Lasermicrodissectie - Een demonstratie van de Isolatie van individuele dopamineneuronen en de Gehele Ventral tegmentum

Summary

De isolatie van individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale met directe of indirecte immunohistochemie wordt aangetoond met behulp van lasermicrodissectie. Parameters voor isolatie van weefsel uit een glasplaatje met een infrarood laser en van membraansystemen dia met de combinatie van infrarood en ultraviolet laser besproken.

Abstract

Laser capture microdissectie (LCM) wordt gebruikt om een ​​geconcentreerde populatie van afzonderlijke cellen of exacte anatomische gebieden van weefsel van weefselcoupes isoleren op een microscoopglaasje. In combinatie met immunohistochemie kan LCM worden gebruikt om individuele celtypen basis van een specifiek eiwit marker isoleren. Hier wordt de LCM techniek beschreven voor het verzamelen van een specifieke populatie van dopamine neuronen direct gemerkt met tyrosine hydroxylase immunohistochemie en voor isolatie van de dopamine neuron bevattend gebied van het ventrale tegmentale gebied met indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemie op een gedeelte naast die voor LCM. Een infrarood (IR) laser capture wordt gebruikt om zowel ontleden individuele neuronen en het ventrale tegmentale gebied voor objectglaasjes en op een LCM dop voor analyse. Volledige dehydratatie van het weefsel 100% ethanol en xyleen kritisch. De combinatie van de IR laser capture en ultraviolet (UV) cutting laser wordt gebruikt om individuele dopamine neuronen of het ventrale tegmentale gebied isoleren bij gebruik PEN membraan slides. Een PEN membraan schuif heeft significante voordelen boven een glasplaatje omdat daarmee een betere samenhang in het vangen en verzamelen van cellen sneller verzamelen van grote stukken weefsel, minder afhankelijk uitdroging en leidt tot volledige verwijdering van het weefsel van de glijbaan. Hoewel verwijdering van grote delen van weefsel uit een glasplaatje haalbaar is aanzienlijk meer tijd in beslag en laat vaak vanuit enig resterend weefsel. De gegevens hier tonen dat RNA van voldoende hoeveelheid en kwaliteit kan worden verkregen met gebruik van deze procedures voor kwantitatieve PCR metingen. Hoewel RNA en DNA zijn de meest geïsoleerde moleculen uit weefsels en cellen verzameld LCM, isolatie en meting van microRNA, eiwitten en epigenetische veranderingen in het DNA kunnen ook profiteren van de verbeterde anatomische en cellulaire resolutie verkregen middels LCM.

Introduction

Alle weefsel bestaat uit een heterozygote populatie van cellen. Dit is met name relevant voor hersenweefsel, bestaande uit verschillende morfologisch en / of neurochemisch verschillende neuronen, omringd door verschillende soorten gliacellen (oligodendrocyten, microglia en astrocyten). Bovendien onderscheiden gebieden in de hersenen, zoals gebieden van de cortex of hersenstam kernen specifieke functies. Daarom is de mogelijkheid om specifieke populaties van cellen of kleine anatomisch verschillende gebieden te isoleren, in combinatie met analytische technieken (bijv Q-PCR, microarrays, RNA-sequencing en proteomics) kan aanzienlijk het inzicht in verschillende biologische processen. LCM is een technologie die de mogelijkheid om zeer discrete anatomische gebieden of specifieke cellen te isoleren uit weefsel op een microscoopglaasje zodat een veel homogenere bron voor verdere analyse van verschillende moleculen, zoals RNA, microRNA, DNA en eiwitten verschaft.

t "> Sinds LCM werd geïntroduceerd, zijn verschillende benaderingen gebruikt om cellen microdissect uit weefsel ^1-3 De eerste benaderingen onder directe bevestiging van weefsel op een dia met een infrarood (IR) laser en een thermoplastische film en een niet. contact methode waarbij een ultraviolet (UV) laser snijden van een cel of weefsel en verzamelen in een buis los. Vervolgens LCM is met succes toegepast op een verscheidenheid van weefsels en celtypen en getoond verenigbaar met isolatie van verschillende moleculen downstream analyse waaronder RNA, microRNA, DNA en eiwitten, waaronder enzymatische activiteit ^1,4-7. Hier LCM wordt aangetoond door middel van een LCM systeem dat een snij UV laser en een capture IR laser voor het snijden rond cellen of weefsel en bevestigen aan een gebruikt LCM cap, respectievelijk. Deze LCM systeem gebruikt zowel de IR laser capture een plastic film op een kap over de cel of weefsel van belang dat de cellen gehecht aan de plastic film en verwijderd uit t smeltenHij weefsel met het verwijderen van de kap (figuur 1). Bovendien, in combinatie met de IR laser, een UV laser beschikbaar is uitgesneden weefsel of cellen van interesse uit weefsel aangebracht op objectglaasjes met een membraan vervolgens geïsoleerd door het aanbrengen van het weefsel op de LCM dop met de IR laser (figuur 2). Een kort overzicht van deze technieken is in de figuren 1 en 2.

Verscheidene variaties van deze techniek zijn beschreven hetzij isoleren specifieke cellen middels direct fluorescent immunohistochemie en een indirecte immunohistochemie geleide techniek die wordt gebruikt voor het isoleren van een gebied van weefsel op basis van de expressie van een specifiek eiwit. Specifiek, de isolatie van dopamine neuronen van de substantia nigra en isolatie van het ventrale tegmentale gebied en de daaropvolgende isolatie van RNA uit vers, bevroren hersenweefsel getoond. RNA is het meest labiele moleculen gemeten (vergeleken met DNA of eiwit), steps op de instandhouding van RNA integriteit zijn opgenomen en de gegevens die op de kwantiteit en kwaliteit van RNA verkregen.

