Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

12.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

4 januari 2015

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Samenvatting

Vaste tumorweefsels zijn sterk betrokken bij het reguleren kankercelmigratie en invasie. Invasieve migratie door middel van cross-linked weefsels wordt vergemakkelijkt door actine-rijke uitsteeksels genaamd invadopodia dat proteolytisch degraderen de extracellulaire matrix (ECM). Invadopodia activiteit is aangetoond afhankelijk ECM stijfheid en kankercellijnen contractiele krachten suggereert dat stijfheid signalen die subcellulaire structuren kunnen reguleren door actomyosine contractiliteit te zijn. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen kan worden gecorreleerd in vitro gebruik invadopodia en trekkracht assays gebaseerd op polyacrylamidegelen (PTA) van verschillende rigiditeiten. Sommige verschillen tussen de twee tests bestaan, het protocol hier gepresenteerde een werkwijze voor het maken PAAs thbij kan in beide testen en gemakkelijk aanpasbaar aan specifieke biologische en technische behoeften van de gebruiker.

Inleiding

De stijfheid van het tumor geassocieerde ECM is geïdentificeerd als een belangrijke factor bij het ​​stimuleren maligne gedrag verhogen actomyosine contractiliteit 1-3. Hoewel dit effect voornamelijk aangetoond met borstkankercellen werd matrix stijfheid gebleken invasieve eigenschappen van cellen afkomstig van verschillende kankers 4-8 suggereert dat tumor stijfheid kan een rol spelen bij andere kankersoorten veranderen. Om verknoopte weefsels tijdens invasieve migratie dringen, kankercellen gebruiken actine-rijke lijm uitsteeksels bekend als invadopodia dat proteinases lokaal te maken focaal degraderen de ECM 9. Invadopodia worden beschouwd als een kenmerk van invasieve cellen en zijn betrokken bij tumorcel invasie en metastase 10,11. Vorige werk heeft aangetoond dat matrix stijfheid invadopodia nummers kunnen reguleren en bijbehorende ECM degradatie 4,12 door myosine II activiteit en mechanosensitieve eiwitten 12. Gezien decorrelatie tussen dichtheid en kanker tumor agressiviteit 13,14 suggereren deze resultaten een mechanisme waardoor kankercellen reageren stijve tumorweefsels invasie en metastase rijden door actomyosine contractiliteit.

In vitro ECM stijfheid en in vivo weefseldichtheid is aangetoond dat invasieve gedrag van kankercellen 1,15-17 reguleren. Terwijl actomyosine contractiliteit blijkt belangrijk te zijn in dit proces, bestaande studies conflict of metastatische capaciteit gecorreleerd verhoogde of verlaagde contractiele krachten 6,18-20. Bovendien is het nog onbekend of deze krachten rechtstreeks bemiddelen invadopodia activiteit 21. We ontdekten recent dat kankercel contractiele krachten waren afhankelijk van matrix stijfheid en waren voorspellend voor ECM afbraak door invadopodia 5. Deze resultaten suggereren dat cellulaire krachten een belangrijke rol in de progressie van kanker kunnen spelen door te bemiddelen invadopodia activiteit in reactie op de mechanische eigenschappen van de tumor micro-omgeving.

Om invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen 5 correleren, we aangepast een protocol voor het creëren van PTA's met verschillende rigiditeiten die eerder werd gebruikt om de stijfheid-afhankelijke invadopodia activiteit 4,12,22 onderzoeken. Door chemisch verknopen menselijk plasma fibronectine gehele PAAs, kunnen deze gemodificeerde hydrogelen worden gebruikt als basis voor zowel invadopodia en trekkracht testen om te waarborgen dat cellen ervoer dezelfde starre beide experimenten 5. In de invadopodia assays, de fibronectine zorgt voor een natuurlijke bindende domein voor gelatine om de overlay ECM koppelen aan de PTA's te matrixafbraak detecteren. In de trekkracht assays, de fibronectine verschaft een ligand voor directe cellulaire adhesie microsferen verplaatsingen gebruikt om cellulaire aandrijfkrachten berekenen detecteren. Deze methode resulteert in wat wij zacht, hard hebben genoemd,en stijf PTA's die zijn gebonden aan glazen bodem gerechten en hebben elasticiteitsmoduli, E, van 1.023, 7.307 en 22.692 Pa 5, die het bereik van de mechanische eigenschappen gemeld voor de normale en kankerweefsel 23 overspannen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de dekglaasjes voor PAAs

