR F [3] controles. Een harde drempelwaarde kan worden ingesteld op het 95e percentiel van de L-DHFR F [3] distributie veel vertrouwen protonpompremmers identificeren (weergegeven door een gestippelde verticalelijn). (E) Rang orde verdeling van de gemiddelde score van elke prooi. Eerder gemeld fysieke interactiepartners van Nup82p in de Biogrid 35 worden geïdentificeerd door cirkels en die gerapporteerd in deze studie worden geïdentificeerd door rode stippen. De drempel gedefinieerd in (D) wordt weergegeven als een stippellijn. (F) Netwerk toont de hoge vertrouwen PPI's die in deze studie. Blauwe randen tonen eerder gerapporteerde fysieke interactoren (Biogrid 35) en gele randen vertonen een eerder gemelde interactie met Pex30. (G) Spot-verdunningstest van PCA diploïde stammen waarbij Nup82-DHFR- F [1,2] en prooi-DHFR- F [3 ] paren geïdentificeerd als fysieke interactoren van Nup82p in de huidige studie. Groei test werd uitgevoerd in DMSO medium (MTX oplosmiddel, linker paneel) en MTX medium (rechter paneel). Negatieve controles bestaan ​​uit Nup82 DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] en Linker-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] en een positieve controle bestaat uit thij sterke interactie tussen twee leucineritssluiting groepen (rits-DHFR- F [1,2] - rits-DHFR- F [3]) waren opgenomen. Groei superieur aan de negatieve controles cel in MTX medium moet worden geïnterpreteerd als een fysieke interactie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aminozuur Hoeveelheid (g)
Adenine sulfaat * 0.2
L-Tryptofaan 0.4
L-Tyrosine 0.3
L-Fenylalanine 0.5
L-Glutaminezuur (mononatriumzout) 1.0
L-Asparagine 1.0
L-Valine 1.5
L-Threonine 2.0
L-Serine 3.75
Uracil 0.2
L-Histidine HCl 0.2
L-Arginine HCl 0.2
L-Methionine * 0.2
L-Lysine * 0.2
L-Leucine 0.6
* Ingetrokken bij het uitvoeren van standaard PCA (zoals in dit protocol), maar kan worden toegevoegd voor andere doeleinden.

Tabel 1:. Samenstelling van de 10X-Lys / met / ade drop-out in het MTX medium hoeveelheden zijn voor een liter 10x drop-out. Sterretjes geven de verbindingen die voor de standaard MTX medium moet worden ingetrokken, maar die kunnen worden toegevoegd voor andere doeleinden.

Aanvullende Tabel 1:. Gecombineerde gegevens van de 12 testplaten Tabel 1 bevat de aaneengeschakelde data van de ImageJ analyse uitgevoerd met behulp van een aangepaste ImageJ script met elke rij overeenkomt met een enkele positie op elke 1.536 array. Daarnaast heeft elke rij is geannoteerd met de informatie over het beeldbestand, DHFR- collectie plaat, repliceren, ORF en eiwit naam.

Aanvullend Tabel 2:. Gemiddelde genormaliseerde groei per stam Tabel 2 bevat de gemiddelde Log 2 genormaliseerde groei elke stam van de collectie samen met de standaardafwijking. Gefilterd prooien, hits en bekende fysieke interactoren worden geïdentificeerd in aparte kolommen.

Discussie

We beschrijven een protocol gebaseerd op het DHFR-PCA-test waarmee de systematische identificatie van fysieke interactoren voor een bepaalde aas eiwit op high-throughput. Dit protocol kan worden aangepast door het screenen voor aas, en dit op elk gewenst niveau van replicatie. We tonen de betrouwbaarheid van dit protocol door de identificatie van fysieke interactie partners voor een aas eiwit betrokken bij de Nuclear Pore Complex: Nup82. Onze analyse nodig om de vijf eerder gerapporteerde interactoren en één niet eerder gemeld interactor (Figuren 3F & 3G) vinden, aandacht voor de mogelijkheden van de methode om de gisteiwit interactoom bestuderen.