Protocol

OPMERKING: hersenweefsel van muizen werd gebruikt in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren, en onderzoeksprotocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Mississippi State University.

1. Voorbereiding van de dia's en Tissue

1. Gebruik een silaan-prep dia's of polyethyleennaftalaat (PEN) membraan glasplaatjes.
2. Voor RNA-isolatie, dip dia's in RNase decontaminatie-oplossing, was 3 maal met RNase-vrij water vervolgens uitdrogen met een gesorteerde reeks van RNase-vrij ethanol en vacuüm droog gedurende 30 minuten.
3. Snijd weefselsecties 10 urn dik met een cryostaat en monteren op de voorbereide RNase vrij dia. Houd de secties bevroren tijdens het snijden om RNA kwaliteit te behouden.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel is ongeveer 4 mm van de randen van de dia als de LCM kan niet weefsel dat is te dicht bij de randen van de dia te verwijderen. In order weefsel van een PEN membraan dia verwijderen verzekeren dat het weefsel 4 mm van links, boven en onder en 7 mm vanaf de rechterzijde van de slede die de afmetingen van het membraan dat niet is aangesloten op de dia zijn.
4. Voor isolatie van individuele celpopulaties met behulp van directe immunohistochemie, weefselcoupe op hetzij het silaan-prep dia's of PEN membraan dia's. Voor de isolatie van de regio's van weefsel met behulp van indirecte immunohistochemie begeleide technieken, monteren een set van secties op een silaan-prep glijbaan voor immunohistochemie en alternatieve secties op ofwel een PEN membraan glijbaan en / of een silaan-prep slide te worden gebruikt voor LCM.

2. Tissue Voorbereiding voor Laser Capture - Rapid tyrosinehydroxylase- Immunohistochemistry voor Direct Laser Capture van Immunoreactieve Cellen

1. Schetsen weefsel met een hydrofobe pen en laten drogen.
2. Fix weefsel in aceton-methanol (1: 1) oplossing bij -20 ° C gedurende 10 min.
   OPMERKING: Our is gebleken dat de aceton-methanol fixatie resulteerde in veel consistenter immunohistochemie dan aceton of methanol alleen.
3. Spoel dia in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 1% Triton (RNase vrij).
4. Afdekprofielen 100-200 ul PBS met 1% Triton met tyrosine hydroxylase antilichaam 1: 100 verdund met 400 U / ml RNasin. Incubeer gedurende 5-10 min.
5. Spoel even in PBS twee keer en PBS-1% Triton.
6. Bedek weefsel 100-200 pl geit anti-konijn IgG gelabeld met Alexa Fluor 488 1: 100 verdund in PBS-1% Triton met 400 U / ml RNasin en 50 ng / ml DAPI. Incubeer gedurende 5 min.
7. Spoel 2 keer in PBS vervolgens dehydrateren 30 s in een gegradeerde reeks van RNase ethanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%).
8. Incubeer in twee wassen van xyleen gedurende 1 min daarna 5 min.
9. Slides Xyleen verwijderen onmiddellijk vóór gebruik op LCM en laat aan de lucht drogen.

3. Tissue Voorbereiding voor Laser Capture - TyrosineHydroxylase Immunohistochemistry voor Indirecte Laser Capture van Immunoreactieve Regio

1. Proces één dia met secties naast secties gemonteerd op silaan-prep en / of PEN membraan dia's voor immunohistochemie.
   OPMERKING: Procedures die hier gebruikt zijn vergelijkbaar met die eerder gerapporteerd ^5. Voor de demonstratie beelden werd de diaminobenzidine (DAB) chromagen reactie gebruikt om de tyrosine hydroxylase neuronen van belang te visualiseren.
2. Voor slides voor LCM, vast gedurende 5 min in 100% aceton bij 4 ° C.
3. Dehydrateer weefsel in een gegradeerde reeks van RNase-vrije ethanol (75% -75% -95% -95% -100% -100%) gedurende 1 min elk.
4. Incubeer in twee wassen van xyleen gedurende 1 min daarna 5 min.
5. Slides Xyleen verwijderen onmiddellijk vóór gebruik op LCM en laat aan de lucht drogen.

4. Met behulp van de lasermicrodissectie System

OPMERKING: Het LCM toepassingsprogramma heeft 10 Tool bars en 2 ramen aan de besturenmicrodissection procedure. Werkbalken: 1. Microscoop, 2. Capture Laser, 3. Snijden Laser, 4. Studie, 5. Navigatie, 6. Materialen, 7. Capture groepen, 8. Microdissection, 9. Font, 10. annotatie. Windows: 1. Live Video en 2. routekaart.

