Snelle identificatie van chemische Genetische Interacties in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Samenvatting

Hier presenteren we een kosteneffectieve methode voor het definiëren van chemisch-genetische interacties in knopgistende gist. De benadering is gebaseerd op fundamentele technieken in moleculaire biologie van gist en is zeer geschikt voor het mechanistische onderzoek van kleine tot middelgrote collecties chemicaliën en andere media-omgevingen.

Samenvatting

Het bepalen van het werkingsmechanisme van bioactieve stoffen is van belang om een breed scala van academische, farmaceutische en industriële wetenschappers. Saccharomyces cerevisiae, of gist is een modeleukaryoot waarvoor een complete collectie van ~ 6000 gendeletie mutanten en hypomorfe essentieel gen mutanten zijn commercieel verkrijgbaar. Deze verzamelingen van mutanten kan gebruikt worden om systematisch detecteren chemische geninteracties, dwz genen noodzakelijk een chemische tolereren. Deze gegevens zijn beurt verslagen over de waarschijnlijke werkingsmechanisme van de verbinding. Hier beschrijven we een protocol voor de snelle identificatie van chemische-genetische interacties in gist. We demonstreren de werkwijze met het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU), die een goed gedefinieerde werkingsmechanisme heeft. Onze resultaten tonen dat de nucleaire TRAMP exosome RNA en DNA repair enzymen zijn nodig voor proliferatie in de aanwezigheid van 5-FU, hetgeen in overeenstemming met eerdere microarray gebaseerd barcoderingssysteem chemische genetische benaderingen en de wetenschap dat 5-FU negatieve invloed op zowel RNA en DNA-metabolisme. De vereiste valideringsprotocols deze high-throughput schermen worden ook beschreven.

Inleiding

De genetische instrumenten en middelen die beschikbaar zijn in het model organisme Saccharomyces cerevisiae hebben grootschalige functionele genomica studies die gezamenlijk zorgen voor nieuw inzicht in hoe genen functioneren als netwerken om aan de eisen van biologische systemen voldoen ingeschakeld. De hoeksteen van deze tools was het collectief creëren van een complete set van niet-essentiële gendeleties van alle open reading frames in gist ^1,2. Een opvallende observatie was dat slechts ~ 20% gist genen vereist voor levensvatbaarheid wanneer gegroeid haploïden onder standaard laboratoriumomstandigheden. Dit wijst op het vermogen van een cel buffer tegen genomische verstoringen door het gebruik van alternatieve biologische routes. Genetische mutanten die levensvatbaar zijn individueel, maar dodelijk in combinatie, signaleren aangesloten of convergente parallel biologische pathways en vormen genetische interactie netwerken die biologische functie te beschrijven. Met de ontwikkeling van conditionele temperature-gevoelige en hypomorphic allelen van essentiële genen technologie is niet beperkt tot de studie van niet-essentiële genen ^3,4. Dit concept is toegepast op genomisch schaal produceren van een zuivere genetische interactie kaart illustreert hoe genen betrokken bij soortgelijke cellulaire processen cluster samen ^5.

Chemische verstoringen van genetische netwerken nabootsen gen deleties (figuur 1) ^6. Opvragen groeiremmende verbindingen tegen een array met hoge dichtheid van deletie stammen voor overgevoeligheid wordt een chemisch-genetische interactie profiel, bijvoorbeeld een lijst van genen die nodig is om chemische belasting verdragen. Zoals genetische interacties grote schermen van chemische bibliotheken hebben aangetoond dat verbindingen met een soortgelijk werkingsmechanisme cluster samen ^7. Daarom is door de oprichting van de chemische-genetische interactie profiel van een verbinding het werkingsmechanisme kan worden afgeleid door het te vergelijken met de LARge-schaal synthetische genetische en chemische genetische interactie datasets ^8,9.

Zijn op grote schaal chemische-genetische screens, waar scores van verbindingen worden ondervraagd, uitgevoerd door barcode competitie assays. In deze benadering wordt de gepoolde verzameling van deletie stammen gekweekt massaal meerdere generaties in een kleine hoeveelheid medium met een chemische stof. Aangezien elke deletie mutant herbergt een unieke genetische barcode, wordt de levensvatbaarheid / groei van individuele mutanten binnen de pool van deletiestammen bijgehouden door microarray of high-throughput sequencing ^10.

