Methodenartikel

Isolatie en immortaliseren van Patient afgeleide cellijnen van spierbiopsie for Disease Modeling

DOI:

10.3791/52307

⸱

18 januari 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft technieken voor het isoleren van levende cellen en de primaire kweek van myogene en fibroblastcellijnen uit spier- of huidweefsel. Er wordt ook een techniek beschreven voor het onvergankelijk maken van deze cellijnen. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbare tool om afgeleide cellen van patiënten te genereren en te bewaren voor downstream-toepassingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De generatie van patiëntspecifieke cellijnen vertegenwoordigt een onschatbaar hulpmiddel voor diagnostisch of translationeel onderzoek, en deze cellen kunnen worden verzameld uit huid of spierbiopsieweefsel dat beschikbaar is tijdens de diagnostische evaluatie van de patiënt. In dit protocol beschrijven we een techniek voor het isoleren van levende cellen uit kleine hoeveelheden spier- of huidweefsel voor primaire celkweek. Daarnaast bieden we een techniek voor de immortalisering van myogene cellijnen en fibroblastencellijnen van primaire cellen. Eenmaal dat cellijnen geïmmortaliseerd zijn, kan substantiële uitbreiding van patiënt-afgeleide cellen worden bereikt. Geïmmortaliseerde cellen zijn geschikt voor vele downstream toepassingen, inclusief geneesmiddelenscreening en in vitro correctie van de genetische mutatie. Samenvattend bieden deze protocollen een betrouwbaar hulpmiddel om patiënt-afgeleide cellen te genereren en te bewaren voor downstream toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleculaire diagnostiek is in de afgelopen 20 jaar drastisch geëvolueerd. Genomisch DNA wordt nu routinematig geïsoleerd uit sputum of wangswab, terwijl het in het verleden een bloedtest vereiste. Met de huidige snelle doorlooptijd en gemak van gensequentie worden veel ziektemutaties routinematig geïdentificeerd zonder dat aanvullende tests nodig zijn. In het geval van diagnostiek van spierziekten hebben de identificatie van tientallen nieuwe genen in het afgelopen decennium, verantwoordelijk voor spierdystrofie of myopathie, de manieren waarop deze ziekten worden gediagnosticeerd drastisch veranderd 1,2. Momenteel zijn er tientallen genen geïdentificeerd als oorzaken van spierdystrofie en aangeboren myopathie, hoewel de mechanismen waarmee veel van deze genen ziekte veroorzaken nog onduidelijk zijn. In het bijzonder vormen zeldzame ziekten een uitdaging vanwege de kleine omvang van de patiëntenpopulaties. Voor deze gevallen, evenals voor meer voorkomende ziekten, is het genereren van stabiele tools die studies naar het mechanisme van pathogenese en screening van therapeutische geneesmiddelen vergemakkelijken zeer wenselijk.

Ondanks dramatische vooruitgang in DNA-diagnostiek worden spierbiopsieën nog steeds uitgevoerd om de primaire diagnose vast te stellen bij veel patiënten bij wie een primaire metabole of spierziekte wordt vermoed. Wanneer een spierbiopsie noodzakelijk is, biedt deze de mogelijkheid voor aanvullende diagnostische en onderzoeksweefselverzameling met minimaal extra morbiditeitsrisico voor de patiënt. Aangezien er een aantal toepassingen zijn voor elk weefselmonster, is het zeer wenselijk om technieken voor primaire celcultuur te ontwikkelen met behulp van chirurgisch weefsel die eenvoudig, efficiënt zijn en minimale hoeveelheden weefsel vereisen. Een goede triage van spier- of huidbiopsieën is vereist om de isolatie van primaire cellen uit weefsel te maximaliseren en langetermijnopslag van levend materiaal. Bovendien belooft stamcelonderzoek en geneesmiddelenscreening veel voor de ontwikkeling van therapieën voor vele ziekten met behulp van cel-gebaseerde assays 3,4.

