Methodenartikel

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

DOI:

10.3791/52259

⸱

3 januari 2015

 ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jaren van onderzoek wijzen uit dat eierstokkankers een heterogene mix van cellen herbergen, inclusief een subpopulatie van zogenaamde “kanker-stamcellen” (CSC's) die verantwoordelijk zijn voor tumorinitiatie, onderhoud en terugval na conventionele chemotherapieën. Identificatie van eierstokkanker-CSC's is daarom een belangrijk doel. Een veel gebruikte methode om CSC-potentieel in vitro te beoordelen is de sferen-assay, waarbij cellen worden geplaatst onder niet-adherente kweekcondities in serumvrij medium aangevuld met groeifactoren en de vorming van sferen wordt geëvalueerd na enkele dagen. Hier beoordelen we de momenteel beschikbare protocollen voor humane eierstokkanker-sferen-assays en voeren een naast elkaar vergelijkende analyse uit tussen veelgebruikte multicellulaire assays en een nauwkeuriger systeem gebaseerd op het plateren van enkele cellen. Onze resultaten geven aan dat zowel multicellulaire als op enkele cellen gebaseerde sferen-assays kunnen worden gebruikt om de vorming van sferen in vitro te onderzoeken. De meer bewerkelijk en duurdere op enkele cellen gebaseerde assays zijn geschikter voor functionele beoordeling van individuele cellen en leiden tot algemeen nauwkeuriger resultaten, terwijl multicellulaire assays sterk kunnen worden beïnvloed door de dichtheid van de geplateerde cellen en vereisen voorafgaande titratie-experimenten. Aanvulling van methylcellulose op multicellulaire assays kan effectief worden gebruikt om mechanische artefacten te verminderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is toenemend bewijs dat ovariële carcinomen bestaan uit heterogene mengsels van cellen en zogenaamde “kankerstamcellen” (CSCs) bevatten die verantwoordelijk zijn voor het initiëren, onderhouden en terugvallen van de ziekte na conventionele cytotoxische therapieën1-3. Daarom is de ontwikkeling van moleculaire strategieën die zich richten op ovariële CSCs een belangrijk doel en belooft de therapie van patiënten met ovariumkanker te verbeteren.

Een voorwaarde voor het begrijpen van de moleculaire kenmerken van CSCs is hun betrouwbare isolatie van de niet-CSCs. Echter, de identificatie van ovariële CSCs lijkt uitdagend. Terwijl CD133-expressie en aldehyde dehydrogenase (ALDH)-activiteit4,5 zijn gerapporteerd als markering voor ovariële CSCs, geven sommige gegevens aan dat deze markers onstabiel zijn6. Consistent, in ovariële kanker, anders dan bijvoorbeeld in borstcarcinoom7, associeert expressie van ALDH1 met een gunstig resultaat8 en expressie van de voorgestelde stamcelmarker CD44-variant heeft geen prognostische waarde9. Meer recentelijk hebben we aangetoond dat expressie van het embryonale stamcel-eiwit SOX2 stamceeldheid verleent aan ovariële carcinoomcellen10 en hoge SOX2-expressie associeert met klinisch agressieve ovariële en borstcarcinomen11,12. Daarom gebruiken we in dit rapport een lentivirale reporterconstruct die een rood fluorescent eiwit (RFP) bevat waarvan de expressie wordt gecontroleerd door een SOX2-regulerende regio, als een methode om veronderstelde ovariële CSCs te isoleren.

Per definitie kunnen CSCs zichzelf zowel vernieuwen als differentiëren, waardoor ze alle tumorceltypen voortbrengen. Veronderstelde CSC-populaties moeten worden geanalyseerd in functionele assays die in vivo worden uitgevoerd. Om duidelijke redenen zijn dergelijke functionele tests bij menselijke cellen beperkt tot xenograft-assays, meestal bestaande uit transplantatie van menselijke tumorcellen in immuungecompromitteerde muizen10,13.

