Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in Escherichia coli

Summary

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Abstract

De productie van recombinante membraaneiwitten voor structurele en functionele studies blijft technisch uitdagend te wijten aan lage niveaus van expressie en de inherente instabiliteit van vele membraaneiwitten eenmaal opgelost in wasmiddelen. Een protocol wordt beschreven dat ligatie onafhankelijke klonen van membraaneiwitten zoals GFP fusies met expressie in Escherichia coli gedetecteerd door GFP fluorescentie combineert. Dit maakt de constructie en expressie screening van meervoudige membraaneiwit / varianten om geschikte kandidaten voor verdere investering van tijd en moeite te identificeren. Het GFP reporter wordt gebruikt in een primaire screening van expressie door visualiseren GFP fluorescentie na SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). Membraaneiwitten die zowel een hoog expressieniveau met minimale degradatie zien zoals aangegeven door de afwezigheid van vrije GFP, worden geselecteerd voor een tweede scherm. Deze constructen worden geschaald en totaal membraanfractie bereid en solubiliserend vier verschillende detergentia. Volgende ultracentrifuge aan detergent-onoplosbaar materiaal te verwijderen, worden lysaten geanalyseerd met behulp van fluorescentie detectie size exclusion chromatografie (FSEC). Toezicht op de omvang uitsluiting profiel van GFP fluorescentie geeft informatie over de mono-dispersiteitsindex en integriteit van het membraan proteïnen in verschillende reinigingsmiddelen. Eiwit: detergent combinaties die elueren met een symmetrische piek met weinig of geen vrije GFP en minimale aggregatie kandidaat voor verdere zuivering. Met behulp van de bovenstaande methode, de heterologe expressie in E. coli van SED (shape, rek, delen en sporulatie) eiwitten van 47 verschillende soorten bacteriën werd geanalyseerd. Deze eiwitten hebben doorgaans tien transmembraandomeinen en zijn essentieel voor celdeling. De resultaten tonen aan dat de productie van de SED orthologen in E. coli was zeer variabel met betrekking tot de expressieniveaus en de integriteit van de GFP fusie-eiwitten. Het experiment identified een subset voor verder onderzoek.

Introduction

Er wordt geschat dat membraaneiwitten vertegenwoordigen ongeveer 20-30% van de genen gecodeerde alle gesequenced genomen ^1, inclusief het menselijk genoom ^2. Gezien hun cruciale rol in vele biologische processen, bijvoorbeeld transport van metabolieten, energieopwekking en als drug targets, is er intense belangstelling voor het bepalen van hun driedimensionale structuur. Maar in vergelijking met oplosbare eiwitten, membraaneiwitten zijn sterk ondervertegenwoordigd in de Protein Data Bank. In feite, van de 99.624 vrijgegeven structuren in het VOB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) slechts 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) worden geclassificeerd als membraaneiwitten. Dit weerspiegelt de technische problemen van het werken met membraaneiwitten die natuurlijk worden uitgedrukt relatief laag; rhodopsin is een van de weinige uitzonderingen ^3,4. Over-expressie van recombinant versies in heterologe cellen resulteert vaak in misfolding en slechte targeting naar het membraan dat het algehele niveau van de productie beperkt. Het selecteren van de beste wasmiddel voor extractie en oplossen van een membraaneiwit eens uitgedrukt maakt daaropvolgende zuivering moeilijk en vereist een zorgvuldige optimalisatie.

Escherichia coli blijft de meest gebruikte expressie gastheer voor membraaneiwitten goed voor 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) structuren opgelost hoogte die bijna uitsluitend zijn uit bacteriële bronnen. Specifieke E. zijn geïsoleerd zijn coli, C41 (DE3) en C43 (DE3), die niet tot de overexpressie van membraaneiwitten en daarmee de effecten van toxiciteit waargenomen voor andere stammen BL21 ^5,6 vermijden. Afstemmen het niveau van recombinant membraan eiwitexpressie blijkt cruciaal voor het optimaliseren van het productieniveau ^6,7 te zijn.