We beschrijven hier methoden voor primaire celafscheiding uit humane spier- of huidbiopsieën. Daarnaast voegen we een protocol toe voor immortalisatie van myogene cellen, wat nuttig is voor het genereren van grote aantallen cellen van een individu. Deze cellen kunnen worden gebruikt voor downstream toepassingen, zoals aangepaste geneesmiddelenscreenings, die anders onhaalbaar zijn met het relatief kleine aantal cellen verkregen uit primair weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Protocollen voor het verzamelen van menselijk weefsel moet worden beoordeeld en door de Institutional IRB commissie goedgekeurd. Inzameling van afgedankte, de-geïdentificeerde menselijk weefsel is goedgekeurd door het ziekenhuis de Boston Children's en Brigham en Women's Hospital IRB Comités. De hieronder beschreven methoden zijn toegepast voor de isolatie van myogene cellen van de-geïdentificeerde, weggegooid weefsel. De beschreven methoden zijn geschikt voor weefsel vanuit ingestemd patiënt materiaal.

1. celisolatie

  1. Dissociatie van spierbiopsie en zuivering van myogene cellen
    1. Pre-wegen een 10 cm weefselkweek plaat in een weefselkweek bioveiligheid kap, en vervolgens opnieuw af te wegen de plaat met de spierbiopsie om de hoeveelheid weefsel te berekenen worden losgekoppeld.
    2. Met behulp van steriele scalpels, gehakt spierweefsel fijn en voeg een paar druppels steriele 1x HBSS om weefsel niet uitdroogt.
    3. Voeg elk van di 3,5 mlspase II en collagenase D per gram spierweefsel te worden verteerd. Pipetteer het gehakt weefsel en enzym oplossing door een steriele 25 ml pipet een paar keer. Incubeer de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 15 min en verteren weefsel totdat de slurry gaat gemakkelijk hoewel een steriele 5 ml pipet.
      OPMERKING: Weefsel dissociatie wordt gewoonlijk bereikt door enzymatische digestie binnen 45-90 min. Verwijzen wij u naar het gedeelte 'Representatieve resultaten' voor meer informatie.
    4. Voeg 2 volumina steriel groeimedium gedissocieerde weefsel, filter door een 100 um zeef cel over een 50 ml conische buis en pellet cellen gedurende 10 min bij 329 xg (~ 1100 rpm), kamertemperatuur. Verwijzen wij u naar de Materialen Tafel voor media samenstelling.
    5. Resuspendeer de pellet in 1 volume steriel kweekmedium en voeg 7 volumes rode bloedcellen lysisoplossing. Filtreer de oplossing door een 40 um cel zeef, pellet vervolgens thij cellen gedurende 10 min bij 329 xg, kamertemperatuur.
    6. Tel de cellen in een hemocytometer en resuspendeer de cellen in 1 x HBSS met 0,5% BSA in een concentratie van 1 x 10 6 cellen / 100 ul. Vernietiging ~ 250.000 cellen in een enkele buis die wordt gebruikt als een negatieve (ongekleurd) controle. Vernietiging extra eenkleurige gekleurd controlebuizen voor propidium iodide en CD56, die voor het correct gating van CD56 positieve cellen door FACS-sortering. Verwijzen wij u naar het sorteren handleidingen cel of overleggen met FACS sortering kernfaciliteit deskundigen om de nodige controles te waarborgen zijn inbegrepen.
    7. Vlekken op de cellen worden gesorteerd met 5 ui / 10 6 cellen van anti- CD56 antilichaam. Incubeer alle monsters (inclusief controles) op ijs gedurende 30 min.
