Methodenartikel

3D modellering van de laterale ventrikels en histologische karakterisering van periventriculaire Tissue bij de mens en muis

DOI:

10.3791/52328

⸱

19 mei 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Neurobiology, University of Connecticut, 2Department of Anatomic Pathology and Laboratory Medicine, University of Connecticut Health Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van MRI-scans (menselijk), 3D-beeldvormingssoftware en immunohistologische analyse documenteren we veranderingen in de laterale ventrikels van de hersenen. Longitudinaal 3D-mapping van veranderingen in het volume van de laterale ventrikels en de karakterisering van periventriculaire cellulaire veranderingen die optreden in de menselijke hersenen als gevolg van veroudering of ziekte worden vervolgens gemodelleerd bij muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ventriculaire systeem transporteert en circuleert hersenvocht (CSF) en vergemakkelijkt de verwijdering van opgeloste stoffen en gifstoffen uit de hersenen. De functionele eenheden van de ventrikels zijn gecilieerde epitheliale cellen, ependymcellen genaamd, die de ventrikels bekleden en door ciliaire actie in staat zijn om een laminaire stroom van CSF op het ventrikeloppervlak te genereren. Deze monolaag van ependymcellen biedt ook barrière- en filtratiefuncties die de uitwisseling tussen herseninterstitiële vloeistoffen (ISF) en circulerend CSF bevorderen. Biochemische veranderingen in de hersenen worden daardoor weerspiegeld in de samenstelling van het CSF en vernietiging van het ependyma kan de delicate balans van CSF en ISF-uitwisseling verstoren. Bij mensen is er een sterke correlatie tussen laterale ventrikelexpansie en veroudering. Leeftijdsgeassocieerde ventriculomegalie kan zelfs optreden zonder dementie of obstructie van de CSF-stroom. De exacte oorzaak en progressie van ventriculomegalie is vaak onbekend; echter, vergrote ventrikels kunnen regionale en, vaak, uitgebreide verlies van ependymale celbedekking vertonen met astrogliose van het ventrikeloppervlak en geassocieerd periventriculair oedeem die de functionele ependymale celmonolaag vervangen. Met behulp van MRI-scans samen met postmortem menselijk hersenweefsel, beschrijven we hoe we 3D-weergaven van laterale ventrikelvolumes kunnen voorbereiden, afbeelden en compileren, laterale ventrikelvolumes kunnen berekenen en periventriculair weefsel kunnen karakteriseren door middel van immunohistochemische analyse van en face laterale ventrikelwandweefselpreparaten. Overeenkomstige analyses van muisbreinweefsel worden ook gepresenteerd ter ondersteuning van het gebruik van muismodellen als een middel om veranderingen in de laterale ventrikels en periventriculair weefsel te evalueren die worden gevonden bij menselijke veroudering en ziekte. Samen laten deze protocollen onderzoek toe naar de oorzaak en het effect van ventriculomegalie en benadrukken technieken om de gezondheid van het ventriculaire systeem en zijn belangrijke barrière- en filtratiefuncties binnen de hersenen te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een ependymale celmonolaag lijnen het ventriculaire systeem van de hersenen leveren bi-directionele barrière en transport functies tussen de cerebrospinale vloeistof (CSF) en interstitiële vloeistof (ISF) 1-3. Deze functies helpen de hersenen giftige stof-vrij en in fysiologische evenwicht 2,3 bewaren. Bij mensen verlies van delen van deze ommanteling met beschadiging of ziekte lijkt niet te leiden tot regeneratieve vervanging zoals in andere epitheliale bekledingen; eerder verlies van ependymale cel dekking lijkt te resulteren in periventriculaire astrogliose met een vlechtwerk van de astrocyten die regio's ontdaan van ependymale cellen op het ventrikel oppervlak. Ernstige consequenties belangrijke CSF / ISF uitwisseling en klaring mechanismen worden voorspeld met verlies van deze epitheellaag 1,2,4-7.