Afleiden van fitness door het monitoren kolonie grootte van fysiek gekleed mutanten gegroeid op vaste agar dat een bioactieve verbinding is ook een effectieve methode om de chemische-genetische interacties ^11,12 identificeren. Deze benadering verschaft een kosteneffectief alternatief voor concurrentie gebaseerde screening en is zeer geschikt voor het testen van kleine bibliotheken van chemische stoffen.Hier geschetst is een eenvoudige methode voor het produceren van een lijst van chemisch-genetische interacties in S. cerevisiae die niet afhankelijk moleculaire biologie manipulaties of infrastructuur. Het vereist slechts een gist deletie verzameling, een robot of handmatig pinning apparaten en vrij beschikbare beeldanalyse software.

Protocol

OPMERKING: De algemene werkstroom van deze procedure is beschreven in figuur 2.

1. Vaststelling van groei-remmende dosis

1. Voorbereiding van gist overnacht cultuur
   OPMERKING: De gist-extract-pepton-dextrose groeimedia (YEPD) gebruikt in dit protocol is een standaard recept ^13.
   1. Streak uit BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) cellen op een YEPD agar plaat en incubeer gedurende 48 uur bij 30 ° C of tot zichtbare kolonies vormen.
   2. Bereid nachts culturen door het enten van 5 ml YEPD vloeibare media in een steriele cultuur schip met een enkele kolonie. Incubeer overnacht bij 30 ° C onder voortdurend draaien of schudden. De cultuur wordt gewoonlijk bereikt verzadiging van de ochtend (~ 2 x 10 ⁸ cellen / ml).
2. Solid agarmedia preparaat met wisselende chemische doses
   1. Bereid een aantal voorradende chemische stof worden getest bij 100x gewenste eindconcentratie in een geschikt oplosmiddel.
      OPMERKING: Effectieve concentraties hangt af van de chemische en moet empirisch worden bepaald. Het is daarom aan te raden om eerst te testen een breed uiteindelijke concentratie range; dat wil zeggen, van laag uM tot hoge mM.
   2. Voor elke concentratie van de chemische stof te testen monster 3 ml gesmolten YEPD agar een enkele steriele cultuur buis. Plaats in de 55 ° C waterbad te houden van het stollen.
   3. Voor elke concentratie van de chemische stof te testen voeg 30 ul van de 100x verbinding gesmolten media, vortex 2-3 seconden mengen en pipet 1 ml in elk paar duplo putjes in een 12-wells plaat. Zorg ervoor dat u een voertuig behoren alleen controle. Laat platen een nacht op kamertemperatuur is gebracht. Gooi alle extra media.
3. Spread plating cellen
   1. Inoculeer 10 ml YEPD vloeibare media met 2 pi van een verzadigde gistcultuur, overnacht gekweekt zoals in stap 1.1.2.
   2. Plaat 25 ul van de verwaterde gistcultuur per well, gelijkmatig verdelen met behulp van steriele glazen kralen of staaf, en laat de plaat te drogen onder een vlam. Incubeer plaat bij 30 ° C gedurende 48 uur.
   3. Evalueer de groei van gist (zowel totaal aantal en grootte van de kolonies) op de platen. Selecteer een sub-letale concentratie van de verbinding die geen groei remt met meer dan 10% -15% aan het scherm worden.

