Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Samenvatting

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Samenvatting

De combinatie van patch clamp opnamen van twee (of meer) synaptically gekoppeld neuronen (gepaarde opnames) bij acute hersenen slice bereidingen met gelijktijdige intracellulaire biocytine vulling maakt een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen. Met deze methode is het mogelijk om zowel pre- en postsynaptische neuronen identificeren en karakteriseren door hun morfologie en elektrofysiologische respons patroon. Gepaarde opnames toe de connectiviteitspatronen tussen deze neuronen alsook de eigenschappen van zowel chemische en elektrische synaptische transmissie. Hier geven we een stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om betrouwbare gepaarde opnames samen te verkrijgen met een optimaal herstel van het neuron morfologie procedures. We zullen beschrijven hoe paren van neuronen die via chemische synapsen of gap junctions zijn geïdentificeerd in de hersenen slice preparaten. We zullen aangeven hoe neuronen worden gereconstrueerd om hun 3D-morfologie van de Dendrit verkrijgenic en axonale domein en hoe synaptische contacten worden geïdentificeerd en gelokaliseerd. We bespreken ook de valkuilen en beperkingen van de gepaarde opnametechniek, met name die in verband met dendritische en axonale afknottingen tijdens de voorbereiding van de hersenen plakjes, omdat deze sterk beïnvloeden connectiviteit schattingen. Vanwege de veelzijdigheid van de gepaarde opname benadering zal een waardevol hulpmiddel bij het karakteriseren van verschillende aspecten van synaptische transmissie bij die neuronale microcircuits in de hersenen blijft.

Inleiding

Neuronale microschakelingen tussen twee synaptically gekoppeld neuronen zijn de bouwstenen van grootschalige netwerken in de hersenen en zijn de fundamentele eenheden van synaptische informatieverwerking. Voorwaarde voor het karakteriseren van dergelijke neuronale microcircuits is de morfologie en functionele eigenschappen van zowel de pre- en postsynaptische neuronen partner, het type synaptische verbinding (en) en de structuur en werkingsmechanisme kennen. In veel studies van synaptische verbindingen ten minste één van de neuronen in een microschakeling niet goed gekarakteriseerd. Dit resulteert uit de betrekkelijk onspecifieke stimulatieprotocollen vaak gebruikt in studies van synaptische connectiviteit. Daarom worden de structurele en functionele eigenschappen van het presynaptische neuron ofwel niet geïdentificeerd of slechts een vrij klein gedeelte (bijvoorbeeld, de expressie van merker eiwitten etc.). Gepaarde opnames in combinatie met intracellulaire kleuring door markers sUch als biocytine, neurobiotin of fluorescerende kleurstoffen zijn beter geschikt voor het bestuderen van kleine neuronale microschakelingen. Deze techniek maakt het mogelijk om vele structurele en functionele parameters van een morfologisch geïdentificeerd synaptische verbinding tegelijkertijd te onderzoeken.

Zogenaamde 'unitaire' monosynaptic verbindingen tussen twee neuronen zijn onderzocht in zowel corticale en subcorticale hersengebieden ^1-10 behulp van acute slice voorbereiding. Aanvankelijk werden scherpe micro-elektroden gebruikt in deze experimenten; later werd patch clamp toegepast om opname van synaptische signalen te verkrijgen met een lager geluidsniveau en een verbeterde tijdsresolutie.

Een belangrijke technische vooruitgang is het gebruik van infrarode differentiële interferentie contrast (IR-DIC) optiek ^11-14, microscopische techniek die aanzienlijk verbeterd de zichtbaarheid en de identificatie van neuronen in de hersenen slice zodat het mogelijk werd to verkrijgen opnames van visueel geïdentificeerde synaptische verbindingen ^15-17. In het algemeen gepaard opnamen uitgevoerd bij acute slice preparaten; slechts zeer weinig publicaties zijn verkrijgbaar rapportage opnamen van synaptically verbonden neuronen in vivo ^18-20.