Een gemeenschappelijk kenmerk van menselijke veroudering wordt vergroot laterale ventrikels (ventriculomegaly) en bijbehorende periventricular oedeem als OBSERVed door middel van MRI en vocht-verzwakte inversie herstel MRI (MRI / FLAIR) 8-14. Om het verband tussen ventriculomegaly en de cellulaire organisatie van het ventrikel bekleding te onderzoeken, werden humane postmortem MRI sequenties gekoppeld met histologische preparaten van laterale ventrikel periventriculaire weefsel. In geval van ventriculomegaly waren belangrijke werkgebieden gliosis ependymale cel dekking vervangen langs de laterale ventrikel wand. Als ventrikel expansie niet werd gedetecteerd door MRI-gebaseerde volume analyse de ependymale cel lining was intact en gliosis niet langs de ventrikel lining 6 gedetecteerd. Deze combinatorische aanpak vormt de eerste uitgebreide documentatie detaillering veranderingen in de cellulaire integriteit van de laterale ventrikel voering met wholemount bereidingen van delen of het gehele laterale ventrikel muur en 3D modelleren van ventrikel volumes 6. Verscheidene ziekten (ziekte van Alzheimer, schizofrenie) en letsels (traumatisch hersenletsel)tonen ventriculomegaly als een vroege neuropathologische functie. Denudation gebieden van de ependymale celbekleding daardoor zou worden voorspeld te interfereren met normale ependymale celfunctie en afbreuk doen aan de homeostatische balans tussen CSF / ISF vloeistof en opgeloste stof uitwisseling. Zo zal een grondiger onderzoek van de wijzigingen in het ventriculaire systeem, de cellulaire samenstelling, en het gevolg onderliggende of aangrenzende hersenstructuren uiteindelijk beginnen om meer over de neuropathologie geassocieerd met ventrikel uitbreiding onthullen.

Het ontbreken van multimodale beeldgegevens, inzonderheid longitudinale gegevensreeksen, samen met de beperkte toegang tot overeenkomstige histologische weefselmonsters maakt analyse van menselijke hersenen pathologieën moeilijk. Modelleren fenotypes gevonden in menselijke veroudering of ziekte kan vaak worden bereikt met muismodellen en diermodellen uitgegroeid tot een van onze beste middel om vragen over de ziekte bij de mens initiatie en progressie te verkennen. Verschillende studies ingezonde jonge muizen hebben de cytoarchitecture van de laterale ventrikel muren en de onderliggende stamcellen niche 4,7-15 beschreven. Deze studies zijn uitgebreid tot 3D-modellering en cellulaire analyse van het ventrikel muren onder door veroudering 6,15. Noch periventriculaire gliosis noch ventriculomegaly worden waargenomen in de leeftijd van muizen, in plaats van muizen vertonen een relatief robuuste subventicular zone (SVZ) stamcel niche onderliggende aan een intacte ependymale cel voering 6,15. Aldus opvallende species-specifieke verschillen bestaan ​​in zowel het algemene onderhoud en de integriteit van het laterale ventrikel bekleding gedurende het verouderingsproces 6,15. Daarom, om optimaal gebruik muizen bij de mens omstandigheden ondervragen verschillen tussen de twee soorten moeten worden gekarakteriseerd en passend beschouwd in elk model paradigma. Hier presenteren we procedures longitudinale veranderingen in de laterale ventrikels en de bijbehorende periventriculaire weefsel in zowel mensen als m evaluerenouse. Onze procedures omvatten 3D-rendering en volumetrie van zowel muis en mens ventrikels, en het gebruik van immunohistochemische analyse van hele berg voorbereidingen van periventricular weefsel om zowel de cellulaire organisatie en structuur karakteriseren. Samen deze werkzaamheden een middel om veranderingen in het ventriculaire stelsel, periventriculaire weefsel te karakteriseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Animal procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Connecticut IACUC en voldoen aan de NIH richtlijnen. Menselijk weefsel en data-analyse en procedures waren in overeenstemming met en door de Universiteit van Connecticut IRB goedgekeurd en voldoen aan de NIH richtlijnen.