1. Open de deur door het tabblad "Open deur" in de Materials werkbalk in LCM systeemsoftware.
2. Belasting dia's op de drie beschikbare slots. Voor deze demonstratie, plaatst u een glijbaan met tyrosine hydroxylase immunohistochemie gevisualiseerd met DAB, een silaan-prep glijbaan en een PEN membraan dia elk gelabeld voor snelle fluorescerende tyrosine hydroxylase immunohistochemie. In een typisch experiment, gebruikt u een ongelabelde aceton vaste secties met een verwijzing glijbaan gelabeld voor tyrosine hydroxylase gebruik van DAB of dia's direct gemerkt met fluorescerende tyrosine hydroxylase voor laser capture.
3. Laad de LCM caps in het beschikbare slot.
   OPMERKING: Macro en HS LCM caps zijn beschikbaar voor gebruik. Het type LCM cap te gebruiken deaf van het aantal cellen of de hoeveelheid weefsel te verzamelen. Macro dia's worden opgesomd om verzamelen tot enkele duizenden cellen terwijl HS caps enkele honderden kunnen verzamelen. De Macro glijbanen zorgen voor meer weefsel collectie, maar hebben 50 ul van lysis buffer. De HS kap, in combinatie met de adapter, vereist slechts 10 ul lysisbuffer waardoor grotere evenredige herstel van RNA.
4. Doe de deur dicht.
5. Laad de dia naar de routekaart venster waarin een werkende uitzicht over de hele dia biedt activeren, dit zorgt voor de selectie van de regio van belang (figuur 3). Bekijk de routekaart op Live videovenster om te navigeren naar het gebied van belang.
6. In de Materials werkbalk, het identificeren van de PEN membraan dia's door het vakje boven de schuif slot. Om cap eigenschappen leveren, klik met de rechtermuisknop op de doppen in de Materials gereedschappen balk en selecteer "Cap supply eigenschappen". Vink de vakjes aan dat de positie van de doppen en selecteer Macro of HS caps.
7. Selecteer het tabblad "Fluorescentie" in de Microscope werkbalk te schakelen op de tl-lamp en laat de tl-lamp op te warmen. Gebruik de blauwe en UV-filters om te visualiseren de Alex Fluor 488 en DAPI, respectievelijk. Gebruik daarna "Camera" tab om de gevoeligheid van de afbeelding om de fluorescent gelabelde cellen zien verhogen.
8. In de Materials werkbalk, klik met de rechtermuisknop op een pet en verplaats het naar de dia van belang. Dubbelklik op een locatie in de routekaart naar het gebied dat in het venster Live video verschijnt selecteren. Beweeg de dop rond op de dia door een gebied op de routekaart (dubbel klik links) en dan rechts te klikken en te kiezen voor het selecteren van "Place dop in het midden regio."
9. Voor het gebruik van de IR-capture laser, richten en aanpassen voor kracht. Plaats de dop in een regio van de glijbaan weg van weefsel. Op de Capture Laser werkbalk, selecteert u "Enable." Pas de Macht (3-100 mW), Pulse (100-1000000 μSEC) en # Hits van de laser. Vuur de IR laser wanneer de kap is over een gedeelte van de dia zonder weefsel en controleren om te zien of de laser voldoende smelt het LCM dop membraan.
   LET OP: Dit is de zogenaamde bevochtiging die aan het smelten is het polymeer membraan op de dop zodat deze de glasplaatje. Voldoende bevochtiging is zichtbaar als een donkere ring gefuseerd aan de dia met het midden van de ring weg (zie figuur 4 voor voorbeelden voldoende en onvoldoende smelten). Als bevochtiging niet voldoende is, past u de kracht en de pols, en testbrand opnieuw totdat dit wordt bereikt. Bovendien, verschillende branden van de laser kan ook worden gebruikt.
10. Wanneer de IR laser intensiteit wordt aangepast, klik met de rechtermuisknop en selecteer "Capture laser is hier" om de laser te richten.
    OPMERKING: Deze stap vertelt de computer waar de IR-capture laser is gericht op het weefsel. Deze stap van het richten van de laser is kritisch en moet telkens de dop bewogen worden herhaald of het doel wordt veranderd.

5. lasermicrodissectie van individuele dopamineneuronen off van silaan-prep Slides

1. Ga naar het interessegebied cellen vangen.
   OPMERKING: Het voorbeeld van het isoleren van dopamine neuronen wordt hier getoond.
2. Om individuele cellen off van een silaan-prep dia vastleggen, selecteert u het tabblad "LCM" vervolgens op het pictogram "single point" in de Microdissection werkbalk.
3. In de Microscoop werkbalk, gebruikt u het tabblad "Shutter" om te schakelen tussen fluorescentie en helder veld met fluorescerende filters tabs om de juiste filters te kiezen en gebruik de tabbladen doelstellingen om de vergroting te wijzigen. Zodra de cellen van belang zijn zichtbaar in de Live-videovenster, pas de spotgrootte gebruikt om cellen van belang te markeren om de geschatte grootte van de cellen. Doe dit door te klikken op de tab Spot op de Capture Laser werkbalk vervolgens te klikken op één zijde van een gekleurde cel, gevolgd door te klikken op de andere kant.
   OPMERKING: Deze berekent dediameter van de spot en geeft de waarde.
4. Markeer de cellen van belang door erop te klikken terwijl het pictogram "Single point" is geselecteerd. Doe dit op een plek marker te plaatsen op elke cel. Hier, de blauwe filter en 10x objectief wordt gebruikt om dopamine neuronen te visualiseren. Hertest en richt de IR laser op de dop waar er geen weefsel eronder, zoals beschreven in de stappen 4.9 en 4.10.
5. Zodra de cellen zijn gemarkeerd, selecteert u de "Go - knippen en capture" tab op de Microdissection werkbalk en de IR-laser zal bij alle gemarkeerde cellen geselecteerd automatisch vuren. Bovendien, indien nodig, brand de IR laser handmatig op elk punt van belang (figuur 5D).
6. Beweeg de dop uit de buurt van de sectie en op een open gebied van de dia om te controleren of de cellen werden gevangen op de LCM dop. Zorg ervoor dat de cellen van belang worden verwijderd uit de schuif (figuur 5B, E) en aan de LCM dop (figuur 5C, F). Document this proces door te klikken op de "image Capture" tab in Microscoop werkbalk.
7. Wanneer u klaar bent het verzamelen van weefsel, verwijder de dop door rechts te klikken op de dop en selecteer "Verplaatsen naar" en vervolgens "uit te laden."