  1. Schone 12 mm dekglaasjes met pluisarme doekjes.
  2. Vlam de 12 mm dekglaasjes en de 14 mm dekglaasje in de microwell van elk 35 mm glazen bodem schaal door ze door vlam van een bunsenbrander met een pincet.
  3. Behandel de microputjes met 200 ui 0,1 N NaOH gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  4. Zuig en lucht drogen de microwells gedurende 30 min.
  5. Behandel de microputjes met 50-100 pl 3-aminopropyltrimethoxysilaan gedurende 10 min bij kamertemperatuur in de zuurkast. Dit chemisch reageert met kunststof; Gebruik daarom glaspipetten en niet de microputjes niet helemaal vol contact met het gerecht plastic vermijden.
  6. Was de microwells met ultrapuur water voor ongeveer 10 minuten totdat de 3-aminopropyltrimethoxysilaan duidelijk.
  7. Spoel de microwells met ultrapuur water twee keer met behulp van een knijpfles.
  8. Was de microwells met 2 ml ultrapuur water eent kamertemperatuur op een rocker ingesteld op een gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 10 min.
  9. Zuig en lucht drogen de microwells gedurende 30 min.
  10. Behandel de microputjes met 2 ml 0,5% glutaaraldehyde oplossing bij kamertemperatuur op een rocker ingesteld op een gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 30 min.
  11. Was de microputjes met 2 ml ultrazuiver water bij kamertemperatuur op een rocker ingesteld op gemiddelde snelheid (~ 1 Hz) gedurende 10 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 30 min.
  12. Droge microputjes een scherpe hoek (60 ° of meer) gedurende 30 min.
    Opmerking: Schotels worden opgeslagen gedurende 2 maanden in een exsiccator.

2. Voorbereiding van de PTA's voor Invadopodia Testen

  1. Voor een 1 ml oplossing van het zachte PAA (8% acrylamide en 0,05% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 25 pl 2% BIS en 574 gl ultrazuiver water (tabel 1).
  2. Voor een 1 ml oplossing van de vaste PAA (8% acrylamide en 0,35% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 175 & #181, l 2% BIS en 409 gl ultrazuiver water (tabel 1).
  3. Voor een 1 ml oplossing van het stijve PAA (12% acrylamide en 0,60% BIS), combineer 300 gl 40% acrylamide, 300 gl 2% BIS, en 169 pl ultrazuiver water (tabel 1).
  4. Ontgas de oplossing gedurende 15 min. Voeg 200, 215, en 230 pl van 1 mg / ml humaan plasma fibronectine in ultrazuiver water de zachte, harde en stijve PAA oplossingen resp. Voor alle oplossingen, voeg 1 ui 10 mg / ml acrylzuur N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, 5 ui van een 100 mg / ml ammoniumpersulfaat en 2 ui N, N, N ', N'-tetramethylethyleendiamine (TEMED ; Tabel 1). Meng met zachte pipetteren en voorkomen dat er luchtbellen in oplossingen.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Pl) 		2%
BIS
(Pl) 		Ultrapuur
Water
(Pl) 		1 mg / ml
FN
(Pl) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Pl) 		100 mg / ml
APS
(Pl)
TEMED
(Pl) 		Elastisch
Modulus
(Pa)
Zacht 200 25 574 200 1 5 2 1023
Hard 200 175 409 215 1 5 2 7307
Stijf 300 300 169 230 1 5 2 22692

Tabel 1: Ingrediënt volumes en resulterende elastische moduli voor zacht, hard en stijf PTA in de invadopodia assays. AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = ammoniumpersulfaat.