    8. Was monsters in 10 ml 1 x HBSS en pellet cellen gedurende 10 min bij 329 xg (~ 1100 rpm) in een gekoelde centrifuge bij 4 ° C geroerd.
    9. Voeg propidiumjodide in een eindconcentratie van 1 ug / ml van het monster naar zijn sorted voor uitsluiting van dode cellen. Zuiveren myogene CD56 positieve cellen van niet-myogene cellen met behulp van de fluorescentie-geactiveerde cel sorteerder.
  2. Dissociatie van huidbiopsie
    OPMERKING: dermale fibroblasten kunnen worden geïsoleerd uit een huid pons van patiënten wanneer spierbiopten niet beschikbaar zijn. Dermale fibroblasten kunnen worden gebruikt als biomateriaal voor vele studies, waaronder transductie met MyoD naar myogene cellen te genereren. Bovendien kan dermale fibroblasten worden gebruikt iPS cellen, die kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypes voor verdere studie te genereren.
    1. Vervoeren de huid biopsie naar het laboratorium in het transport medium. Nadat het monster is ontvangen, voert de primaire kweek zo spoedig mogelijk. Als de primaire cultuur niet kan worden vastgesteld op dezelfde dag, bewaar het monster bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
    2. Breng de huidbiopsie van een steriele 35 mm petrischaal in de laminaire stroming kap.
    3. Spoel de huid biopsie in een petrischaal met steriele 1x PBS om bloed en vuil te verwijderen. Verwijder het vetweefsel met een steriele scalpel.
    4. Voeg 2 ml collagenase oplossing en gehakt het weefsel met scalpel, incuberen bij 37 ° C gedurende 45 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de grootte van het weefsel.
    5. Breng het gedigereerde weefsel een 15 ml conische buis, spoel de petrischaal met 2 ml van fibroblast kweekmedium tweemaal en verzamel het medium in dezelfde buis.
    6. Pellet cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Verwijder het supernatant en was het pellet met 3 ml van fibroblast medium om de collagenase weer te verwijderen, vervolgens pellet cellen. Verwijzen wij u naar de Materialen Tafel voor media samenstelling.
    8. Herhaal de stap 1.2.7 nog een keer.
    9. Re-schorten de pellet in 5 ml fibroblast medium en plaat cellen op een T25 steriele weefselkweekkolf. Incubeer de kolf bij 37 ° C met 5% CO2.
    10. Evalueer de cultuur voor fibroblast aanhechting en groei in de komende 1-3 dagen.
      OPMERKING: Sommige kleine stukken weefsel kunnen zich ook hechten aan de plaat en fibroblasten migreren uit deze stukken weefsel.
    11. Handhaaf de kweek onder dezelfde omstandigheden tot fibroblasten worden gekweekt tot ongeveer 80% confluentie.
    12. Verzamel fibroblasten door trypsinisatie en overzetten naar kweekflessen vers voor extra uitbreiding. Voer trypsinisatie door het wassen van de kweken 3 keer in 1x PBS zonder Ca ++ en Mg ++. Voeg Trypsine-EDTA (zie Materialen tabel) naar de cellen (2 ml / T25 kolf) gedurende 2 min bij 37 ° C.
    13. Splitsen vrijstaande cellen in extra flesjes. Als sommige stukken weefsel gehecht blijven aan de originele T25 flessen, voeg 5 ml vers kweekmedium naar deze kolf en meer fibroblasten zal voortdurend migreren uit.
      OPMERKING: De geëxpandeerde fibroblast cultuur te worden ingevroren als P1 en opgeslagen in vloeibare stikstof voor toekomstige experimenten.