6. Laser Capture van individuele dopamineneuronen off van PEN Membraan Slides

1. Om individuele cellen vangen off van PEN membraan dia met behulp van zowel de IR en UV-lasers, selecteer "Knippen en Capture" tab in de Microdissection werkbalk. Selecteer het tabblad 'single point "om de cellen van belang te markeren. Gebruik het tabblad "Cut lijn" om elke cel te schetsen. Zorg ervoor dat de IR-laser testen zoals beschreven in stap 4.9 en 4.10 en testen van de UV-laser om de minimale intensiteit nodig is om te snijden dacht dat de PEN membraan en weefsel te bepalen (figuur 4 en 5)
2. Selecteer de "Capture and Cut" tab op de Microdissection werkbalk. Bij het verzamelen van individuele cellen met behulp van deze techniek, zijnZorg ervoor dat de IR-laser eerste, gevolgd door de UV-laser als deze kleine stukjes brand verloren kan gaan als ze al eerder zijn uitgesneden om te worden aangebracht op de LCM dop.
   OPMERKING: Dit proces kan ook handmatig worden gedaan door het afvuren van de IR-laser op een punt van belang en de cellen individueel geschetst met UV laser.
3. Na het verzamelen van de cellen van belang, bewegen zoals hierboven beschreven in stap 5.7 te bepalen of de cellen werden verwijderd en aan de kap (figuur 6) de LCM dop.
4. Wanneer u klaar bent het verzamelen van weefsel, verwijder de dop door met de rechtermuisknop te klikken op de dop en het selecteren van "Move to" en vervolgens "uit te laden."

7. Het vastleggen van de ventrale tegmentum van silaan-prep Slides

1. Om de regio van belang te identificeren, gebruik dan de verwerkt voor immunohistochemie glijbaan.
   LET OP: Voor deze demonstratie het ventrale tegmentale gebied wordt geïsoleerd (Figuur 7A).
2. Plaats een LCM dop en test de lasers zoals in staps 4.9 en 4.10.
   OPMERKING: Meestal wordt een Macro LCM dop gebruikt maar een HS dop kan ook worden gebruikt (zie figuur 8).
3. Om een gebied van weefsel (dwz, het ventrale tegmentale gebied) van het silaan-prep dia isoleren, selecteert u het tabblad "LCM" in de Microdissection werkbalk, selecteer het tabblad "polygoon-buitenkant". Een overzicht van de regio van belang in het venster Live Video. Afhankelijk van de grootte van het gebied voor de collectie, een overzicht van de regio van belang bij een lage vergroting (2X Doelstelling). Voor het verzamelen echter het instrument gebruikt 10X objectief zodanig af en richt de IR laser die 10X doelstelling voor vastleggen.
4. Selecteer de "Go - afvang en cut" tab in de Microdissection werkbalk.
   OPMERKING: De computer zal automatisch de IR laser brand in het hele geselecteerde gebied (Figuur 7F, I). Als het LCM membraan niet voldoende is gesmolten in het hele gebied, kan de laser worden afgevuurd manually of het hele proces herhaald.
5. Verplaats de LCM dop van het weefsel te bepalen hoe goed het weefsel verzameld.
   OPMERKING: Een pas met behulp van deze methode laat meestal wat weefsel achter op de dia (zie Figure7G). Als dit gebeurt, herhaalt u de selectie en vooral vast te leggen stap. Herhalen deze stap kan de hoeveelheid weefsel verzameld (Figuur 7J) verhogen.
6. Wanneer u klaar bent het verzamelen van weefsel, het lossen van de dop door met de rechtermuisknop te klikken op de dop en het selecteren van "Move to" en vervolgens "uit te laden."

8. Het vastleggen van de ventrale tegmentum van PEN Membrane Slides

1. Gebruik het verwerkt voor immunohistochemie dia als een leidraad voor de regio van belang te kiezen uit het weefsel van de PEN membraan dia als hierboven.
2. Selecteer de "Knippen en Capture" tab in de Microdissection werkbalk. Selecteer het tabblad "Cut Line" en een overzicht van de regio van belang het gebruik van de immunohistocheMistry bestempeld dia als een gids.
   OPMERKING: Het programma zal automatisch plekken toe te voegen voor de IR laser om het weefsel te hechten aan de dop. Gebruik het tabblad 'single point "om extra plekken toe te voegen aan het weefsel aan de dop beter te beveiligen.
3. Onder de 10X objectief, testbrand en richt de IR en UV-laser zoals beschreven in 4.9 en 4.10. Test dat de UV laser het membraan kunnen dringen op de glijbaan en dat deze snede correspondeert met de locatie op het computerscherm. Gebruik een UV laser sterkte die net voldoende om het membraan en het weefsel snijden niet het weefsel (figuur 5) beschadigen.
4. Selecteer de "Go - afvang en cut" tab in de Microdissection werkbalk.
   OPMERKING: De computer zal automatisch de IR laser schieten op alle gelabelde plekken in het weefsel om het te hechten aan de dop vervolgens het vuur van de UV-laser om de dia PEN membraan en weefsel (figuur 7C) snijden. Extra IR gesmolten plekken kan nodig zijn om de tis adequaat te hechtenvervolgen de LCM grenswaarde, die handmatig kunnen worden toegevoegd.
5. Verplaats de LCM dop van het weefsel te bepalen of het weefsel verwijderd uit het gedeelte (figuur 7C) en bevestigd aan de kap (figuur 7C).
6. Wanneer u klaar bent het verzamelen van weefsel, om de dop te verwijderen, klik met de rechtermuisknop op de dop en selecteer "Verplaatsen naar" en vervolgens "uit te laden."

