Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

Samenvatting

Dit protocol op inleidend niveau beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn om immunohistochemische kleuring van knaagdierhersenen te voltooien, gebruikmakend van markeringen voor microglia en neuronale elementen als voorbeeld.

Samenvatting

Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om de aanwezigheid, locatie en relatieve overvloed van antigenen in situ. Deze inleidende niveau protocol beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn voor immunohistochemische kleuring van knaagdieren hersenweefsel te voltooien, met behulp van markers voor microglia en neuronale elementen als een voorbeeld. Concreet dit document is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie visualisatie van microglia en neuronen via immunohistochemie voor Iba1 en Pan-neuronale resp. Fluorescentie double-labeling is bijzonder bruikbaar voor de lokalisatie van meerdere eiwitten in hetzelfde monster, de mogelijkheid ontstaat om interacties tussen celsoorten, receptoren, liganden nauwkeurig observeren, en / of de extracellulaire matrix ten opzichte van elkaar en proteïne co- lokalisatie binnen een enkele cel. In tegenstelling tot andere visualisatietechnieken, kan fluorescentie immunohistochemie kleurintensiteit afnamede weken tot maanden na vlekken, tenzij passende voorzorgsmaatregelen worden genomen. Ondanks deze beperking in vele toepassingen fluorescentie double-labeling heeft de voorkeur boven alternatieven zoals 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) of alkalisch fosfatase (AP), zoals fluorescentie tijdsefficiënter en maakt een zeer nauwkeurige onderscheiden van twee of meer markers. De discussie omvat tips voor probleemoplossing en advies om het succes te bevorderen.

Inleiding

Immunohistochemie is een werkwijze voor het detecteren van antigenen (bijvoorbeeld eiwitten) in weefselsecties met primaire antilichamen die specifiek binden aan de antigenen van interesse. Immunohistochemie werd ontwikkeld door JR Marrack in 1934, toen hij bepaald dat antilichamen antigenen met grote specificiteit ¹ kon lokaliseren. Beginnend in 1942, enkele eerste in vitro studies met fluorescerende antilichamen tegen immunohistochemie visualiseren gepubliceerd ^2,3, waarna de eerste in vivo histochemische studie werd gepubliceerd ^4. Gedurende de 1960's, dertig jaar na de start van immunohistochemische werkwijzen, begon enzym-geconjugeerde antilichamen voor gebruik als secundaire reagentia. Deze methoden werden gelijktijdig en onafhankelijk van elkaar ontwikkeld in Frankrijk en de VS ^5,6. Vandaag de dag, een breed scala van antilichamen biedt eindeloze mogelijkheden voor immunohistochemie studies ^7.

"> De algemene doelstelling van deze correspondentie is om een ​​korte introductie in immunohistochemische kleuring zorgen, het is niet bedoeld om een ​​uitgebreid en uitputtend overzicht van deze techniek in de geschetste methode worden immunohistochemische technieken voor twee antigenen gepresenteerd (markers voor microglia en. neuronen) voor kleuring paraformaldehyd geperfundeerde, sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen. Immunohistochemische kleuring begint blokkeermiddelen-specifieke antigeenbinding aan achtergrondkleuring te verminderen. Vervolgens incubatie met primair antilichaam zorgt voor binding aan een specifiek antigeen in het weefsel. Na het primaire antilichaam, een ander antilichaam, genaamd secundaire antilichaam wordt aan het primaire antilichaam te koppelen aan een geconjugeerd visualisatie signaal ^8. Het tweede antilichaam is gericht op de immunoglobuline G (IgG) domein specifiek voor de diersoorten waarin de eerste antistof opgewekt werd. Het tweede antilichaam versterkt het signaal van het primaire antilichaam, aangezien de Fab-regio van tHij secundair antilichaam binden aan meerdere plaatsen op het IgG gebied van het primaire antilichaam. Enzymen of fluorescente moleculen geconjugeerd met de _Fc-regio van het secundaire antilichaam mogelijk visualisatie. Bijvoorbeeld, een konijn anti-Iba1 primair antilichaam een ​​konijn IgG-molecuul specifiek voor Iba1. Wanneer ezel anti-konijn IgG gebruikt als een secundair antilichaam, zal herkennen en binden aan meerdere gebieden van het konijn anti-Iba1 IgG (zie figuur 1). De ezel antilichaam kan worden gevisualiseerd door verschillende werkwijzen. Deze overeenstemming is gericht op de detectie van een fluorofoor geconjugeerd aan het tweede antilichaam, waarbij het primaire antilichaam herkent, voor visualisatie door fluorescentiemicroscopie. In fluorescerende immunohistochemie kan een nucleaire kleuring zoals Hoechst en DAPI worden gebruikt om alle kernen te visualiseren.