1. Mouse: Analyse van periventriculaire Cellular Integriteit en 3D modellering van de laterale ventrikel

1.1) Voorbereiding van de Mouse laterale ventrikel Muur Whole Mounts

  1. Bereid muis laterale ventrikel hele mounts voor immunohistochemie (IHC), zoals eerder beschreven 16,17.

1.2) Immunohistochemie voor laterale ventrikel Analyse

  1. Fix en sectie muis hersenweefsel zoals eerder beschreven 18,19.
    1. Kortom, flush muizen transcardiaal met normale kamertemperatuur zoutoplossing, totdat organen gewist (aangegeven door een bleke kleuring), gevolgd door kamertemperatuur 4% paraformaldehyde(PFA) in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot weefsel is verstijfd.
    2. Verwijder de hersenen uit de schedel. Gebruik iris dissectie schaar te snijden van de basis van de schedel langs de pijlnaad.
    3. Expose schedel en de hersenen te verwijderen met een pincet. Dompel de hersenen in 4% PFA fixatief overnacht bij 4 ° C. Was daarna 3 maal gedurende 20 min met PBS.
  2. Bereid seriële secties voor immunohistochemie en volume analyse.
    1. Met behulp van een microchirurgische scalpel een kleine insnijding in lengterichting langs de cortex van de linker hersenhelft om de identificatie van de linker hemisfeer toestaan ​​van de rechter hersenhelft als drijvende secties immunostained.
    2. Encase vaste hersenen in 3% agarose voor extra structurele steun tijdens vibratome snijden. Warm 3% agarose in gedestilleerd water (w / v) tot het volledig opgelost met behulp van een magnetron of een hete plaat.
    3. Met een scheermesje, verwijder het caudale gedeelte van de hersenen op het cerebellum met eencoronale snede, waardoor een vlak en glad oppervlak. Breng superlijm aan het weefsel podium en de positie van de hersenen op de nieuw te snijden oppervlak met de olfactorische bollen naar boven.
    4. Wanneer vloeibare agarose oplossing afgekoeld tot een temperatuur juist warm aanvoelen toepassen gelijkmatig over de hersenen naar de gehele hersenen volledig omsluiten. Laat de agarose stollen.
    5. Sectie agarose ingekapseld hersenen coronaalwaarts op vibratome in 50 urn secties met secties in serie geplaatst in een 24-wells plaat met PBS om de volgorde behouden.
      OPMERKING: Over het algemeen 12 putten worden gebruikt voor een hersenen, met een collectie van het weefsel begint 5 secties voorafgaand aan het zien van de opkomst van de laterale ventrikels begint met goed A1, bewegen numeriek tot B6 en fietsen terug naar A1. Zo kunnen meerdere onderscheiden gedeelten van dezelfde hersenen binnen dezelfde goed te verwerken. Voor laterale ventrikel volume analyse, weefsel collectie opgehouden toen de laterale ventrikels en de derde ventrikel samenvoegen, wat resulteert in ongeveer 3 secties per well of 36 secties totaal.
    6. Zuig het PBS met behulp van een overdracht pipet aangebracht met een 20-200 ul micropipet tip om ervoor te zorgen dat de drijvende secties zijn niet per ongeluk opgezogen. Block en doorlaatbaar drijven secties 10% serum, 0,1% Triton X-100 (TX) in PBS (PBS-TX) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Gebruik 300 ul oplossing per put te dekken vrij zwevende weefselcoupes in een 24-wells plaat en voer alle incubaties van secties in een schommelende plaat.
    7. Zuig de blokkerende oplossing en incubeer secties met primaire antilichamen in PBS-TX overnacht (ten minste 12 uur) bij 4 ° C. Voor ventrikel volume sporen met behulp van coronale secties, gebruik anti-S100β antilichaam aan ependymale cellen te labelen.
    8. Zuig primaire antilichaam oplossing, en was secties 3 keer voor 10 minuten elk met PBS-TX.
    9. Incubeer secties donker gedurende 1 uur bij kamertemtuur met fluorescerende secundaire antilichamen bij concentraties van 1: 1000 in 10% serum, PBS-TX. Houd secties in het donker voor alle overige incubatiestappen.
    10. Zuig secundair antilichaam-oplossing en incubeer secties met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole in PBS (DAPI, 10 ug / ml) gedurende 5 min bij celkernen tegenkleuring. Zuig het DAPI oplossing en spoel secties 3 keer voor 10 minuten elk met PBS.
    11. Mount secties serieel op dia's met behulp van de corticale merk te behouden links versus rechter hersenhelft oriëntatie. Drogen secties in het donker en vervolgens dekglaasje door een dunne laag van fixeermiddelen aan de dia en plaats voorzichtig een glazen dekglaasje erop. Laat afgedekt dia nacht drogen bij kamertemperatuur.

1.3) laterale ventrikel Segmentatie voor 3D Reconstructies

OPMERKING: Voer het opsporen van de laterale ventrikels met mapping software op een rechtopstaande epifluorescentie Micrpe met een geautomatiseerde fase en een digitale CCD camera voor fluorescentiedetectie.