Een alternatieve in vitro-methode werd aangeboden door Brent Reynolds en Sam Weiss die voor het eerst het zogenaamde neurosfeer-assay rapporteerden als een surrogaat-assay voor het evalueren van stampotentieel in neurale cellen14. Dontu en collega's bevestigden later het gebruik van deze assay voor evaluatie van stamcelpotentieel in borstcellen15,16. Hier werden humane mammaire cellen in verschillende aantallen in serumvrij medium geplaatst, aangevuld met epidermale groeifactor (EGF), basic fibroblast groeifactor (bFGF), B-27 en heparine en gecultiveerd onder niet-adherente omstandigheden gedurende zeven tot tien dagen voordat sfeersvorming werd beoordeeld door microscopie. Door dit protocol te volgen met enkele aanpassingen in celaantal, groeimedium en supplementen, hebben verschillende groepen in vitro stamcelpotentieel van verschillende kankertypen onderzocht, zoals borst17, hersenen18, pancreas19 en colon20 tumoren. In ovariële carcinoom hebben we recent de haalbaarheid van de sfeers-assay gerapporteerd en de resultaten ervan vergeleken met de resultaten die werden verzameld in in vivo murine xenograft-modellen10. We ontdekten dat overexpressie van het stamcel-eiwit SOX2 zowel in vitro sfeersvorming als in vivo tumorigeniteit van humane ovariële carcinoomcellen versterkte10. Echter, de frequentie van sfeers-initiërende cellen was hoger dan de frequentie van tumor-initiërende cellen gemeten in vivo10, wat suggereert dat ofwel de sfeers-assay kan leiden tot valse positieve resultaten vanwege technische redenen of, alternatief, dat de in vivo-assay inefficiënt kan zijn en resulteren in valse negatieve resultaten.

In dit rapport analyseren we multi-celgebaseerde ovariële sfeers-assays in meer detail, beoordelen we de verschillende protocollen die beschikbaar zijn in de literatuur en vergelijken we deze met een enkel-celgebaseerde assay. We tonen aan dat de enkel-celgebaseerde assay nauwkeuriger en reproduceerbaardere resultaten levert dan multi-celgebaseerde assays, die sterk kunnen worden beïnvloed door de dichtheid van de geplateerde cellen, tenzij methylcellulose wordt toegevoegd aan de culturen om cellen te immobiliseren. Echter, zelfs in enkel-celgebaseerde assays, wordt in vitro sfeers-initiërend potentieel waargenomen met een hogere frequentie dan in vivo tumor-initiërend potentieel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van OVCAR-3 Human ovariumcarcinoom cellen die stabiel Getransduceerde met Lentivirussen Bevat de SOX2 Regulatory Gewest Reporter Construct

  1. Genereren lentivirale deeltjes door transfectie van de HEK 293T-inpakcellijn met een reporterconstruct herkennen van een SOX2 regulerende regio zoals beschreven 10,21.
    OPMERKING: De verslaggever construct bevat verder een destabilisatie domein van de ProteoTuner Shield System voorsprong op de tdTomato fluorescentie eiwit. Shield1 bindt aan de destabilisatie domein aldus het proteasoom de fluorescentie-eiwit 22 degraderen voorkomen.
  2. Transduceren OVCAR-3 cellen met lentivirale deeltjes gedurende een periode van 24 uur. Daarna verwijdert de virale supernatant en was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gekweekt in compleet medium (RPMI aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine).
  3. 48 uur later, 10 ug / ml puromycin toegevoegd aan de kweken en gedurende 5 dagen selectie van goed getransduceerde cellen mogelijk.