De hier beschreven protocol omvat verschillende kritische stappen waaraan de experimentator moet letten. We raden aan om 1) Zorg ervoor dat het aas DHFR- F [1,2] fusie juiste (Figuur 1B) is; Dit kan worden bereikt door sequencing de constructie en MEASURing juiste eiwitexpressie met behulp van een anti-DHFR F [1,2] of anti-DHFR F [3] antilichaam; 2) Voorafgaand aan het begin het scherm, is het raadzaam om te controleren of er een aas van belang vertoont promiscue interacties in PCA-schermen. Dit kan door controlefuncties schermen met aas gekruist met de juiste L-DHFR controle of handmatig paren het aas met de juiste L-DHFR besturing en het uitvoeren van een groei assay MTX medium. 3) De platen moeten worden gestort op de dag voordat ze worden gebruikt, zodat vocht optimaal is voor cel hechting op de agar oppervlak tijdens het drukproces; 4) Bron platen mag niet meer dan vier keer worden gebruikt om voldoende cellen te brengen op de plaats van bestemming plaat. Het verhogen van het aantal kopieën van de bestemming plaat kan worden gedaan door opeenvolgende stappen van expansie (bv 4 kopieën -> 16 kopieën -> 64 exemplaren). Alternatief kunnen cellen worden opgehaald op verschillende posities op de grasvelden of de kolonie verschillende ronden van replicatie; 5) Als er meerdere positions worden vermist na de diploïde selectie (s), zorg ervoor dat de bron platen niet te vaak werden gebruikt bij de paring stap (stappen 4,5-4,7); 6) Zorg ervoor dat de MTX medium bevat alle essentiële ingrediënten in de juiste concentraties. Inderdaad, als geen groei waargenomen op het MTX medium, kan het zijn omdat er geen interactie is detecteerbaar door PCA voor de eiwitten van belang of het MTX medium was niet goed voorbereid. Om het medium mogelijk maakt groei van stammen tonen DHFR fragmenten complementatie kan een constitutieve interactie toegevoegd lege posities van het verzamelen en gebruikt als een positieve controle zoals DHFR fragmenten gefuseerd aan leucine zipper eenheden 33 (figuur 1C). Parallel testen met behulp van de linker-DHFR fragmenten of de rits-linker-DHFR fragmenten zal toestaan ​​om onderscheid te maken tussen de voorwaarden die het mogelijk maken alle cellen om te groeien (lage MTX concentratie of aas eiwit die de neiging hebben om vals positieve interacties te maken, als descrhieronder IBED) en omstandigheden die de groei van alle stammen (MTX concentratie te hoog of essentieel ingrediënt ontbreekt in het medium) te voorkomen; 7) Gezien het feit dat PCA wordt uitgevoerd door middel van opeenvolgende rondes van herhalingen van het ene medium naar het andere, kan kruisbesmetting tussen stammen tussen verschillende platen optreden als, bijvoorbeeld, de pin-tool is niet goed gesteriliseerd tussen replicatie rondes en / of de laatste water bad (dwz natte station) in het sterilisatieproces wordt verontreinigd door kolonies van replicatie eerdere rondes. Verschillende posities op de arrays zijn leeg en kan dus gebruikt worden als controle posities waar geen groei worden geobserveerd om cross-verontreinigingen te detecteren.