  1. Pipetteer 8.48 ul van de PAA-oplossing op het midden van elk microputje.
    Opmerking: Dit volume theorie levert een PAA 75 urn dik.
  2. Sluit voorzichtig de gevlamde zijde van 12 mm dekglaasje op de druppel in de microputjes met een pincet.
  3. Laat de kern PAA oplossing polymeriseren 15-30 min. Controleer polymerisatie door het controleren van de overgebleven oplossing.
  4. Voeg 2 ml 1x PBS om elk gerecht en verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet.
    Opmerking: 10x PBS wordt in het laboratorium en samengesteld uit 0,011 M KH 2PO 4, 1,54 M NaCl en 0,056 M Na 2 HPO 4.
  5. Was de microputjes met 2 ml 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.

3. Peerherstel van PTA's voor meer trekkracht Testen

  1. Voor een 1 ml oplossing van het zachte PAA (8% acrylamide en 0,05% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 25 pl 2% BIS en 566 gl ultrazuiver water (tabel 2).
  2. Voor een 1 ml oplossing van de vaste PAA (8% acrylamide en 0,35% BIS), combineer 200 ui 40% acrylamide, 175 gl 2% BIS en 401 gl ultrazuiver water (tabel 2).
  3. Voor een 1 ml oplossing van het stijve PAA (12% acrylamide en 0,60% BIS), combineer 300 gl 40% acrylamide, 300 gl 2% BIS, en 161 pl ultrazuiver water (tabel 2).
  4. Ontgas de oplossing gedurende 15 min. Voeg 200, 215, en 230 pl van 1 mg / ml humaan plasma fibronectine aan de zachte, harde en stijve PAA oplossingen resp. Ultrasone trillingen 8 pi 200 nm rode fluorescerende microbolletjes (excitatie / emissie van 580/605 nm) gedurende 30 sec. Voor elke oplossing, voeg 8 pi 200 nm rode fluorescerende microbolletjes,1 ui 10 mg / ml acrylzuur NHS ester, 5 ui van een 100 mg / ml ammoniumpersulfaat en 2 ui TEMED (tabel 2). Meng met zachte pipetteren en voorkomen dat er luchtbellen in oplossingen.

PAA
(1 ml) 		40%
AA
(Pl) 		2%
BIS
(Pl) 		Ultrapuur
Water
(Pl) 		1 mg / ml
FN
(Pl)
Micro-sferen
(Pl) 		10 mg / ml
NHS Ester
(Pl) 		100 mg / ml
APS
(Pl)
TEMED
(Pl) 		Elastisch
Modulus
(Pa)
Zacht 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Hard 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Stijf 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Tabel 2:. Volumes Ingrediënt en resulterende elastische moduli voor zacht, hard en stijf PTA in de trekkracht assays AA = acrylamide, FN = fibronectine, APS = ammoniumpersulfaat.

  1. Pipetteer 8.48 ul van de PAA-oplossing op het midden van elk microputje.
    Opmerking: Dit volume theorie levert een PAA 75 urn dik.
  2. Sluit voorzichtig de gevlamde zijde van the 12 mm dekglaasje op de druppel in de microputjes met een pincet.
  3. Laat de kern PAA oplossing polymeriseren 15-30 min. Controleer polymerisatie door het controleren van overgebleven oplossing.
  4. Voeg 2 ml 1x PBS om elk gerecht en verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet.
  5. Was de microputjes met 2 ml 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.

