Methodenartikel

Nabij Infrarood (NIR) Licht Verhoogt Expressie van een marker van de mitochondriale functie in de Muis Vestibular Sensory epitheel

DOI:

10.3791/52265

⸱

14 maart 2015

 ,  ,  , 
1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale dysfunctie is een kenmerk van cellulaire veroudering. Dit artikel maakt gebruik van niet-invasieve nabij-infrarood (NIR) behandeling om de mitochondriale functie in het verouderingsproces muis vestibulair sensorische epitheel verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strategieën voor het verzwakken van achteruitgang in balans functie met toenemende leeftijd zijn voornamelijk gericht op fysieke therapieën, waaronder balans taken en oefening. Echter, deze aanpak niet in op de onderliggende oorzaken van de balans daling. Met muizen, de invloed van nabij infrarood licht (NIR) op het metabolisme van cellen in het vestibulaire sensorische epitheel werd beoordeeld. Verzamelde gegevens blijkt dat deze eenvoudig en veilig ingrijpen deze kwetsbare cellen kunnen beschermen tegen de schadelijke effecten van natuurlijke veroudering. mRNA werd geëxtraheerd uit de geïsoleerde perifere vestibulaire sensorische epithelium (crista ampullaris en utriculaire macula) en vervolgens getranscribeerd in een cDNA-bibliotheek. Deze bibliotheek werd vervolgens gehybridiseerd voor de expressie van alomtegenwoordige antioxidant (SOD-1). Antioxidant genexpressie werd vervolgens gebruikt om cellulaire metabolisme te kwantificeren. Met transcraniële levering NIR bij jonge (4 weken) en oudere (8-9 maanden) muizen, en een regeling korte behandeling (90 sec / dag gedurende 5 degen), dit werk suggereert NIR alleen kan voldoende zijn om de mitochondriale functie in het vestibulair sensorische epitheel te verbeteren. Aangezien er momenteel geen beschikbaar, betaalbaar, niet-invasieve methoden van therapie om vestibulaire haarcel functie te verbeteren, de toepassing van externe NIR-straling zorgt voor een potentiële strategie om de gevolgen van de vergrijzing op de celstofwisseling Inde vestibulair sensorische epitheel tegen te gaan.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Degressief prestaties en de daaropvolgende val komen vaak voor, en helaas vaak bepalende kenmerken van natuurlijke veroudering 1. De impact van deze daling kan zowel fysiek als sociaal, en vermindert de kwaliteit van leven van ouderen. In reactie hierop hebben de fysieke therapieën en revalidatie de focus van het onderzoek naar de watervallen geweest, maar zijn niet geassocieerd met consistente vermindering van de prevalentie van herhaald vallen. Tegelijkertijd, werken onderzoeken veranderingen in de perifere of centrale vestibulaire systeem (het systeem belast evenwicht) schaars en potentiële therapeutische strategieën gericht op deze systemen en de onderliggende oorzaken van onbalans beperkt.

Recent werk op leeftijdgebonden neurodegeneratieve stoornissen waaronder leeftijdsgebonden maculaire degeneratie 2-4, Alzheimer ziektemodellen 5-8 en ziekte van Parkinson 9-12 gebleken neuroprotectieve effecten van simple niet-invasieve toepassing van nabij-infrarood (NIR) licht. Verder, in het vestibulaire systeem NIR is gebruikt om de activiteit van vestibulaire primaire afferente neuronen in vitro 13 verhogen. Hoewel het mechanisme van de NIR licht is niet goed begrepen, hebben de meeste studies met behulp van NIR gesuggereerd dat NIR stimuleert mitochondriën complex IV (cytochroom c oxidase) 14-17 om de celstofwisseling te vergemakkelijken. In het vestibulair sensorische epitheel de subcuticulaire plaat van type I haarcellen is dicht in de mitochondriën 18 en als zodanig kan een plaats van actie voor therapeutische Nir behandeling vertegenwoordigen.