9. Isolatie van RNA

1. Om RNA van de gevangen cellen of weefsels verzamelen, incubeer de LCM dop membraan RNA lysisbuffer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
   LET OP: Voor HS caps, een adapter beschikbaar die het mogelijk maakt voor het gebruik van slechts 10 ul van lysis buffer op de dop en hecht aan een 0,5 ml microcentrifugebuis. De Macro doppen hebben 50 ul lysisbuffer en wordt rechtstreeks naar een 0,5 ml microcentrifugebuis.
2. Na incubatie, draai de lysebuffer beneden in de 0,5 ml microcentrifugebuis.
3. Om volledige lysis van alle cellen o zorgenr weefsel, schil van de LCM dop membraan van de dop en plaats in de lysis buffer.
4. Om te testen voor RNA integriteit, gebruik RNA geïsoleerd uit het weefsel nog op de dia na LCM om RNA integriteit meten.
   Opmerking: Door de beperkte monster RNA verkrijgbaar LCM, is het meestal niet praktisch om RNA integriteit te testen op LCM geïsoleerde RNA echter RNA uit het restmateriaal een goede indicator van RNA degradatie door fixatie, immunohistochemie en tijdens de LCM procedure.

Results

De microfoto in figuren 6 en 7 tonen de mogelijkheden voor isolatie van afzonderlijke dopamine neuronen. De huidige anatomische resolutie is ongeveer 5-10 urn als kleinste puntgrootte die consistent kan worden geproduceerd op LCM caps een cel isoleren. De enige beperking voor isolatie van specifieke celtypen is de mogelijkheid om de cellen te visualiseren. Hoewel LCM kan isoleren individuele dopamine neuronen, besmetting van delen van aangrenzende ongelabelde cellen waarschijnlijk optreedt. Daarom is de laatste monster een geconcentreerde verzameling van dopamine neuronen niet een zuivere populatie van dopamine neuronen. Deze technologie kan ook isoleren kleine gebieden van weefsel zoals afzonderlijke kernen of gebieden in de hersenen zoals de isolatie van het ventrale tegmentale gebied. Vorige publicaties dit gebruik in hersenweefsel aangetoond en pathologische weefsel isoleren van normaal weefsel ^5,11.

Omdat de meest voorkomende gebruik van cellen en weefsels geïsoleerd met behulp van LCM is RNA-analyse, de gepresenteerde procedures werden geoptimaliseerd om RNA integriteit te bewaren. Om de kwaliteit van RNA die overbleven na LCM bepalen RNA werd geïsoleerd, met silicagel spin kolommen van weefsel op de glijbaan volgende LCM, hetzij na de snelle tyrosine hydroxylase fluorescerende immunohistochemie procedure of fixatie in aceton. RNA kwaliteit werd gemeten en vergeleken met waarden van RNA uit commercieel verkrijgbare volledige hersenen RNA (Figuur 9). RNA kwaliteit is in de RNA monsters van weefsel voor LCM lagere integriteit na immunohistochemie (RIN niet beschikbaar) gevolgd door aceton fixatie (RIN 2.6) verminderd in vergelijking met hele brein RNA (RIN 8.2) zoals kan worden gezien door een relatieve daling hoogte van de rRNA S28 piek ten opzichte van de S18 piek. De RNA handhaafde de 18S en 28S banden en genexpressie kan worden gemeten met behulp van Q-PCR.

Om de hoeveelheid RNA verkregen neuronen verkregen via LCM, dopamine neuronen (50, 100 en 200 dopamine neuronen) te meten werden geïsoleerd uit het ventrale tegmentale gebied off van silaan-prep slides. RNA werd geïsoleerd met silicagel spin kolommen en de hoeveelheid RNA werd gemeten. Op basis van de standaardcurve gegenereerd, werd een totaal van 17,3, 24,8 pg en 50,9 pg / pl geïsoleerd uit 50, 100 en 200 dopamine neuronen, respectievelijk (Figuur 10A). RNA hoeveelheid meten Q-PCR, een reeks concentraties van volledige hersenen RNA en RNA uit de dopamine neuronen reverse getranscribeerd en β-actine gen werd gemeten met Q-PCR zoals eerder beschreven ^5. Gebaseerd op deze metingen werd een concentratie van 3,55, 6,82 en 20,58 pg / pl berekend uit 50, 100 en 200 dopamine neuronen, respectievelijk (Figuur 10B).

Om te demonstreren hoe isolatie van dopamine neuronen vergeleken met isolatie van het gehele ventral tegmentum met LCM, dopamine neuron specifieke genen (Nurr1, tyrosine hydroxylase en dopamine transporter) werden gemeten met Q-PCR in deze twee verschillende typen monsters en vergeleken met de expressie van β-actine (Figuur 11). Aangezien lagere _Ct waarden worden gegenereerd met een hogere concentratie van het gen van belang, een afname van de ΔC _t geeft een verhoogde expressie van de dopamine neuron genen opzichte van β-actine. Dit geeft aan hoe de isolatie van afzonderlijke dopamine neuronen concentreert de expressie van dopamine neuron specifieke genen. In het ventrale tegmentale gebied monsters worden dopamine neuron specifieke genen verdund als andere cellen (niet-dopaminerge neuronen en gliacellen) ook verzameld dat β-actine expressie maar dopamine neuron genen niet tot expressie.