4. Voorbereiding van ECM voor Invadopodia Testen

  1. Verwarm de gelatine-oplossing (1% gelatine en 1% sucrose) tot 37 ° C.
  2. Behandel de PTA met 150 pi van de gelatine-oplossing gedurende 1 minuut vervolgens zorgvuldig aspireren van de bodem van de microputjes bij het vasthouden van de glazen bodem gerechten in een hoek van 45 °.
  3. Droog de resterende dunne laag van gelatine aan de PTA in de microputjes op een steile hoek (60 ° of meer) te optimaliseren drogen gedurende 60 min.
  4. Behandel de microputjes met 2 ml van een gekoelde 0,5% glutaaraldehyde oplossing ice 15 min gevolgd door kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Was de microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  6. Behandel de microputjes met 2 ml van een natriumboorhydride-oplossing gedurende 1 minuut. Tik voorzichtig gerechten op de bank te bellen die op het oppervlak van de gelatine vormen te verwijderen.
  7. Zuig en was de microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  8. Verdun een FITC-gemerkte menselijke plasma fibronectine oplossing van 50 ug / ml met 1x PBS en centrifugeer bij 175.000 xg bij 4 ° C gedurende 15 min. Ofwel koopt commercieel beschikbaar gelabeld fibronectine of het etiket het als volgt:
    1. Los 5 mg fibronectine in 10 ml boraatbuffer (170 mM natriummetaboraat-tetrahydraat en 40 mM NaCl) en plaats dialyse tubing.
    2. Label de fibronectine door het plaatsen van de buis in 200 ml boraatbuffer met 6 mg opgeloste FITC bij kamertemperatuur op een magnetische roerderingesteld op de laagste stand gedurende 1,5 uur in het donker.
    3. Dialyseren met 500 ml van een 1x PBS op een ingesteld op de laagste stand voor 3 dagen in een donkere koude kamer (4 ° C) met twee volume magneetroerder verandert per dag.
    4. Bereken FITC-gemerkte fibronectine concentratie gebaseerd op de optische dichtheid van monsters verdund (1: 200) bij 280 nm en 493 nm als [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 maal de verdunningsfactor van 200 maal 2 (waar de glycerol concentratie de fibronectine in de volgende stap) resulterend in mg / ml units.
    5. Dialyseren overnachting in een 50% glycerol oplossing op een ingesteld op de laagste stand overnachting in een donkere koude kamer bij 4 ° C magneetroerder.)
  9. Behandel de microputjes met 150 pi van de FITC-gelabelde fibronectine-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 60 min in het donker.
  10. Zuig het FITC gemerkte fibronectine oplossing uit de bodem van de microputjes voorzichtig bij het vasthouden van de glazen bodem gerechten45 ° en vul de glazen bodem gerechten met 70% ethanol oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een donkere celkweek kap voor sterilisatie. Vul ook glazen bodem schotel deksels of maak schoon met pluizen weinig doekjes gedrenkt in 70% ethanol.
  11. Was glazen bodem gerechten door ze te vullen met 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer met 2 ml 1x PBS gedurende in totaal 15 min.

5. Voorbereiding en beeldvorming van Invadopodia Testen

  1. Voeg 25,000 kankercellen in 2 ml invadopodia medium (1: 1 DMEM en RPMI 1640 met 5% eiwitarme serum, 10% foetaal runderserum en 20 ng / ml vers toegevoegde epidermale groeifactor) voor de glazen bodem gerechten incubeer overnacht.
  2. Zuig en behandel de microputjes met 2 ml van een 3,7% paraformaldehyde oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 20 minuten om de cellen te repareren.
  3. Na twee snelle wasbehandelingen met 2 ml 1x PBS, behandelen de microputjes met 2 ml van een 0,1% Triton X-100 oplossing bij kamer- tempetuur in het donker gedurende 5 minuten om de cellen te permeabiliseren.
  4. Na een snelle wassing met 2 ml 1x PBS, behandelen de microputjes met 3% bovine serum albumine blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 minuten om de cellen te blokkeren.
  5. Incubeer de microputjes met 150 pi van muizen anti-cortactin antilichaam (1: 750) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 min.
  6. Was microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  7. Incubeer de microputjes 150 ul geit anti-muis 633 antilichaam (1: 500) en 546 falloïdine (1: 750) in blokkerende oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 60 min.
  8. Was microputjes met 2 ml 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal twee keer voor een totaal van 15 min.
  9. Voeg zes druppels montage medium aan elke microwell vullen en dek af met 22 x 22 dekglaasjes.
  10. Afbeelding cortactine en actine te invadopodia te identificeren met behulp van excitatie en emissie filters van 632/647 nm en556/570 nm, respectievelijk, met behulp van een hoge NA, 40x olie-immersie lens op een breed veld omgekeerde microscoop. Op dezelfde afbeelding fibronectine aan ECM degradatie te identificeren met behulp van een excitatie en emissie-filter van 492/518 nm.