Figuur 1: SchEmatic representatie direct- en indirect antilichaam labeling technieken. Antilichamen binden aan het antigeen van belang en kan worden geamplificeerd door secundaire antilichamen opgewekt tegen de species van het primaire antilichamen. Deze techniek kan worden uitgevoerd met avidine-biotine complex (ABC) voor amplificatie en DAB visualisatie (A), of direct fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam (B). Als alternatief kunnen primaire antilichamen direct worden geconjugeerd met veel verschillende labels, waaronder biotine of een fluorofoor (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een alternatieve werkwijze voor het zichtbaar maken van immunohistochemische kleuring gebruikt 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; zie figuren 1 en 2). Dit verschilt van fluorescentie met behulp van een gebiotinyleerd ofhorse-radish peroxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam, dat een enzym DAB zetten naar een precipitaat dat zichtbaar is onder helderveld microscopie levert. In gevallen waarin een enkele antigeen is van belang of kleuring is verplicht langdurig te zijn, kan DAB beter geschikt zijn dan fluorescerende vlekken zijn. Echter, DAB-kleuring is niet goed geschikt voor differentiatie tussen meerdere markers, met name als twee nucleaire antigenen van belang. Voor informatie over DAB materialen en protocol modificaties raadplegen Tabel 1. Anders, nitro blauw tetrazolium chloride / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) kan worden gebruikt om een alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd secundair visualiseren antilichaam.

Figuur 2:. Vertegenwoordiger beelden van nikkel verbeterde DAB single-gelabeld rat hersenweefsel secties Rat hersenen seCTIES die zijn gelabeld met nikkel verbeterde DAB voor Iba1 (A) en Pan-neuronale (B) zorgen voor langdurige analyse van microglia of neuronen alleen. Schaalbalk 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Men moet rekening houden met de geraamde omvang van het antigeen van belang in het weefsel dat wordt onderzocht. Indirecte werkwijzen (zoals hierboven beschreven) zijn nuttig voor doelen met lage abundantie. Wanneer het antigeen van interesse is in hoge overvloed, kan directe methoden worden toegepast. Direct werkwijzen omvatten een primair antilichaam dat rechtstreeks is geconjugeerd aan een visualisatie signaal en dus geen secundair antilichaam nodig. Deze werkwijze vereenvoudigt het kleurproces, maar elimineert de versterking bereikt met indirecte methoden. Met behulp van een direct geconjugeerd primair antilichaam elimineert ook cross-reactiviteit van secundaire antilichamenals dubbel-labeling.

Deze mededeling beschrijft de protocol voor double-labeling met Iba1 en Pan-neuronale (details in tabel 1). Iba1 vlekken microglia in veel activering staten, waaronder vertakte, hyper-vertakte, geactiveerde, amoeboid en staaf. Pan-neuronale vlekken neuronale axonen, dendrieten, en soma. Aangezien Iba1 vlekken meest microglia en Pan-neuronale targets het neuron, deze combinatie van vlekken is nuttig bij het verkrijgen van een breed begrip van microglia-neuron interacties.

Kortom, immunohistochemische kleuring voert de zorgvuldige selectie van antilichamen. Aangezien de vraagstelling wordt specifieker kunnen antilichamen opgewekt alternatieve antigenen wensen. Om een ​​specifieke microgliale activeringstoestand richten, kan men kiezen om CD45 of CD68 antilichamen, in plaats van Iba1. Verder, in samenwerking met muizen, F4 / 80 kan de benodigde resultaten. Op dezelfde manier kan neuronale elementen specifiek worden gericht met antilichamen raseerde tegen de kern, synaps (pre- of post-), ​​axon, en de groei kegel. Daarnaast zijn er andere merkers die de leeftijd van het neuron (Double-Cortin, NeuN) differentiëren en neuronale regeneratie (GAP-43).

Protocol

LET OP: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Arizona uitgevoerd. Een lijst met aanbevolen materialen en apparatuur zijn te vinden in tabel 1.