Vaak succesvolle productie van membraaneiwitten voor structuurbepaling heeft de evaluatie van meerdere versies zoals amino- en carboxy-eindstandige deleties, verschillende orthologen natuurlijke sequentie variatie en verschillende fusieproteïnen ^6-8 benutten vereist. Derhalve is een werkwijze voor de expressie screenen van meerdere membraaneiwitten parallel essentieel. Een algemeen gebruikte benadering is het eiwit groen fluorescerend eiwit (GFP) expressie mogelijk gefixeerd worden gevolgd zonder dat het eiwit te zuiveren. Op deze manier kan informatie over de expressie niveau, stabiliteit en het gedrag in verschillende reinigingsmiddelen worden beoordeeld met kleine hoeveelheden-un gezuiverd materiaal ^9-12.

In dit artikel beschrijven we een gestroomlijnde protocol voor klonering en expressie screening van membraaneiwitten in E. coli met behulp van fusie aan GFP als verslaggever van de productie en de daaropvolgende karakterisering van wasmiddel: eiwit compinglexes (Figuur 1).

Protocol

1. Bouw van Expression Vectoren

1. Met PCR Infusion klonen te bouwen tot 96 expressieplasmiden parallel met de vectoren pOPINE-3C-GFP en Popin-N-GFP die ofwel splitsbare C-eindstandige of N-eindstandige His6-GFP-fusies aan respectievelijk de sequenties ^13.
   Opmerking: De keuze van de vector wordt bepaald door de topologie van het eiwit, aangezien het GFP uitgedrukt moet worden in het cytosol, waardoor voor een eiwit met een cytosolisch N-terminus en C-terminus extracellulair we Popin-N-GFP en gebruik een extracellulair N-terminus en cytosolische C-terminus we pOPINE-3C-GFP zou gebruiken. Indien beide uiteinden zijn cytosolische zouden we pOPINE-3C-GFP gebruikt tenzij er functioneel reden de C-terminus niet te taggen.
2. Amplify het DNA die coderen voor de membraaneiwitten met primers waarin de volgende extensies getoond:
   pOPINE-3C-GFP (Forward primer - AGGAGATATACCATG; Reverse primer - CAGAACTTCCAGTTT) en Popin-N-GFP (Forward primer - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; Reverse primer - ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
3. Analyseer de PCR reactie met agarosegelelektroforese. Eenmaal schoon PCR-producten zijn verkregen, voeg 5 U DpnI aan elk putje (make-up in 5 pi 1x DpnI reactie buffer). Zuiveren de PCR producten met behulp van magnetische korrels in een 96-putjes.
   Opmerking: DpnI wordt toegevoegd aan het template vector te verwijderen; Deze stap is niet nodig als genomisch DNA als matrijs.
4. Voeg 1 pl (100 ng) van de desbetreffende gelineariseerde vector aan elk putje van een PCR-plaat.
5. Met een multichannel pipet add x pi gezuiverde PCR voegen aan de geschikte putjes van de PCR-plaat. Zorg ervoor dat alle producten zijn in het bereik van 10-250 ng.
6. Voeg (9 x) gl water naar de put en breng het geheel 10 ul van een buis met het droge-in-wording reagens. Laat gedurende 30 sec.
7. Meng de inhoud kort door en neer te pipetteren. OverdrachtDe reacties terug naar de oorspronkelijke PCR-plaat en verzegeling.
8. Incubeer gedurende 30 minuten bij 42 ° C in een thermocycler.
9. De reacties onmiddellijk aan ijs zodra de reactie voltooid en voeg 40 ui TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
10. Freeze tegelijk of veranderen in competente cellen. Voor transformatie, gebruiken 3 ul van de verdunde reactie per 50 ul monster van hoge competentie (> 5 x 10 ⁹ transformanten / ug) competente E. coli-cellen.
11. Voeg 1 ml LB-agar aangevuld met 50 ug / ml carbenicilline per putje van een 24-well weefselkweek plaat (voor het klonen, bereiden putten voor 2 x aantal constructies).
12. Na uitgroei Na uitgroei plaat uit 25 ul en 25 ul van een 1 op 5 verdunning van de kweek op de agar met 24-putjes weefselkweekplaten.
13. Verdeel de cellen door voorzichtig kantelen van de plaat.
14. Droog de plaat met het deksel gedurende 10-15 min bij 37 ° C of in een flow kap bij kamertemperatuur.
15. Plaats het deksel en draai de plaat ondersteboven en incubeer overnacht bij 37 ° C.
16. Kies twee kolonies en mini-prep de vectoren.
17. PCR controleren de constructen met behulp van het construct specifieke reverse primer en een vector specifieke forward primer (bv pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Transformatie van E. coli E Xpression Stammen