  1. Schakel de fluorescentiemicroscoop apparatuur en lanceren mapping software in fluorescentie mode. Open 'Weergaveopties' om de juiste werkbalken en docking instrument panelen die nodig zijn voor het opsporen van laden. Opties> Weergave Opties> Bureau-accessoires en selecteer het 'Hoofd' en werkbalken 'Marker'. In hetzelfde menu, selecteer 'Camera Histogram', 'Multichannel Control', 'Camera-instellingen' en 'Image Acquisition' onder 'Docking Tool Panels.'
  2. Observeer begin van de ventrikels gebaseerd op sterke S-100β fluorescentie dat ependymale cellen die de laterale ventrikel lijn labels. Bepaal het eerste stuk weefsel dat de laterale ventrikels.
  3. Maak een nieuw bestand en wijst een referentiepunt voor het podium beweging door te klikken in de afbeelding raam boven de linker laterale ventrikel. Kijk voor de kleineincisie te oriënteren links van rechter hersenhelft. Houd het referentiepunt op een consistente locatie ten opzichte van de laterale ventrikels over het opsporen van bestanden om te helpen bij het importeren contouren voor seriële wederopbouw.
  4. Kies de juiste vooraf ingestelde contour soort van de contour drop-down menu, bijvoorbeeld, 'Left laterale ventrikel.' Gebruik een unieke kleur voor elk van de linker en rechter laterale ventrikel traces. Als er wijzigingen in de naam en de kleur contour vereist zijn, gaat u naar Opties> Weergave Voorkeuren> Contouren, dan wijzigt de namen van de contour kleuren of selecteer 'Toevoegen Contour Type'.
  5. Met de 'Left laterale ventrikel' contour geselecteerd, klikt u langs het apicale oppervlak van de ependymale voering om het spoor contour beginnen. Trace het ventrikel door te blijven klikken achtereenvolgens langs de apicale oppervlak.
    1. Voor onregelmatige gebieden die meer finesse, klik en houd de linker muisknop om de vrije hand te traceren. Druk op Ctrl + Z, of ga to Opties> Ongedaan maken om de vorige contour punt ongedaan te maken. Verplaats het opsporen venster met behulp van de pijltoetsen of door het maken van een contour wijzen buiten het scherm en waardoor het raam om zichzelf automatisch te centreren. Om het ventrikel traceren klik met de rechtermuisknop te voltooien en selecteer 'Sluiten Contour'.
  6. Selecteer een nieuwe contour kleur (type contour) voor de rechter laterale ventrikel met behulp van het drop down menu. Trace de rechterkamer als in stap 1.3.4 voor de linker.
  7. Als er wijzigingen in de naam en de kleur contour nodig zijn, klik met de rechtermuisknop op de contour en selecteer Change Contour Type om de juiste kleur te selecteren.
  8. Markers toe te voegen over de middellijn om te helpen bij de aanpassing van de seriële contouren voor 3D-reconstructie. Om markeringen toe te voegen, selecteert u de juiste markering (gebruik de 'X') van de werkbalk Markers aan de linkerkant en klik op om ze te laten vallen op het scherm te traceren. Markers Import samen met de contouren voor elke sectie weefsel spoor.
  9. Om het weefsel sporen, selecteert u Bestand opslaan> OpslaanData File As en maak een nieuwe map en de bestandsnaam. Nummer de traces [slide #] - [tissue #] voor gemakkelijke identificatie van sporen uit de seriële secties. Bijvoorbeeld, de derde weefselsectie op de tweede schuif heeft de bestandsnaam "2-3" in de map voor elke hersenen.
  10. Herhaal de stappen 1.3.4 tot 1.3.9 voor elke seriële sectie van het hersenweefsel om de ventrikels te traceren door het gehele brein, met uitzondering van de regio's van de hartkamer muur hechting.
  11. Als het ventrikel heeft een gebied van hechting, sub-segment van de voorste regio van de dorsale en ventrale om de hechting website. Maak twee nieuwe contour types voor elk ventrikel (bv 'dorsale Left ventrikel' en 'Ventral Left ventrikel'). Op het eerste weefsel-segment met hechting, sporenelementen het laterale ventrikel met zowel de oorspronkelijke laterale ventrikel contour en de nieuwe dorsale en ventrale contouren te zorgen voor een volledige reconstructie hartkamer worden gemaakt.
  12. In secties posterior een ventricle muur hechting, een set van de nieuwe contour kleuren voor het achterste gedeelte van elke ventrikel (bv 'Posterior Left ventrikel'). Double-trace deze eerste re-aangesloten deel met zowel de huidige hechting en nieuwe achterste contour types.