1. Tissue Voorbereiding

1. Perfusie
   1. Euthanaseren knaagdier met een overdosis van natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP) en perfuseren transcardially met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot volledig bloed ontdaan (3-5 min) bij een stroomsnelheid van 8 ml / min. Voor diepgaande perfusie instructies, zie Gage et al 2012 ^9.
   2. Onmiddellijk na PBS flush, vast weefsel door perfuseren met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15-20 min bij een stroomsnelheid van 8 ml / min.
   3. Verwijder hersenen en plaats in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, gevolgd door gegradeerde sucrose-oplossingen (15%, 30%, 30%, in volgorde, bereid in Tris gebufferde zoutoplossing) bij 4 ° C. Breng de hersenen naar de volgende sucroseoplossing olleen nadat het brein is gezonken in elke oplossing. Opmerking: Meestal, 5 dagen in elke oplossing is voldoende tijd voor tissue te zinken.
2. Tissue Invriezen en cryosectioning
   1. Plaats de hersenen in inbeddingsmedium, zoals oktober verbinding en onder in isopentaan bij een temperatuur van -35 ° C. Laat de hersenen te bevriezen gedurende minimaal 10 minuten en bewaar bij -80 ° C. Problemen kunnen ontstaan ​​als ijver om de temperatuur niet wordt genomen; zie bespreking voor informatie over probleemoplossing.
   2. Knip seriële coronale secties met een dikte van 20 urn en een temperatuur van -20 ° C. Verzamel weefsel op positief geladen dia's. Brain secties kunnen in een dia doos verpakt in folie in een zip-top zak en opgeslagen op lange termijn bij -80 ° C worden geplaatst. Deze opslagmethode maakt een dubbele grens tot blootstelling aan lucht of bevriest.

2. Tissue Processing

OPMERKING: Voorbeeld apparatuur en materialen rerplicht voor het kleuren worden weergegeven in figuur 3. Alternatieven zijn beschikbaar, echter, zullen deze beelden helpen die nieuw voor immunohistochemische kleuring om passende items visualiseren voorafgaand aan het kopen.

Figuur 3: Voorbeeld goederen voor immunohistochemische kleuring The black box is getoond in (A) is een ideaal vochtige kamer voor immunofluorescentie zoals slides worden beschermd tegen licht zonder dat de box wikkelen op folie.. Na snijden kan schuiven in een doos worden opgeslagen, zoals de gele vakje getoond in (B). Het verpakken van de doos stevig in folie en plaatsing in een zip-top zak voorafgaand aan de vriezer beschermt de weefselmonsters van vriesbrand. Een voorbeeld dia wordt in (C), met verschillende kleuring schotels weergegeven in (D) en (E ). Coverslips kunnen variëren in grootte en dikte (F), maar 1,2 dikke coverslips bieden leuke imaging resultaten op de meeste rechtop en confocale microscopen. Een potlood zoals getoond in (G) kan worden gebruikt om objectglaasjes te labelen. Permanente markers moet vermeden worden omdat de inkt kan draaien, die zowel kleuring en de mogelijkheid om te bepalen welke monster. Een mini pap pen zoals getoond in (H) maakt een afweermiddel grens ook op objectglaasjes.