Opmerking: Voorafgaand aan de uitvoering van dit protocol, E. coli competente cellen worden gemaakt, aliquotted en bevroren opgeslagen bij -80 ° C zoals eerder ¹³ beschreven. Membraaneiwit expressie wordt routinematig gescreend in twee stammen, Lemo21 (DE3) en C41 (DE3) pLysS. Om te helpen interpretatie van de resultaten kan nuttig zijn om een positieve controle, bijvoorbeeld een plasmide dat GFP of een membraaneiwit gefuseerd aan GFP bekend te drukken en een lege vector negatieve controle wordt geregistreerd.

1. Ontdooi de aliquotted E. coli op ijs. Voeg 3 pi-mini klaargestoomd expressieplasmide aan elk monster van competente cellen.
2. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 30 min.
3. Heat-shock van de cellen gedurende 30 seconden bij 42 ° C.
4. Laat cellen om te herstellen op ijs gedurende 2 minuten en voeg vervolgens 300 ul van de macht bouillon aan elke buis.
5. Incubeer gedurende 1 uur in een 37 ° C incubator statisch.
6. Bereid de LB agar in een 24-well weefselkweek platen, aangevuld met 50 ug / ml carbenicilline en 35 ug / ml chlooramfenicol. Rhamnose Naar een eindconcentratie van 0,25 mM aan de putjes bevattende Lemo21 (DE3).
   Opmerking: Als het product waarschijnlijk toxisch de putjes met C41 is (DE3) pLysS kan worden aangevuld met 1% (w / v) glucose.
7. Overdracht 30 ul van cellen van het transformatiemengsel op LB agarplaten. Verspreiden en droog de plaat zoals beschreven in 1,13-1,15.

3. Voorbereiding van Overnight startculturen

Opmerking: bereiden Altijd overnachtcultures de dag na transformatie nooit meer iets van een oude transformatie plaat.

1. Voeg 0,7 ml vermogen bouillon aan elk putje van een 96-well deep-well plaat, aangevuld met 50 ug / ml carbenicilline en 35 ug / ml chlooramfenicol. Rhamnose aan de putjes bevattende Lemo21 (DE3) Voeg aan een eindconcentratie van 0,25 mM. Eventueel aanvullen C41 (DE3) pLysS met 1% (w / v) glucose; zie hierboven (2.6 noot).
2. Kies er een kolonie van de nachtelijke transformatie platen in elk putje. Dicht de blok met een gas-permeabel afdichting.
3. Schud het blok bij 250 rpm in een incubator met een grote afstand (bijvoorbeeld 25 mm baan) of bij 600 rpm in een incubator met een kleine afstand (bijvoorbeeld een 4,3 mm baan) bij 37 ° C geïncubeerd.

4. Groei en Inductie van Culturen

1. 3 ml vermogen bouillon aangevuld met 50 ug / ml carbenicilline en 35 ug / ml chlooramfenicol elke well van 24 goed deep-well plaat. Voeg L-rhamnose (en glucose), zoals beschreven in paragraaf 3.1. Gebruik 3 ml van cultuur aan het oogsten in tweevoud toe te staan ​​en te laten voor enige verdamping van water door de zuurstofdoorlatende afdichting.
2. Stel de expressie culturen door toevoeging van 150 ui van Lemo21 (DE3) of C41 (DE3) pLysS overnachtcultures aan elk putje van de 24-well deep-well blokken.
3. Schud de blokken bij 37 ° C totdat de gemiddelde OD bij 595 nm ~ 0.5 door de plaat.
4. Laten expressie door toevoeging van IPTG aan de cultuur tot een eindconcentratie van 1,0 mM IPTG.
5. Groeien de kweken overnacht (18-20 uur) onder schudden bij 20 ° C.