Figuur 1. Laser capture met infrarood (IR) laser capture. De plastic LCM kap heeft een membraan aan de achterkant die bovenop weefsel aangebracht op een glasplaatje (stap 1) wordt geplaatst. Wanneer het weefsel of de cel van belang is geïdentificeerd, wordt een IR laser capture afgevuurd door de LCM dop een klein kuiltje in het membraan op het onderliggende weefsel / cel (stap 2) smelten. Wanneer de LCM verwijderd is, wordt het weefsel verwijderd uit het microscoopglaasje en blijft aan de LCM dop.

Figuur 2. Laser capture met infrarood (IR) vastleggen laser en ultraviolet (UV) laser snijden. Om grotere gebieden weefsel verkrijgen of het herstel van de cellen met UV laser vergemakkelijken, wordt het weefsel op een dia met een membraan gemonteerd verbonden met de schuif langs de buitenste hoek (PEN membraan dia's). De LCM dop op t geplaatstHij weefsel en de IR laser capture wordt gebruikt om de kap membraan smelten en hechten van het weefsel aan de LCM dop (stap 1 en 2). De UV snij laser wordt vervolgens gebruikt door de slede membraan en weefsels (stap 3 en 4), zodat wanneer de kap verwijderd is het weefsel verwijderd uit de schuif en blijft de LCM dop (stap 5) te snijden.

Figuur 3. De lasermicrodissectie System Road Map. Dit lasermicrodissectie System heeft ruimte voor 3 dia's tegelijk. Wanneer dia's in de microscoop worden geladen, zijn lage vergroting routekaart beelden per dia gegenereerd. Selecteren van een gebied op de afbeelding van de roadmap beweegt de Live Image venster om die regio. Ter demonstratie werd de muis mesencephalon verdeeld in 10 micrometer doorsnede op 3 glijbanen. De eerste dia werd gelabeld voor tyrosine hydroxylase immunoreactivity met diaminobenzidine als een chromageen (A). Secties werden op ofwel silaan-prep slides (B) of PEN membraan slides (C) aangebracht. Deze beide objectglaasjes werden gelabeld met de snelle fluorescerende tyrosine hydroxylase immunohistochemie. Pijlen in (C) geven de bevestiging van de PEN membraan naar de glasplaatje. Geen weefsel buiten deze grens kunnen worden verzameld met LCM.

Figuur 4. De IR laser capture. De IR capture laser wordt gebruikt om de LCM dop membraan naar het weefsel hechten aan de LCM dop en verwijderen van de rest van het weefsel smelt. De IR-capture laser moet op voldoende sterkte om de LCM dop membraan voldoende smelten contact opnemen met de onderliggende weefsel en glasplaatje. De afbeelding hierboven toont wanneer de laser onvoldoende om het membraan te smelten wasaan de dia (links twee plekken). Wanneer de gesmolten membraan raakt het glaasje, kan een dikke zwarte omtrek worden waargenomen (juiste plek). De intensiteit van de laser kan worden bijgesteld door de macht (3-100 mW), Pulse (100-1,000,000 psec) en # Hits van de laser. Bovendien herhaald afvuren van de IR laser op dezelfde plaats kan het membraan verder smelten. Doel van de IR laser moet worden aangepast wanneer de LCM dop bewogen of wanneer het doel wordt veranderd. Schaal bar = 100 micrometer.

Figuur 5. De UV laser snijden. De UV snij laser wordt gebruikt door de PEN membraan en het weefsel te snijden. Voorafgaand aan het minimum vereist om dwars door het membraan en het weefsel moet worden bepaald omdat de UV laser weefsel beschadigen gebruiken. Boven, de drie plekken (Arrows) van verschillende UV laser intensiteiten worden getoond met de links vlekgrootte voldoende 10 urn, de middelste vlek voor dikkere secties en de juiste plek tonen een UV laser intensiteit te hoog. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6. Directe isolatie van tyrosine hydroxylase immunoreactieve neuronen met de IR laser. Dopamine neuronen na een snelle fluorescente labeling voor tyrosine hydroxylase (A). Als de IR-laser wordt afgevuurd smelten van de LCM dop membraan dan deze neuronen (D), het verwijderen van de dop pikt deze cellen af van de schuif (B, E). Deze neuronen kunnen vervolgens worden gevisualiseerd als aan de LCM kap (C, F). Schaal bar = 250 pm.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 7. Directe isolatie van tyrosine hydroxylase immunoreactieve neuronen van PEN membraan dia met de IR- en UV-lasers. Tyrosine hydroxylase gelabelde neuronen hierboven (A) getoond. Deze neuronen kunnen worden bevestigd aan de LCM dop met de IR laser en gesneden uit de PEN membraan dia met de UV laser (B). Schaal bar = 250 pm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 8. Indirect isolatie van het ventrale tegmentale gebied met tyrosine hydroxylase immunoreactiviteit. De locatie van dopamine neuronen in het ventrale tegmentale gebied werd gevisualiseerd in een sectie met standaard immunohistochemie technieken (A en E). Deze immunohistochemie gemerkte gedeelte werd gebruikt als een sjabloon voor het ventrale tegmentale gebied ongekleurd aangrenzende secties (B en F) lokaliseren. De UV laser, werd het ventrale tegmentale gebied aan de LCM dop met de IR laser en gesneden uit de dia met de UV laser (C en D) en wordt getoond bevestigd aan een HS LCM dop (D). De ventrale tegmental regio geïsoleerd van silaan-prep dia's met alleen de IR-laser wordt ook een Macro dop (FK) weergegeven bevestigd. Merk op dat meerdere pogingen nodig was om de meeste van de weefsels verzamelen van deze regio (vergelijk G en J). Schaal bar = 500 micrometer.= Upload / 52336 / 52336fig8large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 9. RNA kwaliteit. Representatieve elektroferogrammen en bijbehorende gelbeelden van commercieel verkrijgbare volledige hersenen RNA (A) en RNA geïsoleerd uit gedeelten na aceton fixatie en LCM (B) of snelle fluorescente tyrosine hydroxylase immunohistochemie en LCM (C). Hoewel RNA kwaliteit verwerkt voor immunohistochemie, vergeleken met hele brein RNA gedeelten verminderd, de elektroferogrammen tonen grotendeels intact RNA gebaseerd op de aanwezigheid van rRNA S18 en S28 pieken. Hele brein RNA-concentratie bedroeg 6,487 pg / ul met een RIN van 8,2. Aceton vaste weefsel RNA-concentratie was 5,036 pg / pl met een RIN van 2,6. RNA verkregen na immunohistochemie h advertentie een concentratie van 4,474 pg / ul en RIN was niet beschikbaar.

