Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om SDF-1α, een stamcel-home-factor, te integreren in dextransulfaat-chitosan nanodeeltjes. De resulterende deeltjes worden gemeten op hun grootte en zetapotentiaal, evenals de inhoud, activiteit en in vitro afgiftesnelheid van SDF-1α uit de nanodeeltjes.

Samenvatting

Chitosan (CS) en dextransulfaat (DS) zijn geladen polysachariden (glycanen), die polyelektrolytcomplex-gebaseerde nanodeeltjes vormen wanneer ze onder geschikte omstandigheden worden gemengd. De glycanen nanodeeltjes zijn nuttige dragers voor eiwitfactoren, die de in vivo levering van de eiwitten vergemakkelijken en hun retentie in het beoogde weefsel ondersteunen. De glycanen polyelektrolytcomplexen zijn ook ideaal voor eiwitlevering, omdat de incorporatie wordt uitgevoerd in waterige oplossing, wat de kans op inactivering van de eiwitten vermindert. Eiwitten met een heparine-bindende plaats hechten zich gemakkelijk aan dextransulfaat en worden op hun beurt door de binding gestabiliseerd. Deze deeltjes zijn ook minder ontstekingsverwekkend en toxisch wanneer ze in vivo worden toegediend. In het hieronder beschreven protocol wordt SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), een stamcel-homing factor, eerst gemengd en geïncubeerd met dextransulfaat. Chitosan wordt toegevoegd aan het mengsel om polyelektrolytcomplexen te vormen, gevolgd door zinksulfaat om de complexen met zinkbruggen te stabiliseren. De resulterende SDF-1α-DS-CS-deeltjes worden gemeten op grootte (diameter) en oppervlaktelading (zetapotentiaal). De hoeveelheid van het geïncorporeerde SDF-1α wordt bepaald, gevolgd door metingen van zijn in vitro afgiftesnelheid en zijn chemotactische activiteit in een deeltjesgebonden vorm.

Inleiding

Dextran sulfaat (DS) en chitosan (CS) zijn polysachariden met meerdere gesubstitueerde negatief geladen sulfaatgroepen (DS) of positief geladen aminogroepen (gedeacetyleerd CS). Wanneer gemengd in een waterige oplossing de twee polysacchariden vormen polyelectrolytcomplexen elektrostatische interacties. De resulterende complexen kunnen grote aggregaten die worden fase gescheiden van de waterige oplossing (neerslag) of kleine deeltjes die in water dispergeerbaar (colloïden) vormen. De specifieke voorwaarden die bijdragen aan deze uitkomsten zijn uitgebreid bestudeerd, en zijn samengevat en geïllustreerd in detail in een recente beoordeling ^1. Onder deze omstandigheden zijn de tegengesteld geladen polymeren moeten 1) significant verschillend molecuulgewicht twee basisvereisten voor het produceren water dispergeerbare deeltjes; en 2) worden gemengd in een niet-stoichiometrische verhouding. Deze voorwaarden zullen de kosten-neutrale gecomplexeerd polymere segmenten gegenereerd door lading toestaanneutralisatie te scheiden en vormen de kern van het deeltje, en de overmaat polymeer aan de buitenmantel ¹ vormen. De glycan deeltjes beschreven in dit protocol zijn bedoeld voor pulmonale levering, en zijn ontworpen netto te zijn negatief geladen, en van nanometer afmetingen. De negatieve oppervlakte lading vermindert de kans op cellulaire opname van de deeltjes ^2,3. Deeltjes van nanometer dimensie van de doorgang door het distale luchtwegen. Om dit doel te bereiken, de hoeveelheid DS in dit preparaat dan CS (gewichtsverhouding 3: 1); en hoog molecuulgewicht DS (gewichtsgemiddelde MW 500.000) en lage molecuulgewicht CS (MW 50-190 kDa, 75-85% gedeacetyleerd) gebruikt.