5. Analyse van Expressie door In-gel Fluorescentie

1. Oogst in tweevoud. Breng 1 ml van de cultuur van elk putje in een vierkant goed, conische bodem, 96-wells diepe en blok.
   Opmerking: Oogst in tweevoud in geval van breuk van het blok of het testen van wisselspanning mogelijkve detergent indien gewenst.
2. Verzegel de blokken en oogst de cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min.
3. Keer de blok en giet de media. Tik op het blok zachtjes op een papieren handdoek om de resterende media uitlekken.
4. Dicht de platen en bewaar bij -80 ° C gedurende ten minste 20 min. Optioneel, laat het experiment op dit punt en de verwerkte wanneer het u uitkomt blok.
5. De-vorst de pellets gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
6. Gebruik of een meerkanaals pipet of een rondschudapparaat (1000 rpm gedurende 10 minuten) bij 4 ° C om de cellen volledig resuspenderen in 200 pi lysisbuffer (50 mM NaH _{2PO 4,} 300 mM NaCl 10 mM imidazool 1% v / v Tween 20, breng de pH op 8,0 met behulp van NaOH).
7. Voeg 20 ul van de DLPI oplossing (20 pl DNaseI (4000 eenheden / ml), 20 mg lysozym en 20 pl proteaseremmer cocktail in een eindvolume van 2 ml water). Incubeer gedurende 10 min onder schudden (~ 1000 rpm) bij 4 ° C.
8. Voeg 25 ui 10% n -Dodecyl β-D-maltoside (DDM).
9. Incubeer gedurende 60 min onder schudden (~ 1000 rpm) bij 4 ° C.
10. Centrifugeer de deep-well blok 6000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
11. Breng 10 pl van het lysaat geklaard een microtiterplaat en voeg 10 ul SDS PAGE gel laadbuffer (100 mM Tris, pH 6.8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v broomfenolblauw, 10% v / v β mercapto-ethanol en 20% v / v glycerol). LET OP! Laat niet koken het monster.
12. Plaats 10 gl monster uit stap 5.11 / putje op SDS-PAGE gel (en) en draaien bij 100-120 V (constant voltage) in een koude kamer tot het kleurstoffront de bodem (2-2.5 uur) bereikt.
13. Plaats de gel op een imager (bv met een blauw-licht filter om de GFP fusie-eiwitten te detecteren). De belichtingstijd wordt gekozen dat de helderste banden niet verzadigd.

6. Schaal-up van Cell Cultures

1. Transformeer een portie van bevoegde E. coli zoals beschreven in hoofdstuk 2.
2. Kies een kolonie in 10 ml van de macht bouillon (aangevuld zoals beschreven in paragraaf 3) en groeien de nacht bij 37 ° C.
3. Verdun 5 ml van de kweek van een nacht in 500 ml macht bouillon.
4. Groei met schudden bij 250 rpm bij 37 ° C totdat de OD bij 595 nm ~ 0.5.
5. Laten expressie door toevoeging van IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 1,0 mM.
6. Groei overnacht onder schudden bij 250 rpm bij 20 ° C.
7. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5000 xg gedurende 15 min.
8. Discard supernatant. Celpellets worden opgeslagen bij -80 ° C.

7. Bereiding van Membranen

1. Ontdooi cellen (indien nodig) bij kamertemperatuur en resuspendeer in 1x PBS pH 7,5 bij een volume van 5 ml per gram celpellet; Verhoog het volume zo nodig tot de viscositeit reduceert tot een loopneus consistentie. Voeg _MgCl2 tot een eindconcentratie van 1 mM, DNAse I tot een eindconcentratie van 10 ug / ml en eenvoorverpakte proteaseremmer tablet per 20 g cel pellet. Openbreken cellen met behulp van een gekoelde cel disrupter bij een druk van 30 kpsi.
2. Pellet de ongebroken cellen en resten bij 30.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Transfer supernatans naar een ultra-centrifugeren buis.
3. Verzamel de totale membraanfractie door te stoppen met draaien het supernatant in een ultra-centrifuge bij 200.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C.
4. Verwijder het supernatant.
5. Re-schorten de membraan pellet in ijskoude 10 ml PBS pH 7,5 met behulp van een mobiele homogenisator. 1 ml geresuspendeerd membranen voor elke wasmiddel. Eventueel in dit stadium flash invriezen membraan suspensie in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C.