Hier wordt een korte, niet-invasieve behandeling regime van transcranially toegepast NIR die kan worden gebruikt om cellulaire metabolisme te meten (en door implicatie, mitochondriale functie) bij muizen vestibulaire sensorische epithelium wordt beschreven. Ook besproken is een preparaat van het vestibulaire sensorische epitheel en wordt aangetoond dat NIR verhoogt de expressie van een ubiquitoons anti-oxidant (superoxide dismutase 1) in het sensorische epitheel - eerder aangetoond belangrijk cochlea haar celoverleving 19 zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethiek Verklaring: Alle onderstaande procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Sydney Animal Ethics Committee.

1. Dieren

Opmerking: 1 en 8-9 maanden oude muizen (C57 / BL6) werden verkregen van de Animal Resources Centre (Perth, Australië). Muizen werden gehuisvest in Bosch Knaagdier Facility van de Universiteit van Sydney.

  1. Huis muizen in standaard muis kooien op een 12/12 uur licht / donker cyclus met toegang tot voedsel en water ad libitum.
  2. Divide muizen in elke leeftijdsgroep in nabij-infrarood (NIR) behandeld, of sham behandeld (controle) groepen ter vergelijking.

2. Nabij Infrarood (NIR) Bestraling en Sham behandeling

  1. Scheer de vacht op het hoofd-halsgebied van de muis met een elektrisch scheerapparaat zo dicht mogelijk bij snelle hergroei van haar te voorkomen vóór de voltooiing van het behandelingsregime. Om de pathogenen status van de muizen behouden, gebruikt 70% ethanolom instrumenten te reinigen tussen het scheren van dieren en F10 veterinaire ontsmettingsmiddel tussen dieren van aparte kooien. Doe dit 2-3 dagen voor het begin van de behandeling, zodat de dieren niet overdreven behandeld.
  2. Bedwingen muis door het vasthouden van de proximale uiteinde van de staart en laat hem om te ontspannen in de palm van een hand of bench top om zo spanning die kunnen leiden tot verkeerde resultaten te minimaliseren.
  3. Houd het NIR (670 nm) LED (light emitting diode) apparatuur 1-2 cm afstand van de blootgestelde (geschoren) gebied en schakel het apparaat gedurende 90 seconden (Figuur 1A).
    OPMERKING: De temperatuursverandering als gevolg van 90 sec belichting werd gemeten <0,2 ° C in 100 ml water.
  4. Herhaal de stappen 2,2-2,3 voor de schijnvertoning behandeling groep dieren, maar laat het apparaat uitgeschakeld (Figuur 1B).
  5. Herhaal stap 2,2-2,3 voor de NIR-geblokkeerde behandelingsgroep dieren maar bedekken het apparaat met aluminiumfolie.
  6. Herhaal de stappen 2,2-2,5 dagelijks om approximate 24 uur intervallen gedurende 5 opeenvolgende dagen.
  7. Pak het vestibulair sensorische epitheel (3 cristae en 1 utricular macula) van beide oren op de vijfde dag na de behandeling (zie hoofdstuk 3 hieronder).