SDF-1α is een stamcel homing factor, die de homing-functie via haar chemotactische activiteit uitoefent. SDF-1α speelt een belangrijke rol bij homing en onderhoud van hematopoietische stamcellen in het beenmerg, en rekrutering van progeNitor cellen naar de perifere weefsels voor letsel reparatie ^4,5. SDF-1α een heparine-bindingsplaats in de eiwitsequentie, waardoor het eiwit bindt aan heparine / heparansulfaat, vorm dimeren, worden beschermd tegen protease (CD26 / DPPIV) inactivering en interactie met doelcellen via celoppervlak receptoren ^6-8. DS soortgelijke structuureigenschappen als heparine / heparansulfaat; dus de binding van SDF-1α DS zou vergelijkbaar met die van de natuurlijke polymere liganden.

In de onderstaande voorschriften beschrijven we de bereiding van SDF-1α-DS-CS nanodeeltjes. De procedures vormen één van de formuleringen die eerder zijn onderzocht ^9. Het protocol is oorspronkelijk aangepast van een onderzoek van VEGF-DS-CS nanodeeltjes ^10. Een kleinschalige bereiding wordt beschreven, die gemakkelijk kan worden opgeschaald met dezelfde voorraad oplossingen en voorbereiding voorwaarden. Na bereiding worden de deeltjes gekarakteriseerd by behandeling van hun grootte, zeta potentieel, omvang van SDF-1α oprichting, in vitro release tijd, en de activiteit van de opgenomen SDF-1α.

Protocol

1. Bereiding van SDF-1α Glycan Nanodeeltjes

Door de toepassing van in vivo afgifte, steriliseren alle containers, pipetten en tips gebruikt bij de bereiding.

1. Bereid de volgende voorraad oplossingen in ultrapuur water: 1% dextraansulfaat; 1 M NaOH (steriel gefiltreerd met een PES membraan); 0,1% chitosan in 0,2% ijsazijn (filter door 0,8 en 0,22 urn filters achtereenvolgens en pH op 5,5 met NaOH daarna); 0,1 M ZnSO _4; 15% mannitol; en 0,92 mg / ml SDF-1α (in porties bewaard bij 80 ° C en bij 4 ° C bewaard Ontdooide).
2. Steriliseren voorraad oplossingen door 0,22 pm filter membranen. Beoordelen endotoxine niveaus in de bereide oplossing met limulus amoebocyt lysaat (LAL) gel stollingstest. Zorg ervoor dat de niveaus zijn <0,06 EU / ml.
3. Voeg 0,18 ml ultrapuur water om een ​​1,5 ml glazen flacon met een magnetische roerstaaf. Stel het roer snelheid van 800 rpm. Voeg 0,1 ml 1%dextransulfaat en roer gedurende 2 min. Voeg 0,08 mg SDF-1α (0.087 ml 0,92 mg / ml SDF-1α oplossing) en roer gedurende 20 min.
4. Voeg 0,33 ml 0,1% chitosan druppelsgewijs toe en roer gedurende 5 min. Verandering roer snelheid naar de maximale en voeg langzaam 0,1 ml 0,1 M ZnSO ₄ met een 0,1 ml injectiespuit (meer dan 1 min).
5. Terug roer snelheid tot 800 rpm en roer gedurende 30 min. Voeg 0,4 ml 15% mannitol en roer gedurende 5 min. Breng het reactiemengsel tot een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min.
   Opmerking: De aanwezigheid van mannitol vergemakkelijkt de resuspensie van de deeltjes na centrifugeren. Afhankelijk van de dichtheid van de korrel kan mannitolconcentratie variëren van 0% tot 5%. Volledige resuspensie van de deeltjes na elke centrifugering cruciaal aggregaten in de uiteindelijke suspensie voorkomen.
6. Zuig supernatant en gebruik een pipet om de laatste druppel vloeistof langzaam te verwijderen. Voeg 0,2 ml 5% mannitol. Hang de pellet met een 0,5 ml, 29 G needle spuit. Voeg 1 ml 5% mannitol. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 15 min.
7. Herhaal stap 1.6.
8. Zuig de supernatant. Resuspendeer de pellet in 0,2 ml 5% mannitol. Bewaar de deeltjessuspensie bij 4 ° C.
   Opmerking: De deeltjessuspensie kan ook opgeslagen worden ingevroren bij -80 ° C of gevriesdroogd. Inclusief 5% mannitol in de suspensie is essentieel om aggregatie van de deeltjes na invriezen en ontdooien of na vriesdrogen en rehydratatie te voorkomen. Mannitol kan worden verwijderd door centrifugeren van de suspensie na de opslag.