8. Oplossen en Analyse van de membraanfractie

1. Ontdooi membraanfractie (indien nodig) en voor elk wasmiddel wordt gebruikt voor solubilisatie monster 900 ul van de membraansuspensie in een 1,5 ml polyallomer micro-centrifugalege buis.
2. Voeg 100 pi van elke vers bereide detergens (10% w / v oplossingen van DDM, DM, cymal-6 en LDAO) tot een eindconcentratie van 1% aan de opgegeven 1,5 ml buis. Voor solubilisatie van eukaryote membraaneiwitten cholesterolhemisuccinaat (0,2% eindconcentratie) kunnen worden toegevoegd aan de detergentia.
3. Incubeer het mengsel bij 4 ° C gedurende 1 uur onder zacht roeren.
4. Pellet de detergent oplosbare fractie met een werkblad ultra-centrifuge, zodat buizen ten minste halfvol, bij 150.000 g bij 4 ° C gedurende 45 min en behouden supernatant.
   Opmerking: De effectiviteit wasmiddel solubilisatie kan worden geschat met een fluorescente plaatlezer door meting van de GFP fluorescentie van de opgeloste membranen met detergens onoplosbare fractie opnieuw gesuspendeerd in hetzelfde volume PBS.
5. Analyseer de mono-dispersiteit van verschillende detergentia: membraaneiwit complexen met behulp van fluorescentie gedetecteerd gelpermeatiechromatografie (FSEC).
6. Voor FSEC analyse evenwicht een grootte-uitsluiting met een breed scala fractionering, bijvoorbeeld 5000 tot 5.000.000 molecuulgewicht, met loopbuffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) bij een stroomsnelheid van 0,3 ml / min . Gebruik deze buffer voor alle monsters, dat wil zeggen het is niet veranderd voor elk detergent getest.
7. Injecteer 100 ui van opgeloste membranen op de kolom bij een stroomsnelheid van 0,3 ml / min. Monitor elutieprofiel via fluorescentie optiek (excitatie bij 488 nm en emissie bij 512 nm). Als een inline fluorescentie beeldscherm niet beschikbaar is, verzamelt de fracties en lees de fluorescentie in een plaatlezer.
8. Import elutievolume en fluorescentie-intensiteit van gegevens in een spreadsheet programma voor grafische weergave.
9. Analyse resterende opgeloste membraan materiaal door het in-gel fluorescentie zoals beschreven in hoofdstuk 5.

Results

De SEDS familie van eiwitten (shape, rek, delen en sporulatie) is essentieel voor bacteriële celdeling. Deze integrale eiwitten hebben doorgaans tien transmembraandomeinen zowel amino- en carboxy-uiteinden in de cel. Om de hierboven beschreven protocol illustreren, werden 47 SED orthologen gekloneerd in de vector pOPINE-3C-eGFP. Een kleinschalige expressie scherm van de constructen werd in twee E .coli stammen uitgevoerd Lemo21 (DE3) gekweekt in aanwezigheid van 0,25 mM rhamnose om lekkende expressie en C41 (DE3) pLysS die routinematig worden gebruikt voor de expressie van membraan blokkeren eiwitten ^5-8.

Wasmiddel oplosbaar lysaten van geïnduceerde kweken werden geanalyseerd door SDS-polyacrylamide elektroforese. Met in-gel fluorescentie te visualiseren expressie GFP-fusie-eiwitten toonde aan dat tussen de twee stammen 38 van de 47 SED constructen werden geproduceerd. Interessant waren er verschillen tussen de twee expressie stammen. Van de 38 expressie constructen slechts 18 werden in beide stammen, 14 alleen uitgedrukt in Lemo21 (DE3) en 6 slechts C41 (DE3) pLysS. Over het algemeen was er een hoger slagingspercentage voor de Lemo21 (DE3) in vergelijking met de C41 (DE3) pLysS (38 versus 24). De waarneming dat sommige eiwitten bleek stamspecifieke zijn betekent evenwel dat screening beide nuttig.