Beeldanalyse kan worden uitgevoerd met behulp van een aantal gepubliceerde software (zie hoofdstuk 5 van het protocol) of een aangepaste script. 1) Het script trekt pixelwaarden van een leeg bord om de waarden van elke plaat pixel om samen: in deze studie, de aangepaste script de volgende stappen uitvoertrrect voor verlichting vooroordelen. 2) Het script converteert elk-achtergrond gecorrigeerde foto naar binair behulp van een pixel waarde drempel van 10. 3) Voor elke 1.536 posities van elke plaat, bepaald door overlappen een rechthoek op de rand kolonies, het script loopt ImageJ "Analyseren deeltjes ... "functie in een cirkelvormige selectie. De cirkelselectie wordt ingesteld met een straal gelijk aan het interval tussen twee posities minus 10 pixels. 4) Het script selecteert het dichtst deeltje van het centrum van de selectie en bevestigt als kolonie of de locatie is niet meer dan de helft tussen twee kolonies van het centrum van de selectie. 5) Het script meet pixelwaarden van de geselecteerde deeltjes op de achtergrond gecorrigeerde beeld. 6) Om eventuele resterende achtergrond verlichting vooroordelen verder te corrigeren, het script trekt de gemiddelde waarde van alle pixels uit de circulaire selectie die geen deel uitmaken van een deeltje te pixelwaarden van de kolonie waren. De som van deze gecorrigeerde pixelwaardes, opgeslagen in de kolom "IntDenBackSub" de aanvullende tabel 1 worden gebruikt als een maat voor koloniegrootte.

Een kritische stap in de analyse deel is de keuze van de significantiedrempel. Hier, kozen we een drempel op basis van de verdeling van de negatieve L-DHFR F [3] controles, maar afhankelijk van het doel van het scherm, kunnen dergelijke drempel te streng zijn. Inderdaad, L-DHFR F [3] controles overexpressie (sterke TEF promoter) dat de complementaire fragmenten spontaan vullen elkaar en deze zijn dus niet representatief voor de expressie van de meeste eiwitten. Dit wordt benadrukt door het feit dat de verdeling van de L-DHFR F [3] controles is hoger dan het gemiddelde van de achtergrond groei (figuur 3D). Dus sommige interacties met scores onder deze strenge drempel maar die duidelijk buiten de achtergrond groei verdeling kan worden beschouwd als mogelijke hits die kunnen voorstellen, bijvoorbeeld tijdelijke of zwakke interacties. Deze kunnen verder worden onderzocht en cross-gevalideerd als, bijvoorbeeld, worden de twee eiwitten niet tot expressie op niveaus die de spontane complementatie van de DHFR fragmenten zoals de L-DHFR controles kunnen toestaan. Als alternatief kan men een significantiedrempel gebaseerd op de verhouding van overlap met gerapporteerde fysieke interactors in databases zoals Biogrid 35 vastgesteld om het percentage ware positieven dan valse positieven te maximaliseren. Anders dan het gebruik van de L-DHFR distributie dit alternatief niet altijd haalbaar indien bijvoorbeeld het aantal bekende fysieke interactors niet voldoende hoog. Bovendien is de keuze van de significantiedrempel heeft een impact op het aandeel van valse positieven en valse negatieven in de uiteindelijke dataset. Inderdaad, als andere PPI detectietest, vals positieven resulteren uit aspecifieke interactie van een eiwit met het DHFR-fusie-eiwit als bijvoorbeeld het eiwit veel voorkomt als eerder vermeld. Ditwordt geïllustreerd door het feit dat sommige prooien systematisch interactie met lokaas eiwitten in PCA schermen en dus moet de analyse 11 (bijv Tef2 en Ade17 en aanvullende tabel 2) worden verwijderd. Om dit probleem, een controle PCA scherm van de twee collecties tegen de juiste L-DHFR- controle te omzeilen (F [1,2] of F [3]) om aas en prooien tentoonstellen spontane DHFR- fragmenteert complementatie kan in de bijzondere voorwaarden worden uitgevoerd identificeren van elk scherm. Bovendien uitvoeren van een Gene Ontology verrijking analyse kan het vertrouwen in de gegevens beter als de functie van een bepaalde aas bekend. Anderzijds kan DHFR-PCA tot valse negatieven geven om verschillende redenen: 1) niet alle eiwitten worden gefuseerd aan het DHFR fragmenten aangezien deze de proteïnen destabiliseren of indien de lokalisatie wijzigen, bijvoorbeeld het DHFR fusie met het C-terminus interfereert met lokalisatiesignaal; 2) DHFR- reconstitutie in een aantal cellulaire compartimenten benay produceert folaat, bijvoorbeeld als een essentiële precursor voor de synthese van foliumzuur niet beschikbaar is; 3) C-uiteinden moeten binnen een afstand van 8 nm voor DHFR complementatie optreden 11. Zo kan een bekende interactie niet gedetecteerd als hun C-termini niet dicht genoeg in de ruimte. Dit wordt hier geïllustreerd door het feit dat een groot deel van Nup82 fysieke interactie gerapporteerd in databases, waarvan de meeste zijn indirect, werden niet in onze assay gedetecteerd. Evenzo zullen de interacties tussen membraaneiwitten waarvan de C-uiteinden zijn trans ten opzichte van het membraan niet leidt tot DHFR fragmenten complementatie en niet wordt gedetecteerd 11. Beperkingen 1) en 3) kan relatief eenvoudig worden omzeild door het fuseren van het DHFR fragment met de N-termini van het eiwit. Hierdoor kan voorkomen dat te bemoeien met een lokalisatie signaal in de buurt van de C-uiteinden en kan toestaan ​​om een interactie tussen membraaneiwitten wiens N- en C-terminus te detecteren zijn in cis relatievehet membraan.