1.4) laterale ventrikel 3D Wederopbouw

  1. Lijn en compileren seriële contour traces van de muis laterale ventrikels naar 3D-reconstructies en volumetrische gegevens te genereren.
  2. Open 3D-reconstructie programma. Klik op Bestand> Openen en selecteer het bestand contour van de eerste getraceerd seriële sectie. Importeren de contour traces van de linker en rechter ventrikel alsook eventueel toegevoegde markers.
  3. Om contouren selecteren, klikt u op de knop 'Select Objects' (cursor pictogram) en selecteer de twee hartkamers en markers door het houden van 'Ctrl'. Om de Z-positie van de contouren vast te stellen, klik met de rechtermuisknop en kies 'Wijzig Z-positie'. Stel de eerste tissue slice op 0 um.
  4. Voor de reconstructie, selecteert u Bestand> Save Data File Als redden. Sla na elk bestand importeren, dus als er een fout is gemaakt herstel is zo eenvoudig opnieuw laden van het vorige bestand.
  5. Om de volgende tissue slice toe te voegen aan de wederopbouw, klikt u op Bestand> Append wilt zien. Selecteer de .DAT bestand moet worden toegevoegd, en controleer de 'Merge' doos.
  6. Volg Stap 1.4.3 naar de Z-positie van de nieuw geïmporteerde trace bestand opnieuw aan te passen. Selecteer alleen de nieuw toegevoegde links en rechts contouren in het hoofdvenster om te voorkomen dat het verplaatsen van de andere sporen. Stel elke opeenvolgende traceerbestand tot 50 urn van de Z-positie van de voorafgaande contour tot 50 urn secties. (Eerste contour: z = 0, tweede contour: z = 50, derde contour: z = 100, etc.)
  7. Om de X, Y positie van de geselecteerde contouren en markeringen aan te passen, klikt u op de 'Enable Translation met Mouse' ingedrukt en sleep de contouren aan te sluiten bij de vorige weefsel contouren. Houd zowel de links en rechts de contouren van het huidige trace geselecteerdesynchrone beweging mogelijk te maken.
  8. Om draai de sporen met de klok mee of tegen de klok in om line-up de middellijn markers, selecteert u de 'Z-as Rotation' knop. Om contouren over de Y-as te spiegelen (als de linker contour is aan de rechterkant) te selecteren zowel geïmporteerde contouren en markers, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Set Rotation Angle', en voer '180' in de 'Y-rotatie'.
  9. Zorg ervoor dat de ventrikels en de middellijn markers beste zijn uitgelijnd voor het opslaan van de reconstructie-bestand, als in stap 1.4.4.
  10. Herhaal de stappen 1.4.5 tot 1.4.9 voor elke volgende tissue slice totdat alle zijn geïmporteerd en goed uitgelijnd.
  11. Om het volume gegevens van de seriële reconstructie bekijken, klikt u Analyse> 'Markers en Regio Analysis' en selecteer '3D Contour Samenvatting'. Selecteer alle contouren in het linker paneel en klik op de '3D-visualisatie' knop om de uiteindelijke 3D-reconstructie te geven.

2. Mens: Analyse van periventriculaire Cellular Integriteit en 3D modellering van de laterale ventrikel

2.1) Human MRI Data Analysis

OPMERKING: protocollen worden opgesomd om 3D-beeld reconstructies en volumetrische kwantificering van de laterale ventrikels maken en beoordelen volumetrische veranderingen in de tijd met behulp van longitudinale overlay analyse. Het is belangrijk op te merken dat de consistentie in MR data verzamelen (bv, machine en magneet kracht, coupedikte, oriëntatie en resolutie) en post-acquisitie processing zijn uiterst belangrijke criteria voor opname van data sets 20.

  1. Ventriculaire Segmentatie
    OPMERKING: ITK / Snap wordt gebruikt om het segment van de ventrikels van de hoge-resolutie-T1-gewogen MR beelden. Als alternatief kunnen andere freeware software, zoals Freesurfer worden gebruikt.
    1. Open ITK / Snap, File> Open grijswaardenafbeelding. Selecteer de gewenste bestanden en open een .nii bestand (NITFI bestand).
    2. Blader door elke anatomical vliegtuig, merkt ventriculaire afwijkingen (vernauwde gebieden, groot of klein tijdelijke hoorns, etc.). In het Main Toolbox klik op 'Snake ROI Tool'. Klik op 'Segment 3D'. Selecteer de optie 'Intensity Region'.
    3. Klik op 'Preprocessen Image'. Selecteer 'Boven', naar regio's onder een bepaalde intensiteit drempel omvatten om ROI te markeren in het wit. Noteer maximale intensiteit met schuifbalk. Stel de drempel tot 15% van de maximale intensiteit (opnemen deze waarde). Stel gladheid parameter tot 10. Klik op 'OK' en vervolgens op 'Volgende'.
    4. Voeg 10-12 small (maat 2) "bubbles" aan elke ventrikel: twee in de voorste frontale hoorn, zeven gelijkmatig verdeeld over het bovenste oppervlak van het laterale ventrikel lichaam, een in de occipitale hoorn en een in de tijd Hoorn laterale ventrikel. 'Selecteer Parameters' en stel kromming kracht tot 0,4. Klik op de Play Symbol om actieve contour evolutie beginnen.
    5. Klik op 'Bijwerken Mesh' aan de oppervlakte te visualiseren; check 'Auto-update'. Stop segmentatie wanneer alle delen van de laterale ventrikel in het gebied van belang (ROI). Vermijd opname van het derde ventrikel. Klik op 'Finish'.
    6. Handmatig bewerken afbeelding indien nodig om ongewenste gebieden verwijderen door de volgende manieren (meestal moeten derde ventrikel lekkage te wissen). Handmatig gebruik maken van de '3D Scalpel' hulpmiddel om overtollig regio's te verwijderen of handmatig gebruik maken van de 'Penseel' tool 'Clear Label' als de actieve tekening label aan een opname voorbij ROI te wissen.
    7. Sla segmentatie resultaten als een .nii imago ('Nifti' bestandsformaat).
    8. Om totale ventrikel volume te verkrijgen, selecteert u 'Segmentatie> Volume' en statistiek; het verkrijgen van de totale volume van de hartkamer met set kleur label.
  2. Longitudinale Vertegenwoordiging Van laterale ventrikels Van MRIScans
    LET OP: Het gebruik vanMango software, zijn longitudinale ROI bedekt op veranderingen in ventrikel volume binnen proefpersonen in de tijd kwalitatief en kwantitatief aan te tonen.
    1. Open Mango. Klik op File> Load ROI van de eerste ROI tijdstip (baseline) als GREEN. File> Load ROI van de tweede ROI tijdstip als RED. Sla longitudinale overlay door Bestand> Opslaan als; toewijzen elk beeld als 'file name_ [eerst punt leeftijd] - [tweede keer punt leeftijd] .nii'.
    2. Open ITK-SNAP. Open het gecombineerde ROI als 'grijswaarden', door het selecteren van Segmentatie> Load Uit afbeelding> gecombineerd ROI-bestand. Voor het verkrijgen van longitudinale datavolume voert u de volgende: Segmentatie> Volume en Statistiek> Label 1 (rood) = expansievolume; Label 2 (groen) = stenose volume; Label 3 (blauw) = basis volume.