Representatieve gegevens voor 24 van de 47 SED constructen worden getoond in figuur 1. De intensiteit van de banden geeft een indicatie van het niveau van expressie, bijvoorbeeld het fusie-eiwit in goed C4 in figuur 1A en 1B is goed aanvullende uitgedrukt in beide stammen echter lager bandbreedtes molecuulgewicht suggereren dat het eiwit gedeeltelijk afgebroken. In vele rijstroken is een band die overeenkomt in grootte met GFP alleen. Een kwalitatieve beoordeling van de integriteit van het eiwit kan door te kijken naar de intensiteit van fusie-eiwit ten opzichte van het vrije GFP worden uitgevoerd;bv G4 en H4 zijn volledig afgebroken tot vrije GFP in C41 (DE3) pLysS (Figuur 1B), terwijl in de Lemo21 (DE3) is er enige intacte eiwit (Figuur 1A). Voor 14 van de 38 expressie gebrachte eiwitten de intensiteit van het vrije GFP band is gelijk aan die van het fusie-eiwit, 21 de intensiteit van het vrije GFP band groter is dan die van het fusie-eiwit en een minderheid van de fusie-eiwitten (3 / 38 uitgedrukt) bijvoorbeeld F6 en G6 in figuur 1A relatief weinig vrije GFP vergeleken met de fusieproteïne.

Twee van de constructen die goed in de primaire scherm B5 uitgedrukt (hoge intensiteit bands gratis GFP en fusie-eiwitten) en G6 (weinig vrije GFP) werden uitgedrukt en een totaal membraan fractie bereid uit 500 ml celkweek. Geresuspendeerde membranen werden in fracties verdeeld en door fluorescentie gedetecteerd gelpermeatiechromatografie (FSEC) geanalyseerd. De FSEC profielen worden gepresenteerd in Figurrespectievelijk e 2A en 2B tonen dat beide SED eiwitten zich anders in de vier geteste detergentia. In één geval (Figuur 2A: monster B5) het eiwit alleen gaf een symmetrische piek met weinig aggregatie in DDM die aldus als wasmiddel van keuze voor verdere zuivering. Daarentegen de andere fusie-eiwit (Figuur 2B: sample G6) gaf een vergelijkbaar profiel in alle wasmiddelen getest.

Figuur 1: Schematische weergave van de workflow voor het screenen membraaneiwit expressie in E. coli met een GFP reporter.

Figuur 2: Primaire scherm van membraaneiwit expressie met behulp van in-gel fluorescentie. Wasmiddel lysaten van E. coli-cellen werden geanalyseerd door SDS-PAGE gels en afgebeeld met behulp Blue Epi verlichting en een 530/28 filter. De resultaten worden getoond voor 24 constructen (gelabeld A4-H6 basis van hun positie in een plaat met 96 putjes). De posities van de banden voor gratis GFP en GFP-fusie-eiwitten zijn aangegeven. (A) Eiwitten uitgedrukt in Lemo21 (DE3). (B) Eiwitten uitgedrukt in C41 (DE3) pLysS.

Figuur 3:. Secundaire screen membraan eiwitexpressie middels fluorescentie gedetecteerd gelpermeatiechromatografie (FSEC) Totaal membraan fracties werden vier verschillende detergentia geëxtraheerd en de opgeloste membraaneiwitten geanalyseerd door grootte-uitsluitingschromatografie met een FPLC systeem gekoppeld aan een fluorescentiedetector. FSEC profielen voor (A) membraaneiwit B5 en (B) membraaneiwit G6. De positie van de pieken die overeenkomen met geaggregeerde eiwit, oplosbaar GFP-fusie-eiwit en vrij GFP aangegeven. De geteste detergentia onder de profielen aangegeven.