3. Tissue Extraction 20

  1. Maak 300 ml van een glycerol-gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) bestaande uit (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucose, 250 glycerol, 2,5 KCI, 1,2 NaH 2PO 4, 1,2 MgCl2 en 2,5 CaCl2. Vóór de toevoeging van CaCl2, gas de oplossing met carbogeen (95% O2 en 5% CO2) om een pH van 7.4 vast en voorkomen kalkafzetting (troebelheid). Koel de oplossing in een -80 ° C vriezer gedurende 45 min zodat een ijs slurrie wordt gevormd.
  2. Bereid de RNA-isolatie lyseerbuffer in geëtiketteerde schroefdop microtubes (stopt de knallen van deksels toen buis drukveranderingen tussen bevriezen en ontdooien in vloeibare stikstof) volgensaan de instructies van de fabrikant of van de gebruikelijke laboratorium praktijken. Hebben vloeibare stikstof klaar in een aluminium dewarvat.
    OPMERKING: Gebruik beschermende kleding en eyeware bij de omgang met vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat vloeibare stikstof wordt gebruikt in een goed geventileerde ruimte als het volume van zijn gas vorm is ongeveer 700 maal die van zijn vloeibare vorm en kan stikken veroorzaken.
  3. Diep verdoven muizen met ketamine (400 mg / kg) via een intraperitoneale injectie. Laat de achterste ledematen reflex om volledig verdwijnen als indicatie dat muizen volledig worden verdoofd.
  4. Onthoofden muizen met scherpe roestvrijstalen schaar en maak een insnijding langs de sagittale huid van de schedel met een scheermesje (afgerond # 22). Op dit punt en de rest van de stappen 3,5-3,9, houden de neurocranium, hersenen, en de onderliggende vestibulum zo koel mogelijk door regelmatige toepassing van ijskoude ACSF over het weefsel.
  5. Met behulp van de puntige arm van standaard patroon schaar maken een kll incisie in de schedel bij Lambda en snijd langs de pijlnaad.
  6. Schuif één arm van een ondiepe rongeurs onder de pariëtale botten houdt het blad zo dicht mogelijk bij het onderste oppervlak van het bot zonder slepen van de hersenen. Beveiligen en weg te trekken van de pariëtale bot lateraal en de occipitale bot naar achteren totdat de hersenen wordt blootgesteld.
  7. Gebruik een kleine roestvrijstalen spatel en til de hersenen uit de buurt van de voorste en middelste schedelgroeve aan de evenwichtszenuw zenuw (GN VIII) bloot. Doorsnijden het lef om onnodige spanning op de primaire afferente axonen die direct innerveren het evenwichtsorgaan haarcellen te voorkomen.
  8. Verwijder de hersenen in toto na doorsnijding van GN VIII.
  9. Let op de benige labyrint met het slakkenhuis en de perifere vestibulaire organen in het midden craniale fossa. Maak twee kleine sneetjes naast elkaar benige labyrint en accijnzen de hele structuur van het vasthouden van de anterieure halfronde kanaal en later trekkenbondgenoot.
  10. Onmiddellijk onderdompelen weggesneden labyrinten in een dissectie schotel met ijskoude ACSF oplossing (zoals beschreven in stap 3.1), waarbij voortdurend perfuseren met carbogen.
  11. Onder een stereomicroscoop, houdt het labyrint van het slakkenhuis en zet het aan de bodem van de schaal met een tang.
    1. Gebruik straight fijne tang te krabben een kleine opening in het bot boven de voorste halfcirkelvormige kanaal (SSC) ampulla.
    2. Zachtjes vergroten deze opening door direct onder het bot bereiken en vegen naar buiten weg van de ampul. Wees voorzichtig hier geen tang te duwen in de opening en onder beschadiging van de fragiele membraneuze labyrint. Ga op deze manier tot de utricle, anterieure en laterale ampullen worden allemaal blootgesteld. Indien mogelijk verwijder de achterste ampulla ook.
  12. Met behulp van fijne tang, til de utricle en ampullen weg van de benige labyrint tot ze volledig vrijstaand. Waar mogelijk, houd zedoor hun bijbehorende halfcirkelvormige kanalen te voorkomen dat schade aan de sensorische epitheel. In sommige gevallen moet het proximale deel van de halfronde membraneuze kanaal te snijden met irisschaar de ampullen los van het bot.
  13. Stevig de vestibulaire organen tussen de punt van een pincet en plaats in de lyseerbuffer eerder in stap 3.2 voorbereid. Zwenk de tang rond in de buffer, die de vestibulaire organen los van de tang. Controleer dit het geval is door het brengen van de tang onder de stereomicroscoop.
    1. Schroef de microtubuli deksel en onmiddellijk het monster in vloeibare stikstof te bevriezen.