2. immortaliseren van Myogene Cellen

  1. Plate 5000000 Phoenix ecotrope verpakkingscellen (PE) overnacht in een 10 cm steriele kweekplaat in DMEM en Medium 199 in een verhouding van 4: 1, aangevuld met 10% kalfsserum.
  2. Feed cellen 30 min voor transfectie met 5 ml vers medium aangevuld met 10 mM cafeïne.
  3. Homogeniseer een mengsel van 2 ug plasmide DNA uit een midi prep (CDK4 of hTERT plasmide) en PolyJet en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min, zoals aanbevolen door de fabrikant.
  4. Voeg de plasmide / PolyJet mengsel aan de PE-cellen 's nachts.
  5. Feed cellen met vers medium (DMEM Medium en 199 in een verhouding van 4: 1, aangevuld met 10% kalfsserum). Twaalf uur later, verzamel de virus supernatant en filtreer door een 0,45 urn poriegrootte.
  6. Gebruik 1 ml supernatant verzameld overnacht de amfotrope verpakkingscellijn PA317 te infecteren en 5 verkrijgen van een stabiele virus-producerende cellijn na selectie met ofwel 0,5 mg / ml neomycine (G418) voor CDK4 of 0,5 mg / ml hygromycine voor hTERT.
  7. Bereid te werken virale bovenstaande vloeistoffen door het kweken van de stabiele verpakking cellen tot bijna samenvloeien, dan is het oogsten van de bovendrijvende elke ochtend, avond en ochtend voor drie oogsten.
  8. Filter de virale supernatanten en ofwel direct gebruik of verdelen ze in 1 ml porties en bewaar bij -80 ° C voor later gebruik. Merk op dat virale supernatant verliest 50% infectie-efficiëntie met elkaar vries-dooi. Vergeet niet om te bleken te wassen voordat het teruggooien alles wat de virusdeeltjes heeft aangeraakt.
    OPMERKING: De stabiele PA317 virus-producerende cellijn kan worden ingevroren en gehandhaafd op -150 ° C voor permanente opslag (bevriezing medium is 10% DMSO; 90% Serum).
  9. Plate-FACS gezuiverde myogene cellen (beschreven in stappen 1,1-1,9) bij een dichtheid van 5 x 10 4 cellen / putje in 6-putjesplaten bekleed met 0,1% gelatine. Zorg ervoor dat cellen aan de plaat alvorens de virale infectie.
  10. Voeg 400 ul gefilterd, freshly geproduceerd viraal supernatant of ingevroren monsters aan elke zes-well plaat 's nachts (houd 2 putten als controles).
  11. Verander medium door het voeren cellen met 2,5 ml / putje van vers spier medium (4: 1 Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) en Medium 199 aangevuld met 15% foetaal runderserum, 0,02 M HEPES-buffer, 1,4 mg / l vitamine B12 0,03 mg / l ZnSO4, 0,055 mg / l dexamethason, 2,5 g / l hepatocyt groeifactor en 10 ug / L basic fibroblast growth factor). Gooi de media en pipetten die de virusdeeltjes in een bleekmiddel container. Laat cellen in hetzelfde medium gedurende 3 dagen om te herstellen van infectie vervolgens behandelen selectie met behulp van 400 ug / ml neomycine (CDK4 infectie) of 300 ug / ml hygromycine (hTERT infectie).
  12. Handhaaf cellen onder geneesmiddelselectie totdat de cellen in de controle schaal matrijs (1-2 weken).
  13. Passage cellen voordat ze samenvloeiing (60-80% samenvloeiing; met behulp van 0,05% trypsine-EDTA), zelfs tijdens de selectiop de periode. Replate cellen in meerdere 10cm gerechten met vers myoblasten medium (zoals beschreven in 2.11) aangevuld met de selectie geneesmiddel. Handhaaf onsterfelijk geselecteerde cellen als een heterogene populatie of klonen een geheel homogene genetische achtergrond (zelfde insertie van het transgen in elke cel) te verkrijgen.
  14. Voeren kloonselectie met behulp van de volgende stappen:
    1. Zaad de cellen bij lage dichtheid (bijvoorbeeld 300 tot 500 cellen in schalen van 10 cm) en te handhaven ongeveer twee weken tot kleine kolonies zijn gevormd (10-20 cellen).
    2. Verwijder meeste van het medium op dit punt, waardoor er slechts een dunne film te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
    3. Plaats een klonen ring (met een uiteinde gedoopt in siliconen vacuüm vet) over elke gewenste kloon en voeg een paar druppels van trypsine / EDTA.
    4. Oogst cellen zodra zij afgerond door zorgvuldig aspireren de cellen met behulp van een 1 ml tip of een Pasteur pipet en over te dragen naar de kleinste beschikbare multi- plaTE (96 of 48, 24 of 12 well platen).
    5. Expand klonen zoals nodig om lokale confluentie voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont een aantal van de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij de primaire weefsel dissociatie: het exacte bedrag van weefsel wordt afgewogen in een steriele weefselkweek petrischaal (Figuur 1A, B). Het weefsel wordt vervolgens fijngemaakt met steriele scalpels, tot een weefsel suspensie wordt verkregen (Figuur 1C, D). Na toevoeging van verteringsenzymen, wordt primaire spierweefsel dissociatie gewoonlijk bereikt door enzymatische digestie binnen 45-90 mi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen als een nuttige bron