Discussion

In de in dit artikel beschreven protocol wordt ligatie onafhankelijk kloneren in een GFP reporter vector gecombineerd met fluorescentiedetectie snel screenen van de relatieve expressie van meerdere membraaneiwitten in E. coli. Vectoren kunnen worden gemaakt in vier werkdagen met primaire expressie screening nemen nog een week. In-gel fluorescentie van detergenslysaten van hele cellen wordt gebruikt om te rangschikken expressie raakt voor verdere analyse in een tweede scherm. De primaire uitdrukking scherm zoals gepresenteerd geen specialistische apparatuur, afgezien van een shaker incubator geschikt voor het kweken van cellen in diepe put blokken nodig. Alle andere vloeistofverwerking met 96 putjes SBS platen kunnen worden uitgevoerd met meerkanaals pipetten. Het protocol kan gemakkelijk worden gewijzigd om andere E. coli-stammen onder verschillende expressieomstandigheden (bijvoorbeeld lagere temperatuur) afgeleid omvatten. Bij de LEMO21 (DE3) titreren het niveau van rhamnose (0-2,0 mM)toegevoegd aan de snelheid van de transcriptie te moduleren kan het niveau van expressie van sommige membraaneiwitten ⁷ te verhogen. Behalve DDM Detergentia kunnen worden voor extractie de primaire screening hoewel zwaardere detergentia eiwitten oplosbaar uit inclusielichamen en dus valse positieven. Duidelijk de uitgebreidere het beginscherm wordt, de tijdrovender het experiment.

De secundaire scherm gaat de voorbereiding van een totaal membraan fractie uit de uitdrukking klappen die in het primaire scherm. Dit is een kritieke stap omdat de lokalisatie van de fusie-eiwitten bevestigt aan het membraan van de E. coli-cellen. Na extractie van de GFP fusie-eiwit in verschillende detergentia wordt gecontroleerd door fluorescentie gedetecteerd gelpermeatiechromatografie van oplosbaar materiaal om de mono-dispersiteit van het detergens-eiwitcomplexen beoordelen. Dit is weer een belangrijke stap omdat het identificeert de meest geschikte reinigingsmiddel voorsolubilisatie van het membraaneiwit voor verdere stroomafwaartse bewerking. De ervaring leert echter dat een verdere optimalisering van de keuze van het wasmiddel (s) nog steeds tijdens de zuivering en kristallisatie kan worden verlangd. Bewijs van uniform gedrag in verschillende detergentia waaronder degenen met een relatief kleine micel formaat (bijv LDAO) lijkt een goede indicator van een neiging om goed vorm buigen van kristallen althans prokaryotische membraaneiwitten ¹⁴ zijn. In dit opzicht blijkt het membraaneiwit in figuur 2B profiel beschikking zeer gunstig.

Het belangrijkste voordeel van het gebruik van een GFP reporter is dat het geeft een snelle uitlezing van meningsuiting in-un gezuiverd monsters. Een nadeel is dat de GFP fusie-eiwit tijdens de zuivering van het eiwit kristallisatie te verwijderen. In het geval van de vectoren hier gebruikt, een rhinovirus 3C protease website geeft splitsing van het GFP. Alternatief is eenvoudigaan kandidaat-eiwitten, die in het scherm-kloon opnieuw in vectoren die slechts een polyhistidine of andere affiniteit tag toe te voegen voor de volgende zuivering. Dit veronderstelt dat fusie aan GFP niet noodzakelijk voor expressie. De belangrijkste alternatief voor fusie aan GFP voor detectie van membraaneiwit expressie en oplosbaar is slechts een histidine tag. Deze benadering vereist echter gewoonlijk vanaf een membraanfractie ¹⁵ die voor de evaluatie van vele varianten zeer tijdrovend zou worden.

Samengevat, het belangrijkste doel van de in dit artikel beschreven protocol is het mogelijk een groot aantal membraaneiwit sequentievarianten snel worden geëvalueerd in termen van meningsuiting en wasmiddel oplosbaar en geprioriteerd voor diepere analyse.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Power broth	Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L7651
Cholesterol hemisuccinate	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl	Thermo Scientific	4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip	Anachem	L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Tension rollers attachment	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	Beckman Coulter	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor	Beckman Coulter	393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R incubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi)	Constant systems	PL083016
L-Rhamnose monohydrate	Sigma	83650