Het belangrijkste voordeel van gepaarde opnames is het feit dat een functionele karakterisering kan worden gecombineerd met een morfologische analyse op zowel het licht en elektronen microscopisch niveau (zie bv., ^7,16,21). Na histochemische verwerking, wordt de dendritische en axonale morfologie van de synaptically verbonden neuron paar getraceerd. Vervolgens is het mogelijk om morfologische kenmerken zoals lengte, ruimtelijke dichtheid, oriëntatie, vertakking enz kwantificeren Deze parameters kunnen dan een basis voor een objectieve classificatie van een specifiek synaptische verbinding. Bovendien, in tegenstelling tot de meeste andere technieken voor het bestuderen van neuronale verbviteit, gepaarde opnames toestaan ​​ook de identificatie van synaptische contacten voor unitaire synaptische verbindingen. Dit kan direct worden gedaan met behulp van een combinatie van licht en elektronenmicroscopie ^16,21-27 of met behulp van calcium beeldvorming ^28,29 van dendritische spines. Echter, met deze benadering enige prikkelende maar niet remmende verbindingen kunnen worden bestudeerd als het vereist calcium influx via de postsynaptische receptor kanalen.

Naast een gedetailleerde analyse van synaptische transmissie bij een bepaalde neuronale microcircuit gepaarde opnames ook de studie van synaptische plasticiteit regels ^30,31 toestaan ​​of - in combinatie met agonist / antagonist toepassing - de modulatie van synaptische transmissie door neurotransmitters zoals acetylcholine ³² en adenosine ^33.

Protocol

Alle experimentele procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn inzake de bescherming van dieren, de Duitse Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz) en de richtsnoeren van de Federation of European Laboratory Animal Science Association uitgevoerd.

1. Set-up voor Electrophysiology

Voordat u begint met gepaarde opname, een elektrofysiologie set-up moet worden gebouwd. Een korte schets hoe een dergelijke set-up wordt geassembleerd wordt hieronder gegeven:

1. Installeer een antivibratietafel waarop de microscoop, de manipulatoren en andere apparaten worden geplaatst.
   OPMERKING: Trillingen of enige andere vorm van beweging moet zo klein mogelijk zijn bij het opnemen van synaptische verbindingen omdat een wijziging vereist van pipetten (zoeken elektrode vervangen door opname elektrode).
2. Plaats een Faraday kooi rond de antivibratietafel elektrische ruis. Sluit alle apparatuur in de Faraday cage met de elektrische gemalen.
3. Installeer een microscoop met een motorische scherpstelling as die is gebaseerd op een gemotoriseerde xy tafel op de antivibratietafel volgens de richtlijnen van de fabrikant. Hierdoor betrouwbaar verplaatsen de microscoop neuronen die niet in hetzelfde gezichtsveld zoals het geval is voor translaminar verbindingen in de neocortex.
4. Installeer een video camera op de camera-poort van de microscoop en sluit deze aan en / of digitale schermen analoog aan de slice voorbereiding en de beweging van de elektroden te observeren. Gebruik een camera, die kan worden geschakeld tussen een lage en een high-power vergroting om een ​​overzicht te krijgen en het beeld van een close-up, respectievelijk van de synaptically gekoppeld neuronale cel paar. Daarenboven maakt de beweging van de strookelektrodes regelen.
5. Installeer een specimen tabel met een inzet voor het bad kamer (geboord in-huis van een perspex blok) voor de hersenen slice voorbereiding. Dit exemplaar tabel moet niet worden aangesloten op demicroscoop, dwz moeten worden bevestigd aan de lucht tafel en de microscoop moet wendbaar eronder zijn.
6. Mount twee (of meer indien nodig) hoge precisie micromanipulators dat in alle drie dimensies kan worden verplaatst. Installeer patch-clamp voorversterker op de manipulatoren en sluit ze aan de belangrijkste versterker.
   OPMERKING: Indien nodig extra manipulatoren kan worden geïnstalleerd voor bijvoorbeeld meer dan twee voorversterkers, extracellulaire stimulatie-elektroden, drug-delivery systemen, etc.
7. Plaats de bad kamer in het specimen tafel. Installeer een oplossing inlaat en uitlaat en sluit ze aan op de perfusie-systeem.
8. Gebruik een peristaltische pomp aan de perfusie van de opname kamer met kunstmatige cerebrospinale vloeistof handhaven (ACSF; tabel 1) op een stabiele stroomsnelheid van 4-6 ml / min voor optimale levensvatbaarheid segment.
   OPMERKING: Neem niet meer dan dit debiet aanzienlijk omdat het zal leiden tot turbulentie in de ASCF en dus beweging van de snee.
9. Installeer houders voor de temperatuursensor en Ag / AgCl massa-elektrode op het monster tafel. Dit is nodig om de sonde en elektrode laat het bad in de kamer proeven.
10. Voor een goede zichtbaarheid van neuronen in de slice voorbereiding gebruiken infrarood belichting in de microscoop. Dit vermindert licht diffractie en dus onscherpte. Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met differentieel interferentie contrast optiek om een ​​'3D'-achtige visualisatie te bereiken. Dit zal helpen bij het patchen van neuronen en laat targeting neuronen diep in de slice (60 micrometer of dieper).
11. Tijdens het experiment te houden hersencoupes in een experimentele kamer met een glazen dekglaasje onderaan. Plaats een "platina harp 'bovenop slice plakjes voorkomen drijven. Een platina harp uit U-vormige, afgeplatte platinadraad met koorden van tandzijde gelijmd is.
12. Houd de ACSF perfuseren de plak bij een temperatuur van 32-35 ° C om opt waarborgenimal controle van zuurstof en pH. Dit kan door verwarming van de oplossing met een Peltier apparaat montage van de ACSF instroom in het bad kamer.
    OPMERKING: Gebruik ultradunne dekglaasjes zodat zelfs microscoop condensors met een hoge numerieke opening en korte werkafstand kan worden gericht op het monster. Dit is nodig voor een optimale verlichting van de slice.
    Voor een afbeelding en een beschrijving van een elektrofysiologie set-up geoptimaliseerd voor gepaarde opnames in de hersenen slice voorbereiding zie figuur 4 in Ref. ^34.