Verschillende problemen blijven in de studie van PIN (besproken in 2,3). De kaarten van pincodes dusver geproduceerd zijn grotendeels beschreven in een enkele experimentele conditie voor elke soort en bieden daarmee een enkele momentopname van hoe eiwitten netwerken zouden kunnen worden georganiseerd. Er is daarom behoefte aan de verkenning van andere experimentele condities om te zien hoe pincodes kunnen worden gereorganiseerd in reactie op veranderingen in het milieu, specifieke stimuli, over ontwikkeling of volgende mutaties. Deze problemen worden overwonnen door de ontwikkeling van nieuwe technologieën voor het ondervragen PPI in real-time, in levende cellen en door aanpassing gangbare technieken zodat ze kunnen worden gebruikt door een grotere gemeenschap laboratoria. Als kwantitatieve techniek die veranderingen detecteren in de hoeveelheid DHFR complementatie complexen 27 kunnen DHFR PCA worden aangepast aan deze uitdagingen te overwinnen en is gebruikt om te bestuderen hoe PPI worden beïnvloed door een DNA beschadigend agens 22 , Chemische stoffen 25, gendeleties 23,26 of in andere gist soorten en hun hybriden 33. Het verkennen van deze nieuwe dimensies zullen steeds belangrijker geworden om de dynamiek van de PIN te onthullen.

Openbaarmakingen

Een deel van de open vergoedingen voor dit artikel toegang publicatie werden betaald door S & P Robotics.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institute of Health Research (CIHR) Grants 191.597, 299.432 en 324.265, een Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery subsidie ​​en een Human Frontier Science Program subsidie ​​aan CRL. CRL is een CIHR New Investigator. Guillaume Diss wordt ondersteund door een PROTEO fellowship. Samuel Rochette wordt ondersteund door NSERC en FRQNT beurzen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioMatrix Robot, Bench-top ConfigurationS&P Robotics Inc.BM5-BC
96-format Pin-toolS&P Robotics Inc.PH-96-10Standaard 96-format Pin-tool met 96 hoogprecisie zwevende pinnen
384-format Pin-toolS&P Robotics Inc.PH-384-10Standaard 384-format Pin-tool met 384 hoogprecisie zwevende pinnen
1536-format Pin-toolS&P Robotics Inc.PH-1536-05Op maat gemaakte 1536-format Pin-tool met 0,5mm hoogprecisie zwevende pinnen
Geautomatiseerd beeldvormingsmodule S&P Robotics Inc.IMG-02
Methotrexaat Bioshop Canada Inc.MTX440 VOORZICHTIG: toxische verbinding
Hygromycine B Bioshop Canada Inc.HYG003
Nourseothricine dihydrogesulfaatWerner BioAgents5010000
Gist-Interactoom Collectie Thermo ScientificYSC5849
Omni Tray met deksel steriel Thermo Scientific242811
Anti-DHFR F[1,2] antilichaam Sigma-AldrichD1067
Anti-DHFR F[3] antilichaam  Sigma-AldrichD0942