4. RNA-extractie en RT-PCR

  1. Volg standaardmethoden van boodschapper-RNA (mRNA) extractie volgens instructies van de fabrikant of de voorkeur lab protocollen.
    OPMERKING: Een commerciële kit die drager RNA's gebruikt om te helpen isoleren kleine opbrengsten van mRNA werd gebruikt in dezeprotocol. Lagere elutievolume kan worden gebruikt om eindconcentraties van mRNA te verhogen.
    OPMERKING: Negatief "geen enzym" controles (NEC) en "geen DNA template" controles (NTC's) moeten ook worden ingevuld om de geldigheid van de waargenomen effecten te waarborgen.
  2. Toepassing van standaard methoden van de reverse transcriptie van mRNA naar complementair DNA (cDNA) en versterking van target genen 21-23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het effect van NIR behandeling bij jonge (4 weken) en oudere vergelijk (8-9 maanden) muizen meten we de expressie van antioxidant superoxide dismutase 1 (SOD-1) bij jonge (n = 16) en oudere (n = 20) muizen die waren NIR-behandelde, schijn-behandelde of NIR-geblokkeerd. Figuur 2 toont een significante toename van β-actine genormaliseerde SOD-1 expressie van meer dan 2-voudig jonge NIR-behandelde dieren vergeleken met jonge schijn-behandelde dieren (p <0.01) en jonge NIR-geblokkeerde dieren (p <0...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De representatieve resultaten beschreven blijkt dat korte transcraniële levering NIR licht (90 sec / dag gedurende 5 dagen) is voldoende om de antioxiderende expressie in oudere muizen verhogen vergeleken met sham behandelde muizen. Terwijl uitgestoten warmte een bron van mitochondriale en / of neuronale activiteit zouden kunnen vormen, zoals gerapporteerd voor rat vestibulair afferentia 24 - onze meting van de warmtestraling van de NIR LED-apparaat was <0,2 ° C meer dan 90 sec, en als zodanig is het onwaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen dr Paul Witting en mevrouw Genevieve Fong erkennen voor hun hulp met mRNA extractie en PCR, en de Garnett Passe en Rodney Williams Memorial Foundation voor ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Quantum WARP 10Quantum Devices2070N030-A
Screw top microtubulesQuality Scientific Plastics520-GRD-Q
KetamineParnell, Alexandria Australia
Standard pattern scissorsFST14001-12
Carbon steel surgical blades #22LivingstoneSBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeursFST16221-14
Stereo microscopeLeica MicrosystemsA60S
Dumont #5 SF forcepsFST11252-00
Isolate II RNA Micro KitBiolineBIO-52075