Figuur 10. RNA hoeveelheid. De hoeveelheid RNA bepalen neuronen verkrijgbaar LCM, een standaardcurve van RNA concentratie werd vervaardigd volgens een fluorospectrometer en Q-PCR. Voor de fluorospectrometer metingen (A), de grote grafiek het hogere bereik van RNA bedragen en de kleine grafiek toont de gevoeligheid van deze test tot 10 pg / pl. Concentraties van RNA verkregen van 50, 100 en 200 dopamine neuronen was 17.3, 24.8 en 50.9 pg / pl, respectievelijk. Met Q-PCR met RNA bedragen (B) meten van de concentraties RNA verkregen van 50, 100 en 200 dopamine neuronen was 3,55, 6,82 en 20,58 pg / pl, respectievelijk.

es / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/>
Figuur 11. Concentratie van dopamine neuron specifieke genen met isolatie van afzonderlijke dopamine neuronen. Het verschil in _Ct (ΔC _t) tussen dopamine neuron specifieke genen (Nurr1, tyrosine hydroxylase en dopamine transporter) en β-actine in monsters van dopamine neuronen in het ventrale tegmentale gebied geïsoleerd met LCM vergeleken met expressie in secties van de gehele ventrale tegmentale gebied getoond. Aangezien lagere _Ct waarden worden gegenereerd met een hogere concentratie van het gen van belang, een afname van de ΔC _t geeft een verhoogde expressie van de dopamine neuron genen opzichte van β-actine als andere cellen (niet-dopaminerge neuronen en gliacellen) zullen worden verzameld in de ventrale tegmentum monsters die β-actine te uiten maar dopamine neuron genen niet uitdrukken.

Discussion

LCM is een techniek om de ontleding van discrete populaties van cellen of gebieden van weefsel van weefselcoupes op een microscoopglaasje en de daaropvolgende isolatie van RNA, microRNA, DNA en eiwitten. Het gebruik van LCM in combinatie met de analyse met behulp van high-throughput technologieën zoals microarray, next generation RNA sequencing, epigenetische analyse van DNA en proteomics wordt steeds vaker de gevoeligheid van deze technieken verhoogt de hoeveelheid uitgangsmateriaal nodig vermin- ^8-12. Met LCM, is een betere anatomische resolutie bereikt voor een monster, en het begrip van de downstream-maatregelen van deze monsters is sterk verbeterd. Een waarschuwing met LCM is dat het een geconcentreerd monster van de cellen van belang, maar niet noodzakelijkerwijze een zuivere populatie van cellen. De grenzen van de nauwkeurigheid betekenen dat er enige verontreiniging van aangrenzende weefsel wordt. Deze techniek concentreert wel de cellen van belangeffecten geassocieerd met omringende weefsels en cellen te minimaliseren en de experimentele effecten op de cellen van belang.

Directe versus indirecte Immunohistochemistry

Aangezien LCM momenteel voornamelijk gebruikt voor de isolatie en meting van RNA, waardoor RNA intact is een belangrijk criterium. Handhaving RNA integriteit de belangrijkste reden achter het gebruik van indirecte immunohistochemie weefsel dissectie waarbij de noodzaak om het weefsel direct vlekken die RNA afbreken verwijdert leiden (Figuur 10). Wanneer de experimentele vraag vereist echter isolatie van een specifieke populatie van cellen, zoals dopamine neuronen wordt direct fluorescent immunohistochemie vereist. Met een snelle immunohistochemische labeling protocol kan de afbraak van RNA minimaliseren tijdens de procedure. De korte incubatietijden zijn door het gebruik van hoge concentraties van primaire en secundaire antilichamen, concentraties die ongeveer 10-20 zijn hoger dan wat nodig is voor conventionele immunohistochemie met een 2 uur incubatie is folden. Wanneer echter langere incubatietijden vereist, Brown en Smith gebruikte hoge zoutbuffers om RNA afbraak te remmen en het verkrijgen van goede kwaliteit RNA met lange incubatietijden (tot 20 uur) ^13. Deze benadering kan ook worden gebruikt als er veel tijd nodig is tussen kenmerken van het weefsel en toegang krijgen tot een LCM systeem.