1. Slide voorbereiding
   1. Verwijder dia's uit vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur.
      1. Optioneel: Indien delen eerder gedreven van objectglaasjes, objectglaasjes plaats ontdooid in een oven bij 60 ° C gedurende maximaal 4 uur om te voorkomen weefselsecties drijven af ​​glijdt.
   2. Plaats de glaasjes in een dia rack en de bijbehorende schotel.
   3. Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk, veranderende oplossing tussen wasbeurten. Vanaf deze stap voorwaarts, voorkomen dat sections zonder vloeistof voor langere tijd. Opmerking: Indien delen uitdrogen, wordt achtergrond kleuring verhoogd en betekenisvolle data betrouwbaar kan niet worden verkregen.
2. Weefselkleuring
   1. In een lichtdichte vlekken doos, een "vochtige kamer" met een niet-pluizende weefsels doordrenkt met gedemineraliseerd water.
   2. Droog de randen van de dia met een niet-pluizende tissue, gebruik maken van een mini pap pen om een ​​vloeistof afstotend grens te maken aan de rand van de dia, weg van weefsel secties. Deze grens moet zorgen voldoende ruimte tussen de meniscus van de vloeistof en de rand van het weefsel, zodat oppervlaktespanning heeft geen invloed op kleuring.
      OPMERKING: De pap pen afweermiddel grens kan worden toegepast voorafgaand aan 2.1.3 als de antilichamen van belang niet magnetron antigen herstel vereisen. Als de pap pen is voorafgaand toegepast op wassen in PBS, moet de integriteit van de vloeistof afstotende grens bij deze stap gecontroleerd. Gebruik een mini-pap pen in de openingen in de border te vullen.
   3. Met horizontaal gestelde slides, block-specifieke antigeen binding door incubatie in 4% v / v in PBS (blokkeeroplossing). Pipetteer 300 ul van blokkeeroplossing per slide 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Zorg ervoor dat het blok oplossing uitstrekt tot de pap pen aan de rand van de glijbaan en volledig bedekt weefsel ongelijkmatige kleuring veroorzaakt door oppervlaktespanning nabij het weefsel te vermijden.
      1. Met serum van dezelfde soort waarin secundaire antilichaam wordt gemaakt. Opmerking: In deze procedure worden de secundaire antilichamen in ezel, en dus donkey serum wordt gebruikt. Als secundaire antilichamen uit twee of meer verschillende soorten worden gebruikt, omvatten serum van elke soort.
   4. Pipette primaire antilichaam op dia's. Opmerking: Antilichaamconcentraties hiervoor kleuring werden geoptimaliseerd bij 1: 5000 en 1: 500 voor Iba1 en Pan-neuronale resp. Deze concentraties zijn als zinvolle kleuring vertonen met een afwezigheid van achtergrondkleuring.
      1. Verdunnen blok oplossing voor1% serum in PBS en voeg primaire antilichamen. Pipetteer 300 ul van primair antilichaam oplossing in 1% serum per slide. Ook hier zorgen de vloeistof aan de rand van de pap pen. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
      2. Omvatten drie controle dia's: één dat noch Iba1 noch Pan-neuronale antistoffen bevat, een met Iba1 zonder Pan-neuronale antilichaam, en één met Pan-neuronale antilichaam zonder Iba1. Vlekken op deze slides in dezelfde run met hetzelfde oplossingen evenwel laat de primaire antilichamen tegen het niet-specifieke binding van de secundaire antilichamen te testen.
   5. De volgende ochtend was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk, veranderende oplossing tussen wasbeurten.
   6. TL-antilichamen zijn lichtgevoelig, dus uit deze stap voorwaarts, het minimaliseren van de blootstelling aan licht door te zorgen voor wassen containers zijn verpakt in folie en hybridisatie dozen zijn zwart of in het donker geïncubeerd. Pipet de juiste secundaire antilichamen op alle dia's en incubeer60 min bij kamertemperatuur bij een concentratie van 1: 250 in blokkeeroplossing (zie stap 2.2.3) in een lichtdichte "vochtkamer" (zie stap 2.2.1).
      1. Gebruik secundaire antilichamen van verschillende golflengten. Hier, voor het primaire antilichaam konijn anti-Iba1 Gebruik ezel anti- konijn 594 als het geschikte secundaire antilichaam. Voor het primaire antilichaam muizen anti-Pan-neuronale Gebruik ezel-anti-muizen-488 als het geschikte secundaire antilichaam. Anders, gebruik anti-konijnen 488 en anti-muis 594.
   7. Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk.
   8. Optioneel: het uitvoeren van nucleaire kleuring.
      1. Plaats Hoechst (of andere nucleaire kleuring) bij een concentratie van 0,03 ug / ml in dubbel gedestilleerd H ₂ 0 gedurende precies 60 sec.
      2. Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk.
   9. Was in DDH ₂ 0.
3. Afdekken
   1. Coverslip slides met een waterig fixeermiddel zoals Fluoromount-G of ProlongGold. Zorg ervoor dat alle bellen met behulp van een wattenstaafje verwijderen.
      Opmerking: Overige montage stoffen kunnen worden gebruikt, heeft echter een hoge doorbloeding tussen kleurstoffen is opgemerkt door enkele binnen enkele dagen van afdekken.
   2. Gebruik heldere nagellak om de randen af ​​te dichten, waardoor de secties uitdroogt door verdamping. Laat nagellak te drogen in een lichtdichte container terwijl dia's plat en bij kamertemperatuur blijven en vervolgens opslaan in een lichtdichte container verpakt in folie bij 4 ° C.

3. Beeldvorming de Stained Tissue

1. Microscopie
   1. Laat de nagellak te drogen voor ten minste een uur voor aanvang van de microscopie, die moet plaatsvinden in een verduisterde kamer.
   2. Verwerven microfoto met behulp van een confocale microscoop of onderzoek met een fluorescerende lichtbron en een digitale camera bevestiging. Met behulp van de bijbehorende software, stellen de belichting voor elke golflengte - 405, 488, en 594 - afzonderlijk. Let op: diepte-imaging instructies online beschikbaar via de microscoop fabrikant moet zijn.
   3. Acquire microscoopfoto in elk kanaal zonder te bewegen de afdelingen of het aanpassen van de focus. Neem beelden in kleur, of afwisselend in grijstinten en converteren naar daarna te kleuren.
      Opmerking: Kleur of grijswaarden beelden van elk kanaal kan worden verzameld in post-processing.
   4. Controleer of weefselcoupes worden niet blootgesteld aan omgevingslicht of microscopische licht voor langere tijd, als foto-bleking van de secties optreedt. Om dit te voorkomen, verhogen de blootstelling tijd in plaats van het verhogen van het licht / laser intensiteit.
   5. Laat de fluorescerende lichtbron niet binnen 30 minuten worden ingeschakeld uit te schakelen.
      Opmerking: Het schakelen van de bron aan en uit in snelle opeenvolging kan de levensduur van de tl-lamp te verlagen.