2.2) Human periventriculaire Tissue Voorbereiding en Analyse

  1. Veiligheidsvoorschriften voor het werken met menselijk weefsel
    1. Verkrijgen appropriate veiligheid opleiding (bijv., bloedpathogenen natuurlijk).
    2. Observeer standaard (universele) veiligheidsmaatregelen. Draag handschoenen. Wijzig handschoenen voordat het aanraken gemeenschappelijke apparatuur of oppervlakken die niet eenmalig zijn. Label alle items routinematig behandeld bij het werken met menselijk weefsel met 'menselijk gebruik weefsel' aanduidingen.
    3. Volg ontsmetting practices voor alle items contact menselijk weefsel. Bleach alle vervuilde vloeistoffen voor een minimum van 24 uur voorafgaand aan verwijdering, behandeling van besmette oppervlakken met een bleekwater gedrenkte doek (bijvoorbeeld, bank boven) of door het plaatsen van objecten direct in bleekwater (bijv tang).
    4. Bereid rampenplan voor contact met menselijk weefsel direct op de huid, die kunnen bestaan ​​uit het weken een papieren handdoek in bleekwater en houden op het getroffen gebied (5-10 min).
    5. Gebruik de juiste afvalverwijdering voor alle items in contact komen met menselijk weefsel.
  2. Laterale ventrikel Hele Mount Voorbereiding
    1. Beginning met een intacte halfrond (gefixeerd in 10% formaline en grondig gespoeld met 0,1 M PBS), snijd 1,5 cm dik coronale secties door middel van hele halfrond met groot mes.
      OPMERKING: Alle fixatie protocollen vereisen voordat antilichaam verificatie.
    2. Label secties voor naar achter te beginnen met eerste deel bevat de laterale ventrikel. Gebruik een alfanumeriek etiketteersysteem labelen van de plakjes met letters (anterior naar posterior) en punt met nummers (top down). Vermijd verstoren ependymale oppervlak.
    3. Met behulp van microchirurgische scalpel, ontleden ventrikel wand 1 cm diep, het onderhouden van een continue gedeelte voor hele laterale wand. Splits de muur als nodig is om de juiste maat secties te creëren voor zowel kleuring. Notch deel aan de andere kant van de hartkamer muur om superieure / inferieure oriëntatie te identificeren.
    4. Voer antigeenterugtrekking door incubatie weefselsecties in 10 mM natriumcitraat buffer (pH 6,0) bij 100 ° C gedurende 10-20 min onder toepassing van een dubbele BOILEr (optimale incubatietijd is empirisch bepaald). Spoel 3 maal in PBS / 0,1% Triton X-100 (PBS-TX).
    5. Block in 10% paardenserum middels PBS / PBS-TX gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
    6. Incubeer met primaire antilichamen gedurende 48 uur bij 4 ° C. Om ventrikel wandbekleding visualiseren, immunostain hele mounts met de volgende antilichaam combinaties: de muis anti-β-catenine (1: 250); geit anti-GFAP (1: 250); konijnen anti-AQP4 (1: 400).
    7. Voer alle volgende stappen in het donker. Spoel tissue 3 maal in PBS, geïncubeerd met secundaire antilichamen (1: 500) gedurende 24 uur bij 4 ° C of 2 uur bij kamertemperatuur geroerd, en spoel nog 3 maal in PBS. Incubeer weefsel in DAPI gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur geroerd gevolgd door nog 3 spoelingen in PBS.
    8. Bereid weefsel voor de uiteindelijke dissectie door het bedekken van een wax bodem gerecht met parafilm. Vul schotel met PBS, plaats weefsel in de schotel met behulp van fijne tang, het vermijden van contact maken met ependymale muur.
    9. Onder de microscoop ontleden, stevig Secure weefsel op zijn kant met pinnen. Met een 22.5 ° microchirurgische stab mes, maken uniforme dunne secties (ongeveer 300 micrometer dik) van de laterale ventrikel wand. Voor grote delen of secties met moeilijke kromming, snijd ze in kleine blokjes vóór het snijden in de definitieve secties voor montage en note locatie.
    10. Plaats zorgvuldig ontleed sectie ependyma kant naar boven op dia met behulp van fijne tang, het kennis nemen van de regionale locatie en oriëntatie op de dia. Bedek weefsel met dun laagje aquapolymount, zorg om luchtbellen te vermijden. Plaats dekglaasje dan weefsel, voeg extra aquapolymount als nodig is om eventuele lacunes vullen onder dekglaasje.