2. Voorbereiding van Cell Sorting en Plating

  1. Voeg Shield1 bij 1: 1000 verdunning 24 uur voorafgaand aan het sorteren van cellen. Gebruik stabiel getransduceerde OVCAR-3 cellen zonder Shield1 behandeling negatieve controles (figuur 1). Zuig media van kolf, wassen cellen met 1x PBS en trypsinize cellen met 0,05% trypsine-EDTA gedurende 3 min.
  2. Stop trypsine met compleet medium (zie hierboven), telling celaantallen Centrifugeer cellen bij 300 g bij kamertemperatuur (15-25 ° C) gedurende 5 min.
  3. Giet supernatant en resuspendeer cellen zorgvuldig in 0,5-1 ml steriele PBS.
  4. Gebruik 40 micrometer cel zeefdop filter om eencellige suspensie te verkrijgen.
  5. Pas celgetal tot 5 miljoen cellen per ml.
  6. Bereid ultra low-attachment 96-well platen met 100 ul bollen medium (MEGM aangevuld met groeifactoren, cytokines, en supplementen,B-27, heparine-natrium; of DMEM / F12 aangevuld met groeifactoren, cytokines, en supplementen, B-27, heparine-natrium met of zonder toevoeging van 1% methylcellulose, zie ook tabel 1). Eventueel antibiotica aan het medium bij een concentratie van 100 E / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine om het risico van mogelijke besmetting te minimaliseren.
  7. Sorteer RFP + en RFP- cellen in bereid 96 putjes van boven, 1 cel per putje (eencellige gebaseerde sferen assay) en 100 cellen per putje (meerdere cellen gebaseerde assay bollen), respectievelijk. Uit te voeren soort op commercieel beschikbare celsorteerder (zie Materials) met behulp van enkele cel modus Sorteren setup: 100 μ mondstuk, schede druk 20 psi, en de opbrengst masker 0, zuiverheid masker 32, fase masker 16.
  8. Beoordeel plating efficiëntie door microscopisch maken van putjes die cellen (voor de enkele cellen gebaseerde assay) en celaantallen telling in afzonderlijke putjes (voor meerdere cellen gebaseerde assay Figuur 2 ).
  9. Incubeer cellen onder standaardomstandigheden in sferen medium (voor de samenstelling zie stap 2.6) bij 37 ° C en 5% CO2. Supplement dagelijks bFGF (20 ng / ml) en EGF (20 ng / ml).
  10. Na één week, tellen aantal opkomende tumor bolletjes met een standaard microscoop met 4x of 10x vergroting en een fluorescentie microscoop fluorescentiesignaal van het geïntegreerde reporter systeem detecteren. Telling bollen met een diameter groter dan 100 pm als "grote" bollen en bollen met een diameter 50 - 100 urn als "kleine" bolletjes (Figuur 3). Zorg ervoor dat u rekenen echte bollen en clusters niet cel.
    Opmerking: In single celgebaseerde proeven bol vorming gemakkelijker microscopisch toonde na 10 (versus 7) dagen kweken.
  11. Bereken het percentage bol vormende cellen RFP + respectievelijk RFP- cellen in één celgebaseerde proeven (een 96-well plaat voor elk experiment) of meerdere cel-based sferen assays (één goed voor elke individuele experiment) zoals gepresenteerd door Shaw et al. 16
    OPMERKING: Percentage gebied vormende cellen (%) = (aantal bollen) / (aantal gezaaide cellen) x 100