Resultaten

Dit kleuringsprotocol resultaten in ratten hersenweefsel secties die microglia fluorescent zijn gelabeld in de 594-kanaal (rood) en neuronen geëtiketteerd in de 488-kanaal (groen; zie figuur 4). Als een nucleaire vlek werd geschreven, zal laten zien in het kanaal 405 (blauw). Afbeeldingen kunnen worden genomen in verschillende kanalen en bedekt voor directe vergelijking van de drie kanalen, of tussen twee kanalen. Veel digitale acquisitie software suites zijn voorzien van deze functionaliteit. Double-la...

Discussie

De algemene doelstelling van deze mededeling was immunohistochemie procedures voeren om de lezer. Hiervoor heeft het voorbeeld van de dubbele labeling met Iba1 en pan-neuronale antigenen microglia en neuronen in paraformaldehyde geperfundeerde observeren, werd sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen gebruikt.

Deze techniek kan worden aangepast om eindeloze doeleinden. Een array van verschillende antigenen in verschillende weefseltypen zoals, maar niet beperkt tot de hersenen, lon...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides	Fisher Scientific	22-034-979	Gebazigd voor weefselmontage (1.2.2)
Oven	Thermo Scientific	51028112	Gebazigd voor weefseldrogen (2.1.1)
Mini Pap pen	Life Technologies	00-8877	Gebazigd in stap 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish	Fisher Scientific	22-149-429	Gebazigd voor alle wasbeurten tijdens het kleuren (2.2), evenals de Hoechst-stap (2.2.8)
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-A	Gebazigd voor het drogen van dia's (2.2)
Black Staining Box	Ted Pella	21050	Gebazigd voor blokkerings- en kleuringsstappen (2.2)
Normal Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-253	Gebazigd voor blokkering en antilichaamincubatie (2.2)
Mouse α-Pan-neuronal	Millipore	MAB2300	Gebazigd voor primaire antilichaam (2.2.4)
Rabbit α-Iba1	Wako Chemical	019-19741	Gebazigd voor primaire antilichaam (2.2.4)
Donkey α-rabbit 594	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	Gebazigd voor secundair antilichaam (2.2.6)
Donkey α-mouse 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-150	Gebazigd voor secundair antilichaam (2.2.6)
Caterer's foil	Any	N/A	Gebazigd in stappen 1.2.2 en 2.3.2
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Gebazigd voor coverslips (2.2.8)
Coverslips	Fisher Scientific	12544E	Gebazigd voor coverslips (2.2.8)
Clear Nail Polish	Any	N/A	Gebazigd voor coverslips (2.2.8)
Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)	Carl Zeiss	N/A	Gebazigd voor beeldvorming (3)
Axioskop A2	Carl Zeiss	N/A	Gebazigd voor beeldvorming (3)
CitriSolv	FisherScientific		Voor DAB-protocol
ABC	Vector Laboratories	PK-6100	Voor DAB-protocol
DAB Peroxidase kit	Vector Laboratories	SK-4100	Voor DAB-protocol
Biotinylated horse α-rabbit IgG	Vector Laboratories	BA-1100	Voor DAB-protocol
Biotinylated horse α-mouse IgG	Vector Laboratories	BA-2001	Voor DAB-protocol
30% Hydrogen Peroxide	FisherScientific	H325-500	Voor DAB-protocol
Wheaton slide racks and staining dishes	TedPella	21043	Voor DAB-protocol
Masterflex perfusion pump and tubing	Cole-Parmer		Gebazigd voor perfusie (1.1.1 en 1.1.2)
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)	Fisher Scientific	14-373-65	Gebazigd voor weefselvries (1.2.1)
Thermometer (-50 tot 50 C)	Fisher Scientific	15-059-228	Gebazigd voor weefselvries (1.2.1)
Cryostat	Leica	CM3500S	Gebazigd voor weefseldoorsnijden (1.2.2)
Staining Dish, Plastic with 2 Lids	Grale Scientific	353	Voor antigeenretrieval
20 Place Staining Rack, Slides Horizontal	Grale Scientific	354	Voor antigeenretrieval
Microwave	Any	N/A	Voor antigeenretrieval