2. Meting van de deeltjesgrootte en Zeta-Potentiaal

De deeltjesgrootte en zeta potentieel worden geanalyseerd door middel van dynamische lichtverstrooiing en elektroforetische lichtverstrooiing, respectievelijk, met een deeltjesanalysator aangegeven Material List.

1. Stel de volgende parameters voor de deeltjesgrootte meting: Accumulatie tijden: 70; Herhaal keer: 4; Temperatuur: 25 ° C;Oplosmiddel: water; Intensiteit aanpassing: auto.
2. Verdun het SDF-1α-DS-CS monster met water (10-voudige verdunning). Plaats 100 pl van het monster aan een wegwerpbare UV kuvet zoals een Eppendorf cuvet. Plaats de cuvet in de cel houder. Wacht tot de intensiteit aanpassing aan "Optimum" (~ 10.000 cps) bereikt. Start data-acquisitie.
3. Nadat de meting is voltooid, registreren de cumulanten resultaten van diameter (nm) en polydispersiteit index. Gemiddeld verkregen uit elk van de 4 herhaalde metingen resultaten en bepaal de standaardafwijking.
4. Lading 500 pl van de 10-voudig verdunde deeltjesmonster een stroomcel voor zetapotentiaal meting. Stel de volgende parameters voor het meten: Accumulatie tijden: 10; Herhaal tijden: 5; Temperatuur: 25 ° C; Oplosmiddel: water; Intensiteit aanpassing: auto. Noteer de resultaten van de zeta-potentiaal (mV). Het gemiddelde van de resultaten van elk van de 5 herhaalde metingen resultaat, en bereken de standaard deviation.

3. Kwantificering van SDF-1α in de Deeltjes

1. Verdun vrije vorm SDF-1α concentraties van 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, en 0,05 mg / ml in 1,3 x Laemmli monsterbuffer. Verdun 6 pl SDF-1α-DS-CS monsters met 40 gl 1,3 x Laemmli monsterbuffer. (Bereid 4x Laemmli stock buffer die 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glycerol, 0,05 mg / ml broomfenolblauw, en 8% 2-mercaptoethanol. Verdeel de stockoplossing in kleine porties en bewaar bij -20 ° C voor eenmalig gebruik.)
2. Verwarm de monsters bij 100 ° C gedurende 10 min. Vortex de monsters tweemaal (elk gedurende 10 seconden bij maximale snelheid) gedurende 10 min opwarmtijd om de deeltjes volledig dissociëren. Koel de monsters tot kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 0,5-1 min het water condensaat naar beneden te brengen. Weer vortex goed te mengen.
   Opmerking: Op dit punt moet de monsteroplossing helder zonder zichtbare neerslag aanwezig.
3. Load 10 &# 181; l monster / goed op een 4-20% SDS-gel. Run elektroforese bij 200 V gedurende 20 minuten. Vlekken op de gel met Coomassieblauw eiwit vlek.
4. Onderzoeken het eiwit band dichtheid van SDF-1α met behulp van een moleculaire imager en densitometry analyse software. Bereken de hoeveelheid SDF-1α in de deeltjes tegen een standaardkromme geconstrueerd met gratis SDF-1α standaarden.