    11. Plaats gemonteerde secties donker en droog gedurende 2-3 dagen bij kamertemperatuur geroerd. Bewaren in slidebox bij 4 ° C.
  3. Immunohistochemische en histologische analyse
    1. Met behulp van confocale microscopie fluorescerende immunohistochemie geven, de beeldvormende brandvlak aan het ventrikel oppervlak, zoals bepaald met behulp of β-catenine (marker voor apicale adherens junction eiwitten van ependymale cellen). Bakenen gebieden van ependymale cel dekking en oppervlakte astrogliose (GFAP kleuring op ventrikel oppervlak).
    2. Te documenteren en Montage het gehele ventrikel oppervlak, gebruik overlappende afbeeldingen om gehele oppervlak te dekken. Om montage van de seriële beelden te creëren, openen Adobe Photoshop. Gebruik Bestand> Automatisch> Photomerge> Interactieve lay-out om beelden te selecteren om overlay, waardoor handmatige aanpassingen indien nodig.
    3. Maak een nieuwe laag aan montage aan cartoon vertegenwoordiging van intacte ependyma mobiele dekking of ventrikel oppervlak gliosis genereren traceren. Herhaal dit voor elke dia of ROI. Compileer alle secties om de kaart van de hartkamer muur en koppeling te reconstrueren aan de overeenkomstige gebied op MRI wederopbouw.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Contour traceren van de muis laterale ventrikels gebaseerd op immuno 50 urn coronale secties en 3D-reconstructies (figuur 3) laat datavolume te halen in verschillende experimentele paradigma muis gebruiken als modelsysteem voor de ziekte of letsel. Essentieel voor deze werkwijze is het uitsluiten van gebieden waar de laterale ventrikel wanden aan elkaar hechten. Bij subsegmenting gebieden van de ventrikels en aanwijzing van een verschillende kleur voor elk gebied (figuur 3C), kunnen ope...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren instrumenten en protocollen die kunnen worden gebruikt om de integriteit van de hersenen ventrikelsysteem bij muizen en bij de mens te evalueren. Deze hulpmiddelen kunnen echter ook worden toegepast op andere hersenstructuren of orgaansystemen die verandert als gevolg van letsel, ziekte ondergaan, of tijdens het verouderingsproces 14,21,22. De strategieën gepresenteerd take voordeel van software die het mogelijk maakt de uitlijning van cross-sectionele en longitudinale MRI sequenties voor 3D vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze werkzaamheden werden ondersteund door een NINDS Grant NS05033 (JCC). Het RAC, SURF en OUR programma's van de Universiteit van Connecticut zorgden voor aanvullende ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fosfaat gebufferde saline (PBS)Life Technologies21600-069
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences19210Gebruik bij 4% in PBS, 4 °C
Normaal PaardenserumLife Technologies1605010% in PBS-TX (v/v)
Normaal GeitenserumLife Technologies1621010% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)Sigma-AldrichT87870,1% in PBS (v/v)
VibratomeLeicaVT1000S
FluorescentiemicroscoopZeissImager.M2
CameraHamamatsuORCA R2
Microscoop tafel controllerLudl Electronic ProductsMAC 6000
Stereologische softwareMBF BioscienceStereo Investigator 11
Stereologische softwareImageJ/NIHNIH freeware
3D Reconstructie softwareMBF BioscienceNeurolucida Explorer
Confocale microscoopLeicaTCS SP2
MRI Software
Freesurferhttps://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstallSegmentatie en Volume
ITK-Snaphttp://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.phpSegmentatie en Volume
Multi-image Analyse GUI (Mango)http://ric.uthscsa.edu/mango/Longitudinale overlay
Whole Mount Equipment
22,5° microchirurgische rechte mesFisher ScientificNC9854830
parafilm
waxbodem dissectieschaal 
pennen
fijne pincet
aquapolymount
Dissectie MicroscoopLeicaMZ95
Whole Mount Antilichamen
muis anti-b-cateninBD Bioschiences, San Jose, CA, USA1:250
geit anti-GFAPSanta Cruz Biotechnology1:250
konijn anti-AQP4 (aquaporin-4) Sigma-Aldrich1:400
Coronaal Antilichamen
Anti-S100β antilichaamSigma-Aldrich1:500
4’,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Life TechnologiesD-130610 µg/ml in PBS