Referenties

  1. Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92, 291-294 (1998).
  2. Diss, G., et al. Integrative avenues for exploring the dynamics and evolution of protein interaction networks. Curr Opin Biotechnol. 24, 775-783 (2013).
  3. Vidal, M., Cusick, M. E., Barabasi, A. L. Interactome networks and human disease. Cell. 144, 986-998 (2011).
  4. Hu, P., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS biology. 7, e96(2009).
  5. Arifuzzaman, M., et al. Large-scale identification of protein-protein interaction of Escherichia coli K-12. Genome Res. 16, 686-691 (2006).
  6. Rajagopala, S. V., et al. The binary protein-protein interaction landscape of Escherichia coli. Nature biotechnology. 32, 285-290 (2014).
  7. Arabidopsis-Interactome-Mapping-Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
  8. Babu, M., et al. Interaction landscape of membrane-protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 489, 585-589 (2012).
  9. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
  10. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415, 141-147 (2002).
  11. Tarassov, K., et al. An in vivo map of the yeast protein interactome. Science. 320, 1465-1470 (2008).
  12. Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
  13. Guruharsha, K. G., et al. A protein complex network of Drosophila melanogaster. Cell. 147, 690-703 (2011).
  14. Li, S., et al. A map of the interactome network of the metazoan C. elegans. Science. 303, 540-543 (2004).
  15. Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
  16. Landry, C. R., Levy, E. D., Abd Rabbo, D., Tarassov, K., Michnick, S. W. Extracting insight from noisy cellular networks. Cell. 155, 983-989 (2013).
  17. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
  18. Wodak, S. J., Vlasblom, J., Turinsky, A. L., Pu, S. Protein-protein interaction networks: the puzzling riches. Current opinion in structural biology. 23, 941-953 (2013).
  19. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  20. Dunham, W. H., Mullin, M., Gingras, A. C. Affinity-purification coupled to mass spectrometry: basic principles and strategies. Proteomics. 12, 1576-1590 (2012).
  21. Michnick, S. W., Ear, P. H., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods Enzymol. 470, 335-368 (2010).
  22. Rochette, S., Gagnon-Arsenault, I., Diss, G., Landry, C. R. Modulation of the yeast protein interactome in response to DNA damage. Journal of proteomics. 100, 25-36 (2014).
  23. Diss, G., Dube, A. K., Boutin, J., Gagnon-Arsenault, I., Landry, C. R. A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells. Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).
  24. Gagnon-Arsenault, I., et al. Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication. Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).
  25. Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. P. Multiplex assay for condition-dependent changes in protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9213-9218 (2012).
  26. Lev, I., et al. Reverse PCA, a systematic approach for identifying genes important for the physical interaction between protein pairs. PLoS Genet. 9, e1003838(2013).
  27. Freschi, L., Torres-Quiroz, F., Dube, A. K., Landry, C. R. qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells. Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).
  28. Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymol. 350, 87-96 (2002).
  30. Schuldiner, M., Collins, S. R., Weissman, J. S., Krogan, N. J. Quantitative genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae using epistatic miniarray profiles (E-MAPs) and its application to chromatin functions. Methods. 40, 344-352 (2006).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  32. Wagih, O., Parts, L. gitter: A Robust and Accurate Method for Quantification of Colony Sizes From Plate Images. G3 (Bethesda). 4 (3), 547-552 (2014).
  33. Leducq, J. B., et al. Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization. PLoS Genet. 8, e1003161(2012).
  34. Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).
  35. Stark, C., et al. BioGRID: a general repository for interaction datasets. Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).
  36. Vinayagam, A., et al. Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets. Science signaling. 6, rs5(2013).
  37. Jansen, R., Gerstein, M. Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction. Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).
  38. Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).
  39. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).

Herprints en machtigingen

Tags

Gist PCA methodeDHFR fragmentfusiemethotrexateselectiekolonie arrays met hoge dichtheidparing via robotplatformDHFR reconstitutiekwantificeringanalyse van koloniegrootteendogene promotorexpressie
Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.