6. Voorbereiding en beeldvorming van Traction Force Testen

  1. Voeg 15.000 kankercellen in 2 ml invadopodia medium om de glazen bodem gerechten en incubeer overnacht.
  2. Zuig medium in de glazen bodem gerechten en vervangen door 2 ml L-15-medium met dezelfde aanvullingen (5% eiwitarme serum, 10% foetaal runderserum en 20 ng / ml vers toegevoegde epidermale groeifactor), pre -warmed tot 37 ° C.
  3. Incubeer de glazen bodem gerechten in een klimaatkamer bij een omgekeerde microscoop vooraf geëquilibreerd tot 37 ° C met een hoge vochtigheid gedurende 1 uur.
  4. Neem vier sets van beelden met een hoge NA, 40x lens op een breed veld omgekeerde microscoop met een geautomatiseerde podium om cellulaire posities te markeren:
    1. Afbeelding cellen aanp van de PTA's met behulp van fase contrast ("fase" image).
    2. Afbeelding fluorescerende microbolletjes met excitatie en emissie filters van 560/645 nm door zich net onder de cellen tot de eerste laag van microsferen aan de bovenkant van de PTA is scherpgesteld ("stress" beeld).
    3. Daarnaast richten op de bodem van de PTA (de microsferen markers) en maak een opname ("bottom" beeld). Opmerking: Het doel van dit beeld is de z-positie om de werkelijke PAA dikte krijgen op elke positie trekkracht berekeningen zoals beschreven in Representatieve resultaten opnemen.
    4. Na deze beelden zijn verworven op meerdere posities, meng in 220 ul van 10% Triton-X oplossing om cellen te verwijderen. Afbeelding microsferen bij de bovenkant van de PAAs op elke positie zoals eerder beschreven (het "nul").