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 55-73 (2010).
  2. Johanson, C., et al. The distributional nexus of choroid plexus to cerebrospinal fluid, ependyma and brain: toxicologic/pathologic phenomena, periventricular destabilization, and lesion spread. Toxicol Pathol. 39, 186-212 (2011).
  3. Roales-Bujan, R., et al. Astrocytes acquire morphological and functional characteristics of ependymal cells following disruption of ependyma in hydrocephalus. Acta Neuropathologica. 124, 531-546 (2012).
  4. Cserr, H. F. Physiology of the choroid plexus. Physiol Rev. 51, 273-311 (1971).
  5. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4, 147ra111(2012).
  6. Shook, B. A., et al. Ventriculomegaly associated with ependymal gliosis and declines in barrier integrity in the aging human and mouse brain. Aging Cell. , (2013).
  7. Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342, 373-377 (2013).
  8. Fazekas, F., et al. Pathologic correlates of incidental MRI white matter signal hyperintensities. Neurology. 43, 1683-1689 (1993).
  9. Meier-Ruge, W., Ulrich, J., Bruhlmann, M., Meier, E. Age-related white matter atrophy in the human brain. Ann N Y Acad Sci. 673, 260-269 (1992).
  10. Resnick, S. M., Pham, D. L., Kraut, M. A., Zonderman, A. B., Davatzikos, C. Longitudinal magnetic resonance imaging studies of older adults: a shrinking brain. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 23, 3295-3301 (2003).
  11. Sener, R. N. Callosal changes in obstructive hydrocephalus: observations with FLAIR imaging, and diffusion MRI. Comput Med Imaging Graph. 26, 333-337 (2002).
  12. Sze, G., et al. Foci of MRI signal (pseudo lesions) anterior to the frontal horns: histologic correlations of a normal finding. AJR Am J Roentgenol. 147, 331-337 (1986).
  13. Tisell, M., et al. Shunt surgery in patients with hydrocephalus and white matter changes. Journal of Neurosurgery. 114, 1432-1438 (2011).
  14. Valdes Hernandez Mdel, C., et al. Automatic segmentation of brain white matter and white matter lesions in normal aging: comparison of five multispectral techniques. Magn Reson Imaging. 30, 222-229 (2012).
  15. Shook, B. A., Manz, D. H., Peters, J. J., Kang, S., Conover, J. C. Spatiotemporal changes to the subventricular zone stem cell pool through aging. The Journal of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 32, 6947-6956 (2012).
  16. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  17. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  18. Luo, J., Daniels, S. B., Lennington, J. B., Notti, R. Q., Conover, J. C. The aging neurogenic subventricular zone. Aging Cell. 5, 139-152 (2006).
  19. Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain. J Neurosci. 28, 3804-3813 (2008).
  20. Marcus, D. S., Fotenos, A. F., Csernansky, J. G., Morris, J. C., Buckner, R. L. Open access series of imaging studies: longitudinal MRI data in nondemented and demented older adults. J Cogn Neurosci. 22, 2677-2684 (2010).
  21. Giorgio, A., De Stefano, N. Clinical use of brain volumetry. J Magn Reson Imaging. 37, 1-14 (2013).
  22. Caspers, S., et al. Studying variability in human brain aging in a population-based German cohort-rationale and design of 1000BRAINS. Front Aging Neurosci. 6, 149(2014).
  23. Keuken, M. C., et al. Ultra-high 7T MRI of structural age-related changes of the subthalamic nucleus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 4896-4900 (2013).
  24. Marti-Bonmati, L., Sopena, R., Bartumeus, P., Sopena, P. Multimodality imaging techniques. Contrast Media Mol Imaging. 5, 180-189 (2010).
  25. Bergmann, O., et al. The age of olfactory bulb neurons in humans. Neuron. 74, 634-639 (2012).
  26. Sanai, N., et al. Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy. Nature. 478, 382-386 (2011).
  27. Wang, C., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21, 1534-1550 (2011).
  28. Carmen Gomez-Roldan, D. el, M,, et al. Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase. The Journal of Comparative Neurology. 507, 1571-1587 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ventrikelvolume3D reconstructieimmunohistochemische analyseependymcellenMRI scansmuizenbreinweefselconfocale microscopieventriculomegalie

Gerelateerde artikelen