2. Systematische Chemische genetische screen

1. Onderhoud van deletie-mutant-array (DMA) en Voorbereiding Bron Plaat van
   1. Voor een gedetailleerde beschrijving op de aanleg van deletie mutant arrays uit glycerol voorraden verwijzen wij u naar Baryshnikova et al. ^14. Zodra deletiemutanten werden bekleed met een dichtheid van 384 kolonies per plaat, kan de DMA worden enkele maanden opgeslagen bij 4 ° C. Repliceren op YEPD agar die 200 ug / ml G418 nodig om kolonies voorkomen groeien in elkandere.
      OPMERKING: meerdere seriële replicaties moet worden vermeden om verlies van langzaam groeiende stammen voorkomen en minimaliseren van de verschijning van suppressor mutanten. Dit is met name relevant als het behoud van de collecties als haploiden.
   2. Voer alle replica-plating stappen met behulp van een microbiële arraying robotsysteem. Als alternatief, te manipuleren getooid kolonies met behulp van handmatige pinning gereedschappen.
      OPMERKING: De gist deletie collectie is verkrijgbaar haploïden en diploïde van verschillende commerciële bronnen en wordt gewoonlijk geleverd als glycerol voorraden in 96-well platen.
2. Condenseren van de deletie mutant-array
   1. Maak 250 ml YEPD agar medium dat 200 ug / ml G418. De effectieve concentratie van G418 kan variëren en elke partij moet empirisch worden getest.
   2. Bereid vijf YEPD agarplaten door gieten 50 ml YEPD agar die 200 ug / ml G418 per plaat. Doe dit een dag voor het condenseren van de array en laat de platen afkoelen bij kamertemperatuurerature overnachting op een plat vlak oppervlak.
      OPMERKING: Vier platen nodig zal zijn voor de collectie van 1536-stam dichtheid, is de vijfde plaat gegoten als een extra.
   3. Verwijder de 16 platen met de deletie mutant collectie bij een dichtheid van 384 kolonies per plaat en de kamertemperatuur (~ 1 uur) komen.
   4. Veeg condens die gevormd op het deksel van elke plaat met een delicate taak vegen. Als u dit niet doet, kunnen er waterdruppels worden afgezet op de array en kruisbesmetting van gekleed mutanten.
   5. Met behulp van een microbiële scala pinning robot, condenseren de DMA uit een dichtheid van 384 kolonies per plaat (16 petrischaaltjes) tot 1536 kolonies per plaat (4 petrischaaltjes). Voer deze zodat de 1 ^ste kolonie plaat 1 kunnen tot 1 kolom 1 van de gecondenseerde matrix rij, de ^1e kolonie plaat 2 tot 1 kolom 2, de ^1e kolonie plaat 3 naar rij 2 en kolom 1, rij, en ^de 1 ^ste kolonie plaat 4 tot rij 2kolom 2.
   6. Incubeer de geconsolideerde matrix bij 30 ° C geïncubeerd.
   7. Onderzoek de array om uniforme overdracht van kolonies van bron platen zorgen. Er zullen verschillende lege posities, met opzet in de matrix opgenomen, die als leidraad dienen om ervoor te zorgen de DMA is gecondenseerd correct (figuur 4A).
      Opmerking: Dit zijn de bron platen voor replica plating op medium met de testverbinding. Een enkele bron plaat kan worden gebruikt voor meerdere pinnings. Ook veel robots zullen hebben een compenserende functie, die zal zorgen voor vergelijkbare aantallen van gist worden telkens overgedragen.
3. Replica plaat deletie mutant-array
   1. Bereid 700 ml controle (voertuig alleen) en 700 ml van experimentele media (-chemische stof). Dit is voldoende voor het uitvoeren van de assay in drievoud (12 platen per toestand, plus twee extra).
   2. Giet 50 ml YEPD agar met teststof of de controle per plaat. Laat de platen to afkoelen bij kamertemperatuur op een vlak en gelijkmatig oppervlak.
   3. De robot replica plaat beënt de DMA op drie sets van platen met chemicaliën de experimenteel bepaalde concentratie, en drie sets van platen met de dragercontrole. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 24-48 uur.

3. Imaging Platen en Data Analyse

1. Verwijder platen uit incubator en laat ze op kamertemperatuur (~ 1 uur) voorafgaand aan de beeldvorming te komen. Dit voorkomt condensvorming, terwijl de beeldvorming van de platen.
2. Afbeelding platen bij 24 en 48 uur door het verwijderen van het deksel en het gezicht naar beneden op een flat bed scanner. Maak foto's met een resolutie van minimaal 300 dpi. U kunt ook gebruik maken van een digitale camera om beelden vast te leggen. Als dit te doen, plaats platen open op een donkere achtergrond en verwijder de deksels op de foto.
   OPMERKING: De bestandsformaat en positionering van de platen zal afhangen van de kwantificering gebruikte programma.
3. Voeren kwantificering en vergelijking van array-kolonie maten met behulp van een van de verschillende open source-programma's, waaronder Balony ^15, SGAtools ^16, en ScreenMill ^17.

4. Validatie van het Scherm

OPMERKING: In dit stadium meerdere gist schrappingen mutanten als overgevoelig zijn voor de chemische belangstelling zal scoren. Deze chemische-genetische interacties Vervolgens moet worden gevalideerd op twee manieren. Eerst de identiteit van gevoelige stammen moeten worden bevestigd door PCR. Ten tweede moeten chemische gevoeligheid onafhankelijk worden gescoord. Hieronder volgt een overzicht is een kort protocol voor het uitvoeren van het spotten van assays om spanning overgevoeligheid, een techniek die veel voor in gist biologie valideren.