4. In vitro afgifte assay

1. Mix SDF-1α glycan deeltjes met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (D-PBS) bij een 1: 1 verhouding (v / v).
2. Verdeel de deeltjessuspensie in 0,05 ml porties in 1,5 ml buizen. Plaats de monsters naar de bodem van de buizen. Voorkomen dat er luchtbellen of het oppervlak van de vloeistof te storen. Dicht de top van de buizen met Parafilm.
   OPMERKING: Daarbij zal de vloeistof onderin blijven tijdens de daaropvolgende boven naar beneden draaien op de buis mixer.
3. Draai de buizen op 37 &# 176; C op een roterende Micro-Tube Mixer. Verwijder aliquots uit de buizen bij de aangegeven tijden en onmiddellijk gecentrifugeerd de monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
4. Scheid de supernatanten en pellets, en los het pellet met 0,05 ml D-PBS. Bewaar de monsters bij -20 ° C. Nadat alle monsters verzameld, onderzoekt de supernatanten en pellets op een SDS-gel zoals hierboven beschreven.

5. Migratie Assay

Deze test meet de chemotactische activiteit van SDF-1α. Interactie van SDF-1α met zijn receptor (CXCR4) op het celoppervlak veroorzaakt migratie van de cel naar de SDF-1α gradiënt. In deze assay worden de cellen geplaatst in een bovenste put (gescheiden door een semipermeabel membraan van een lagere well) en SDF-1α oplossing in een lagere put.

1. Verdun SDF-1α (vrij of deeltjes gebonden vorm) migratie buffer (RPMI-1640 medium dat 0,5% bovine serum albumine) in een 3-fold seriële verdunning tot eindconcentraties van 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 en 0,05 ng / ml.
2. Voeg 0,6 ml van de verdunde SDF-1α oplossing of migratie buffer alleen (negatieve controle) aan een putje in de 24-well plaat. Voeg 0,57 ml migratie buffer tot een goed (input cel controle). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. Plaats een permeabele celkweek insert zoals Transwell (poriegrootte 5 urn, 6,5 mm) bovenop de onderste put. Load 0,1 ml Jurkat-cellen (5 x 10 ⁵⁾ in de Transwell voegen. Laad 0,03 ml cellen rechtstreeks aan de ingang celcontrole goed. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur in een 5% _CO2 incubator.
3. Verwijder de Transwell inzetstukken. Breng de cellen die zijn gemigreerd naar de onderste putjes van een 4 ml polystyreen buis. Tel de gemigreerde cellen met een flowcytometer.
4. Bereken migratie als percentage van het aantal invoercel (celaantal in de invoercel controleputje x 100/30) na aftrekken van de getallen in negative controles (cellen gemigreerd naar de putjes die alleen migratie buffer).

Resultaten

De grootte en zetapotentiaal van de bereide SDF-1α-DS-CS deeltjes worden bepaald met een deeltjesanalysator. Figuur 1 toont de analyse van de maat opmeten. Uit de cumulanten resultaten verkregen uit vier herhaalde metingen, het gemiddelde hydrodynamische diameter van het SDF-1α-DS-CS deeltjes 661 ± 8.2 (nm) en de polydispersiteit is 0,23 ± 0,02. Het resultaat van de zeta potentieel meting wordt getoond in figuur 2. Van de vijf herhaalde metingen, het zeta potentieel van de SDF-1α-DS-CS ...

Discussie

Zoals hierboven vermeld, worden de DS-CS nanodeeltjes gevormd door ladingsneutralisatie tussen polyanion (DS) en polykation (CS) moleculen. Omdat de lading interactie optreedt gemakkelijk tijdens de moleculaire botsing, de concentratie van de polymeeroplossingen en de roersnelheid tijdens mengen kritisch voor de grootte van de resulterende deeltjes. Een algemene trend is dat meer verdund DS en CS oplossingen ¹⁵ en hogere roersnelheid resultaat in kleinere deeltjes.

De formulering ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Dextransulfaat	Fisher	BP1585-100
Chitosan, laag moleculair gewicht	Sigma	448869
Zinksulfaat heptahydraat	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Bereid volgens referentie 8.
Spuitfilter, PES membraan 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetische microroerstaven (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glazen vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Deeltjesanalysator	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Proteïne Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 Systeem	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeabele Steunen	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738