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, Y., Carey, J. P., Della Santina,, C, C., Schubert, M. C., Minor, L. B. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Archives of internal medicine. 169, 938-944 (2009).
  2. Bessho, K., et al. Effect of subthreshold infrared laser treatment for drusen regression on macular autofluorescence in patients with age-related macular degeneration. Retina. 25, 981-988 (2005).
  3. Olk, R. J., et al. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration: two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology. 106, 2082-2090 (1999).
  4. Rodanant, N., et al. Predictors of drusen reduction after subthreshold infrared (810 nm) diode laser macular grid photocoagulation for nonexudative age-related macular degeneration. American journal of ophthalmology. 134, 577-585 (2002).
  5. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-beta peptide neuropathology in amyloid-beta protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 23, 521-535 (2011).
  6. Grillo, S. L., Duggett, N. A., Ennaceur, A., Chazot, P. L. Non-invasive infra-red therapy (1072 nm) reduces beta-amyloid protein levels in the brain of an Alzheimer's disease mouse model. TASTPM. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 123, 13-22 (2013).
  7. Purushothuman, S., Johnstone, D. M., Nandasena, C., Mitrofanis, J., Stone, J. Photobiomodulation with near infrared light mitigates Alzheimer's disease-related pathology in cerebral cortex - evidence from two transgenic mouse models. Alzheimer's researc., & therapy. 6, 2(2014).
  8. Sommer, A. P., et al. 670 nm laser light and EGCG complementarily reduce amyloid-beta aggregates in human neuroblastoma cells: basis for treatment of Alzheimer's disease. Photomedicine and laser surgery. 30, 54-60 (2012).
  9. Moro, C., et al. Photobiomodulation preserves behaviour and midbrain dopaminergic cells from MPTP toxicity: evidence from two mouse strains. BMC neuroscience. 14, 40(2013).
  10. Peoples, C., et al. Photobiomodulation enhances nigral dopaminergic cell survival in a chronic MPTP mouse model of Parkinson's disease. Parkinsonis., & related. 18, 469-476 (2012).
  11. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. The Journal of comparative neurology. 518, 25-40 (2010).
  12. Ying, R., Liang, H. L., Whelan, H. T., Eells, J. T., Wong-Riley, M. T. Pretreatment with near-infrared light via light-emitting diode provides added benefit against rotenone- and MPP+-induced neurotoxicity. Brain research. 1243, 167-173 (2008).
  13. Rajguru, S. M., et al. Infrared photostimulation of the crista ampullaris. The Journal of physiology. 589, 1283-1294 (2011).
  14. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  15. Desmet, K. D., et al. Clinical and experimental applications of NIR-LED photobiomodulation. Photomedicine and laser surgery. 24, 121-128 (2006).
  16. Huang, Y. Y., Chen, A. C., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose-response : a publication of International Hormesis Society. 7, 358-383 (2009).
  17. Rojas, J. C., Gonzalez-Lima, F. Low-level light therapy of the eye and brain. Eye and brain. 3, 49-67 (2011).
  18. Vranceanu, F., et al. Striated organelle, a cytoskeletal structure positioned to modulate hair-cell transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4473-4478 (2012).
  19. Johnson, K. R., et al. Separate and combined effects of Sod1 and Cdh23 mutations on age-related hearing loss and cochlear pathology in C57BL/6J mice. Hearing research. 268, 85-92 (2010).
  20. Tung, V. W., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50471(2013).
  21. Kirby, J., Menzies, F. M., Cookson, M. R., Bushby, K., Shaw, P. J. Differential gene expression in a cell culture model of SOD1-related familial motor neurone disease. Human molecular genetics. 11, 2061-2075 (2002).
  22. Parry, S. N., Ellis, N., Li, Z., Maitz, P., Witting, P. K. Myoglobin induces oxidative stress and decreases endocytosis and monolayer permissiveness in cultured kidney epithelial cells without affecting viability. Kidney and Blood Pressure Research. 31, 16-28 (2008).
  23. Saee-Rad, S., et al. Analysis of superoxide dismutase 1, dual-specificity phosphatase 1, and transforming growth factor, beta 1 genes expression in keratoconic and non-keratoconic corneas. Molecular vision. 19, 2501-2507 (2013).
  24. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  25. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of neuroscience. 120, 670-683 (2014).
  26. Moreno, L. E., et al. Infrared neural stimulation: beam path in the guinea pig cochlea. Hearing research. 282, 289-302 (2011).
  27. Curthoys, I. S. A red thread as a guide in the vestibular labyrinth. The Journal of physiology. 589, 1241-1241 (2011).
  28. Chakrabarti, S., et al. Mitochondrial Dysfunction during Brain Aging: Role of Oxidative Stress and Modulation by Antioxidant Supplementation. Aging and disease. 2, 242-256 (2011).
  29. Petrosillo, G., De Benedictis, V., Ruggiero, F. M., Paradies, G. Decline in cytochrome c oxidase activity in rat-brain mitochondria with aging. Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin. Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).
  30. Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Nabij infrarood lichtSOD 1 expressietranscrani le applicatievestibulair systeem van de muisantioxidant genanalysedensitometrische metingweefseldissectieprotocolcerebrospinale vloeistof

Gerelateerde artikelen