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In de invadopodia assay worden invadopodia gewoonlijk geïdentificeerd door colocalization markers zoals actine en cortactin op puntvormige structuren in het cellichaam (figuur 1). Zowel actief afbrekende en niet-degraderende invadopodia kunnen worden geteld en gedifferentieerd of deze structuren colocalized met donkere gedeeltes zonder fluorescent signaal in de FITC-gelabelde fibronectine (figuur 1). Invadopodia worden handmatig geteld en ECM afbraak per cel wordt bepaald door het handm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een werkwijze voor het vervaardigen PTA die kunnen worden gebruikt als basis voor invadopodia en trekkracht assays invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren. Terwijl PTA zijn lang gebruikt om te kijken naar stijfheid effecten op cellen en bereken trekkrachten 18,24,27, dit protocol is de eerste parallelle assays op basis PTA dezelfde starheid ontwikkelen invasieve en contractiele cellulaire gedrag correleren reactie op matrix mechanische eigenschappen. Goed activeren van de dekglaa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award Aantal K25CA143412 (Parekh). We willen graag erkennen dat extra ondersteuning werd verleend door het ministerie van KNO. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Dankbetuigingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-AminopropyltrimethoxysilaanSigma-Aldrich281778
Acrylamide (40%)Bio-Rad161-0140
Acrylzuur NHS-esterSigma-AldrichA8060vers vers bereiden in afzuigkap 10 mg/ml in DMSO
Alexa Fluor 546 ftaloïdinLife TechnologiesA22283kan ook rodamine gebruiken
AmmoniumpersulfaatBio-Rad161-0700vers vers bereiden 10% oplossing in 1x PBS
Aqua Poly/MountPolysciences18606gebruik 6 druppels om microwells te vullen
BIS (2%)Bio-Rad161-0142
RundserumalbumineRPIA30075maak 3% voor blokkeringsoplossing in 1x PBS en bewaar bij 4 °C
Dekglasjes (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
DialysebuisSigma-AldrichD9777vooraf in evenwicht brengen in boraatbuffer gedurende 15 - 30 min
DMEMCellgro10-013-CVgebruik om invadopodia-medium te maken
DMSOSigma-AldrichD8418gebruik om acrylzuur NHS-esteroplossing te maken
Epidermale groeifactorLife TechnologiesPHG0311gebruik om invadopodia-medium te maken
EthanolPHARMCO-AAPERE200verdun met ultrapuur water tot 70%
FBSThermo ScientificSH30070.03gebruik om invadopodia-medium te maken
FITCSigma-AldrichF7250beschermen tegen licht
GelatinePolysciences00639maak typisch 10 ml van 1% sucrose/1% gelatineoplossing in PBS en bewaar bij 4 °C (verwarm PBS vooraf om gelatine gemakkelijk op te lossen)
Schotel met glazen bodem (35 mm dekglasjes)MatTekP35G-0-14-Cdekglasjes zijn ongecoat
Glutaraldehyde (25%)Polysciences01909verdun met 1x PBS tot 0,5%
Geit anti-muis Alexa Fluor 633-antilichaamLife TechnologiesA21050
Human plasma fibronectineLife Technologies33016-015voeg 5 ml ultrapuur water toe om 1 mg/ml te maken; opsplitsen in volumes op basis van gebruik om overmatige bevriezing en ontdooicycli te voorkomen
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-1gebruik om 10x PBS-voorraad te maken
Muis anti-cortactine 4F11-antilichaamEMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-1gebruik om 10x PBS-voorraad te maken
NaClRPIS23020gebruik om 10x PBS-voorraad en boraatbuffer te maken
NaOH (1 N)Sigma-AldrichS2770verdun met ultrapuur water tot 0,1 N
Nu-Serum (lage-eiwitserum)BD Biosciences355500gebruik om invadopodia-medium te maken
ParaformaldehydeAcros416785000maak typisch 10% voorraad in 1x PBS, bereid in afzuigkap en voeg een paar ml sterke NaOH toe om paraformaldehyde gemakkelijk op te lossen en breng vervolgens terug naar pH 7,4 met sterke HCl)
PBS (steriel)Cellgro21-040-CVgebruik voor celkweek
RPMI 1640Cellgro10-040-CVgebruik om invadopodia-medium te maken
NatriumborohydrideSigma-Aldrich452882vers vers bereiden in afzuigkap 1 mg/ml in 1x PBS
Natriummetaboraat tetrahydraatSigma-AldrichS0251gebruik om boraatbuffer te maken
SucroseRPIS24060maak typisch 10 ml van 1% sucrose/1% gelatineoplossing in PBS en bewaar bij 4 °C (verwarm PBS vooraf om gelatine gemakkelijk op te lossen)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA16046maak 10% voorraad in 1x PBS en gebruik zoals het is voor celverwijdering in tractiekrachtassay of verdun met 1x PBS voor kleuring

Referenties

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572(2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015(2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Invadopodia-assaysmigratie van kankercellenECM-stijfheidfluorescentiemicroscopieactivering van glazen dekglasjesfibronectine-coatingverplaatsing van microsferenhydrogel-dikte
Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.