1. Streak uit gewenste (overgevoelig) mutanten uit de gist verwijdering collectie op YEPD agar met 200 ug / ml G418. Incubeer bij 30 ° C tot kolonies vormen. Controleer het genotype van de stam met diagnostische PCR met primers volgensprotocol van de fabrikant.
2. Inoculeer 5 ml YEPD vloeistof voor elke stam en incubeer overnacht bij 30 ° C met rotatie of schudden.
3. Meet OD ₆₀₀ en vul elke stam aan OD ₆₀₀ = 1 in steriele dH ₂ O. Dit zijn nu de genormaliseerde gistkweken.
4. Breng 100 pi van genormaliseerde wild-type gist (BY4741) cultuur en A1 van een 96-wells plaat. Doseer 100 ul van maximaal zeven extra onder druk te putten B1-H1.
5. Gebruik een multichannel pipet 90 ul steriele dH ₂ O afzien putjes A2-H2 door A6-H6. Tot slot, bereiden een reeks van 1:10 verdunningen van genormaliseerde gistculturen. Begin met serieel pipetteren 10 pl kolom 1 tot kolom 2 met een multichannel pipet, en verder over de 96-well plaat tot zes verdunningen gemaakt (bijvoorbeeld, 10 ⁰ tot 10 ^-5).
6. Transfer 2-5 pi van verdunde gist culturen in een raster met een multichannelpipet op YEPD vaste media die chemische en controle over het voertuig. Incubeer de platen bij de geschikte temperatuur gedurende 24-48 uur.
7. Inspecteer platen en vergelijkt de gevoeligheid van geselecteerde mutanten chemische (ten opzichte BY4741 controle). Afbeelding platen 24 en 48 uur zoals in stap 3.2.
   OPMERKING: Terwijl de identificatie van verschillende overgevoelig stammen met bijbehorende gen ontologieën of functies leent het vertrouwen om de geldigheid van het scherm, transformatie van een overgevoelig verwijdering stam met een plasmide met een wild-type kopie van het gen is vereist om formeel vast te stellen dat een gen verwijdering van belang (en niet verborgen tweede plaats mutaties) veroorzaakt drug gevoeligheid.

Resultaten

Als validatie van deze benadering hebben we een representatieve chemische genetische interactie scherm van het chemotherapeutische middel 5-fluorouracil (5-FU) na bovengenoemde protocol. 5-FU is bekend thymidylaatsynthase en DNA- en RNA-metabolisme ¹⁸ verstoren. De chemische genetische interacties van 5-FU zijn goed bestudeerd en zijn onderzocht door gist barcode microarray-technieken met behulp van zowel heterozygote en homozygote deletie collecties ^8,19. Hier laten we zien dat soortgelijke result...

Discussie

Hier geschetst is een aanpak voor het genereren van chemisch-genetische interactie profielen. De werkwijze is eenvoudig: bij het vergelijken kolonie groottes van elke stam in uitgebreide gendeletie collecties in de aanwezigheid en afwezigheid van een chemische stof, worden alle genen nodig om een ​​chemische insult tolereren geïdentificeerd. Annotatie verrijking analyse van de resulterende lijst van gevoelige stammen kunnen vervolgens worden gebruikt om inzicht in een chemische werkingswijze. Hoewel dit protocol is geop...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gist Extract	BioBasic	G0961	Voor YEPD vloeibaar/vast media tot 1% eindconcentratie (w/v) toevoegen
Tyrptone Poeder	BD Biosciences	211820	Voor YEPD vloeibaar/vast media tot 2% eindconcentratie (w/v) toevoegen
Dextrose	Anachemia	31096-380	Voor YEPD vloeibaar/vast media tot 2% eindconcentratie (w/v) — niet autoclaveren. Bereid 20% stockoplossing, filter steriliseren, en voeg toe aan media na autoclavering.
Agar A	Bio Basic	FB0010	Voor YEPD vast media tot 2% eindconcentratie (w/v) toevoegen
G418	A.G. Scientific Inc.	G-1033	Bereid 1.000x stock bij 200 mg/ml in dH2O en filter steriliseren.
12-well plate	Greiner Bio One	655180
5 ml kweekbuisjes	Evergreen Scientific	222-2376-080
10 cm Petri Dish	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments	ROT-001	high-throughput microbiële array pinning robot
PLUSPLATE© Petri Dish	Singer Instruments	PLU-001	Doos van 200 schalen
384 Short-Pin RePad	Singer Instruments	RP-MP-384	Doos van 1.000 pads
1536 Short-Pin RePad	Singer Instruments	RP-MP-1536	Doos van 1.000 pads
Alternatieve Pinning Tools:
Volledig Geautomatiseerde Robtische Systemen	S&P robotics	http://www.sprobotics.com	Verschillende geautomatiseerde kolonie-afhandeling robtische en imagineringssystemen beschikbaar.
Handmatige Pinning Tools	V&P Scientific	http://www.vp-scientific.com	Handbediende replicatietools en accessoires.