Keuze van dia's - PEN membraan, silaan-prep en ongecoate glaasjes

Het gebruik van ongecoate objectglaasjes voor LCM gemeld ^14. In ons laboratorium hebben Silane-prep dia's zijn gevonden om een ​​optimale keuze te zijn, aangezien deze coating voldoende hecht het weefsel om de glijbaan voor immunohistochemie zonder verlies van weefsel, maar nog steeds zorgt voor de bevestiging van het weefsel aan het LCM caps en verwijdering uit de dia . Ongecoate glaasjes hebbentoonde enkele weefsel verlies met de immunohistochemie procedure. Als indirecte immunohistochemie wordt gebruikt, echter weefselretentie wordt minder een probleem. Met de juiste uitdroging, het vastleggen van cellen of weefsels af van silaan-prep dia's heeft geen probleem geweest. Elk van de verschillende benaderingen voor het isoleren van neuronen of hersengebieden beschreven in dit document heeft voor- en nadelen. Voor isolatie van afzonderlijke dopamine neuronen, het gebruik van silaan-prep slides heeft het voordeel van een betere optiek en is minder duur dan de PEN membraan dia. Het nadeel is dat soms vastleggen cellen lastig kan zijn als er onvoldoende uitdroging (zie hieronder) en wat weefsel worden achtergelaten op de dia. Het voordeel van de PEN membranen slides is dat met de combinatie van de IR laser en UV laser waarborgt dat de dopamine neuronen worden verzameld. Niet-cellen van een PEN membraan slides verzamelen vrijwel nooit voorkomt, aangezien het minder afhankelijk uitdroging dan de glasplaatjes. Een Bijkomend voordeel is dat de UV laser kan worden gebruikt om dichter te benaderen de vorm van de neuronen plaats, vergeleken met een cirkel voor het vastleggen neuronen af ​​van objectglaasjes met de IR laser. Voor de isolatie van de regio's van het weefsel, de PEN membraan dia's zijn veruit superieur en de extra kosten te rechtvaardigen. Deze benadering levert volledige verwijdering van het weefsel uitgesneden op het membraan, is veel sneller dan het vastleggen van een groot gebied van weefsel door de IR laser staan ​​dikkere weefselcoupes kunnen worden verzameld. Met alleen de IR-laser vereist dat de LCM dop membraan volledig gesmolten is over het gehele weefsel gebied. Bovendien onvolledige verzameling van het weefsel is typisch en vereist gewoonlijk meerdere pogingen. Hoewel dit duurt langer dan isoleren weefsel van de PEN membraan dia als de beschikbare weefsel reeds op een glasplaatje of een UV laser niet beschikbaar is, is een haalbare optie omdat de meeste weefsel kan worden verzameld (figuur 8J).

ove_content "> Kritische stappen

100% ethanol incubaties zijn een van de belangrijkste stappen. Om cellen te verzamelen uit silaan-prep slides volledige dehydratie van het weefsel vereist. Daarom zal geen water verwijderd, die meestal geassocieerd wordt met 100% ethanol incubatie, het vermogen bezitten cellen van de objectglaasjes beïnvloeden. Om dit probleem aan te pakken, vaak veranderen de 100% ethanol oplossingen, omdat de absorptie van water uit de lucht of de transfer van voorgaande stappen wassen kan de uitdroging beïnvloeden. Daarnaast worden moleculaire zeven gebruikt om waterverontreiniging absorberen. Het LCM systeem moet idealiter worden gevestigd in een kleine kamer met een ontvochtiger te lage luchtvochtigheid te handhaven.

Goede cryostaatcoupes zijn cruciaal voor een goede LCM. Secties moet vlak zijn met vouwen in het weefsel geminimaliseerd. Plooien in het weefsel zal de afstand toenemen tussen de LCM dop en voorkomen dat het contact thij weefsel. Het wordt dan moeilijk Membraankap op het weefsel voldoende smelten. Voor glazen plaatjes, meestal sectie dikte moet zijn tussen de 6 en 12 micrometer. Dikkere secties kunnen worden vastgelegd met de PEN membraan glijbanen.

LCM biedt een technische capaciteit om zeer nauwkeurige dissecties van weefsels en cellen te maken uit de microscoop dia's. Dit verhoogt aanzienlijk de resolutie van verdere analyse vergeleken met grove dissectie van stukken weefsel. Hoewel LCM tijd en arbeidsintensief zijn, is het niet nodig uitgebreide training en deskundigheid en, wanneer gekoppeld aan andere high-throughput, kan sterk verbeteren van het begrip van een biologisch proces als afzonderlijke cellen of anatomische gebieden worden gebruikt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Veritas Laser Capture Microdissection System	Life Technologies, Grand Island, NY	Newer model is now sold
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0211
CapSure HS LCM Caps	Life Technologies, Grand Island, NY	LCM0213
PEN Membrane slides	Life Technologies, Grand Island, NY	s4651
Silane prep-slides	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S4651
95% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7148
100% Ethanol-RNase Free	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Rnase Free Triton	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8787
Molecular Sieve	EDM Millipore, Billerica, MA	MX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody	EDM Millipore, Billerica, MA	Ab152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies, Grand Island, NY	A-11008
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2939AA
Stratagene MX 3005P	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometer	Thermo Scientific
Quant-iT RiboGreen	Life Technologies, Grand Island, NY	R11490
RNaseZap	Life Technologies, Grand Island, NY	AM9780