De isolatie en cultuur van myogene celpopulaties is zeer nuttig bij het ​​vaststellen van ziekte fenotypes of in vitro modellen van ziekte. De myogene beschreven celisolatie procedure maakt de isolatie van myoblasten en fibroblasten van skeletspieren specimens, die vervolgens kan worden vermeerderd, onderscheiden, of onmiddellijk geanalyseerd. Myoblasten structuur en functie kunnen worden beoordeeld via microscopisch onderzoek, evaluatie van celoverleving...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze publicatie wordt gefinancierd door Cure CMD, een Association Contre Les Myopathies (AFM)-subsidie (project 16297), en door de National Institutes of Health (subsienummers K08 AR059750, L40 AR057721 en 2R01NS047727).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Weefselcultuur biosafety hoodBaker Company, Inc.Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, zoals Beckman ModelBeckman CoulterModel Allegra 6RAls celsortering wordt uitgevoerd, wordt een centrifuge met koeling bij voorkeur
MicroscoopNikonModel Eclipse TS100
Weefselcultuur incubator, verbonden met een CO2 bronForma ScientificSerie II
Fluorescentie-geactiveerde celsorteerder (FACS)Becton DickinsonModel Aria
Reagentia voor isolatie van primaire myoblasten uit weefsel
Dispase IIRoche Applied Science#04942078001Bereid een sok oplossing van 2.4U/ml in DMEM
Collageenase DRoche Applied Science#088882001Bereid een stam oplossing van 10 mg/ml
1x steriele Hank’s Balanced Saline Oplossing (HBSS), calcium en magnesium vrijGIBCO Life Technologies#14185-052
Bovine serum albumin, fractie VSigma#05470Bereid een steriele oplossing van 1X HBSS 0,5% BSA voor FACS-sortering
Steriele groeimedium voor myoblasten: Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle’s Medium (DMEM) met hoge glucose (4,5 g) aangevuld met 30% foetaal bovien serumGIBCO Life Technologies11965-092Bevat L- glutamine
RBC lysis oplossingQiagen158904
Propidium Jodide stam 10mg/mlSigmaP4170Bereid de stam oplossing door de poeder in steriele gedistilleerd water te verdunnen
Anti-menselijke CD56 antilichaam voor flow cytometrieBiolegend318310APC-geconjugeerd antilichaam, andere labels zijn beschikbaar
Reagentia voor immortalisatie van primaire myoblasten
Ecotropic packaging cell line PECell BiolabsRV-101
Amphotropisch packaging cell line PA3174Cell BiolabsRV-102
Varkenshuid gelatineSigmaG1890-500gBereid een stam oplossing van 0,1% gelatine in water. Bekleed de schaal met de oplossing bij 37°C gedurende een uur. Verwijder de oplossing en voeg medium toe.
PolyJetSignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
pBabe plasmiden bevattend mCDK4 en hTERTniet commercieel verkrijgbaarStadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life TechnologiesMedium 199 (31150022)
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle medium (DMEM)Life TechnologiesDMEM (11965-092)Meng 4:1 DMEM:199
Myoblast groeimedium: 4:1 Dulbecco’s gemodificeerd Eagle medium (DMEM) en Medium 199 aangevuld met 15% foetaal bovien serum; 0,02 M HEPES buffer; 1,4 mg/L vitamine B12; 0,03 mg/L ZnSO4, 0,055 mg/L dexamethason, 2,5 μg/L hepatocyte groeifactor en 10 μg/L beta fibroblast groeifactor.Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethason); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).Bereid media en stam oplossing Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) apart voor gemakkelijker gebruik. HGF stam oplossing (5µg/ml) en FGF (20µg/ml) moeten vers elke week worden toegevoegd bij de uiteindelijke werkconcentratie.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Myosine zware ketting antilichaam voor immunokleuringDevelopmental Hybridoma BankMF20Clone MF20
Desmin Antilichaam voor immunokleuringThermo ScientificMS-376-S0Clone D33
Paarden serumInvitrogen26050-088
Reagentia voor primaire huid fibroblast isolatie
Transport medium: RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 0,2% penicilline/streptomycineRPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
Huid primaire fibroblast cultuur medium: RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline/streptomycineFoetaal bovien serum: Thermo ScientificSH30071.03
Collageenase oplossing: Collageenase type 2 (100 mg) opgehangen in 12,5 ml van fibroblast cultuur medium en filter-gesteriliseerdeWorthington4176
Steriele 1X Fosfaat Buffer Saline (PBS) calcium en magnesium vrijLonza17-516F
Materialen voor isolatie van primaire myoblasten
50 ml en 15 ml steriele conische buizenGeneMate/BioexpressC-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Steriele scalpelsAspen Surgical372610
HemocytometerHausser Scientific1492
Steriele 5, 10, en 25 ml pipettenBellco glass1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)Herbruikbare pipetten worden gewassen, katoen gedopt en autoclaved

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454(2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34(2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Trefwoorden

Isolatie van spierbiopsieimmortalisatie van cellijnenprimaire celkweekFACS zuiveringmyogene celdifferentiatieCDK4 overexpressiehTERT expressieproductie van viraal supernatantantibioticaselectiecloning ring techniek

Gerelateerde artikelen