3. Seriële passage van de Bollen

  1. Breng de inhoud van elk putje in een geschikte steriele buis en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Voor multi-cel-gebaseerde sferen assays, verzamelen samen de sferen van het ene goed. Was de put 3-5 maal met PBS en centrifugeer 2 minuten langer. Voor single-cell based sferen assays, het verzamelen van individuele bollen. Door de lage aantallen cellen, gebruik 1,5 ml buizen voor centrifugatie en wasstappen.
  2. Verwijder supernatant en resuspendeer pellet in 200 ul 0.05% trypsine-EDTA.
  3. Om een ​​optimale celscheiding bereikt, incubeer de celsuspensie bij 37 ° C gedurende 5 min in een zachte shaker. Optimaliseer trypsinisatie tijd voor uw cellijn tot lagere celdood tarief: als er geen grotebollen zichtbaar vermaal voorzichtig met behulp van een 100 ul pipet tip. Bij grote bollen zijn nog steeds aanwezig, incubeer met trypsine nog eens 3 min en vervolgens overgaan tot de tritureren stap. In het geval van enkelvoudige zorg ervoor om de tijd te optimaliseren voor een optimale cel opbrengst van levende cellen tijdens de behandeling met trypsine stap cel-gebaseerde testen.
  4. Om het trypsine te inactiveren, voeg 500 ul volledig medium en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij cel assays, centrifuge extra 2 min.
  5. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen zorgvuldig in sferen medium.
  6. Gebruik een 40 micrometer cel zeefdop filter om een ​​eencellige suspensie te verkrijgen.
  7. Bij gebruik RFP + en RFP- cellen in meercellige bassed assays beoordelen het percentage fluorescerende cellen in elk putje na resuspensie via flowcytometer analyse.
  8. Voor seriële replating testen van enkele cellen, zaden 1 cel per putje in een nieuwe ultra low-attachment 96-well plaat bereid zoals hierboven gedetailleerd. Van het ene individu bol, zaad ongeveer 20 individuele putten. Voor replating testen van meerdere cellen gebaseerde primaire werelden, zaadcellen verkregen uit een bron van primaire werelden in een nieuwe 96-well plaat en tel de celaantallen volgende dag microscopie.
  9. Beoordelen van het aandeel van de-bol-vormende cellen in het voortgezet sferen testen met behulp van de formule in stap 2.11 beschreven.

4. Resultaat Analyse

  1. Resultaten van experimenten uitgevoerd in onafhankelijke triplo geanalyseerd en gebruikt t-Test tweezijdige Student's normaal verdeelde waarden en anderszins Mann-Whitney-analyse Tests voor statistische analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In conventionele bollen assays, bijna 40% van RFP + OVCAR-3 cellen versus 20% van RFP- cellen leidde tot een individuele tumor bol in de primaire gebieden assay (figuur 4A). Bovendien bollen gevormd door RFP + cellen groter in omvang dan die gevormd door RFP- cellen.

Wanneer plated in single-cell based assays, RFP + cellen vormde ook meer bollen dan RFP- cellen, ter bevestiging van de resultaten hierboven. Er was echter een tendens generatie minder bollen per uitgeplaat in d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sferen culturen zijn een gebruikte methode om kanker stamcellen potentieel te testen en te verrijken voor stamcellen-achtige cellen in een breed spectrum van menselijke tumorcellen 15,25,26. Onder deze kweekomstandigheden worden kankercellen die zelfvernieuwing vermogen missen verwacht differentiëren en uiteindelijk celdood. Hoewel ze aanvankelijk celgroepen of tumor bollen name primaire assays kunnen vormen, zijn ze niet in staat bol vormende vermogen van seriële replating stand door gebrek aan zelf-vernieuw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door een subsidie van de Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) toegekend aan C.L. We danken Dr. Martina Konantz voor kritische input en het herzien van het manuscript. We danken Emmanuel Traunecker en Toni Krebs van de DBM FACS Facility (University Hospital Basel) voor hun hulp bij FACS-sortering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Low-attachment plateCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
InsulinLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
HydrocortisonLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFLonzaCC-4136SingleQuots™ Kit
EGFSigmaE9644endconcentratie: 20 ng/ml
FGFPeproTech100-18Bendconcentratie: 20 ng/ml
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044endconcentratie: 1X
Heparine-natrium-25000 IERatiopharmN68542.02verdunning 1:1.000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Trypsine-EDTAGibco25300-054
Dulbecco’s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189verdunning 1:1.000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (poeder)Gibco42400-010
MethylcelluloseSigmaM0387
Puromycin dihydrochlorideApplichemA2856
Cell sorterBDAria III cell sorter
FACS analyzatorBDAccuri c6 flowcytometer
MicroscoopOlympusIX50 Osiris

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42(2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062(2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905(2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

OvariumkankerstamcellenSferes assaySingle cell platingMulticell assaysSOX2 reporterFluorescentiemicroscopieMethylcellulose supplementatieSecundaire sfeervormingTumorsfeervormingIdentificatie van kankerstamcellen

Gerelateerde artikelen