2. Brain Slice Voorbereiding

1. Mild verdoven het dier waarvan het hersenweefsel moet worden genomen met isofluraan (uiteindelijke concentratie <0,1%).
   OPMERKING: Andere anesthetica kunnen ook worden gebruikt. Gebruik van de narcose moeten voldoen aan de aanbevelingen en regels van de respectieve dier commissie. Zorg er altijd voor dat het dier is niet geïrriteerd of onder stress na het toevoegen vande verdoving.
2. Onthoofden het dier, opent de schedel en verwijder de hersenen zo snel mogelijk met de in referentie beschreven. ^34,35.
3. Breng de hersenen in gekoelde (4 ° C) kunstmatige cerebrospinale vloeistof belucht met een mengsel van carbogen gas met 95% _O2 en 5% _CO2.
4. Isoleer het hersengebied die moeten worden bestudeerd.
   OPMERKING: De parameters voor optimaal behoud en minimale inkorting van dendrieten en axonen van pre- en postsynaptische neuronen te behalen moet vooraf worden bepaald voor elke neurale verbinding en het ontwikkelingsstadium in onderzoek. In een optimaal ontleed hersenen slice, wordt de axon van de presynaptische neuron niet verplicht parallel aan de slice oppervlak te zijn. Veeleer moeten zij verwijzen naar de plakken met een kleine hoek. Het geldt voor de apicale dendriet van postsynaptische piramidale neuronen; Dit moet worden gecontroleerd onder de lichtmicroscoop. Dit is vooral belangrijk voor niet-lokale of translaminar synaptische verbindingen, bijv., waar pre- en postsynaptische somata meer dan 200 micrometer uit elkaar en de kans op dendritische en axonale inkortingen waarschijnlijk aanzienlijk hoger dan voor lokale verbindingen zijn.
5. Breng de hersenen naar de microtoom kamer. Op basis van empirische bevindingen worden verschillende extracellulaire slicing oplossingen gebruikt, afhankelijk van de leeftijd van het dier (zie tabellen 2 en 3; u nuttige informatie is ook te vinden onder ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
6. Trim de hersenen tot het doelgebied zichtbaar is.
7. Om plakjes te verkrijgen met een goede mobiele zichtbaarheid, gesneden 300-400 pm dikke plakjes hersenen als het dier volwassen is (> 3 weken). Als het dier onrijpe ^(1e tot ^2e postnatale week muizen en ratten) segmenten kan worden gesneden tot een dikte van ~ 600-800 urn zonder wezenlijk afbreuk cel visibiliteit.
   LET OP: Dit zal de stabiliteit van 'onvolwassen' plakjes te verbeteren en het aantal mogelijke inkortingen van lange-afstands dendritische en axonale zekerheden.
8. Breng segmenten van de microtoom kamer naar een incubatie kamer gevuld met snijden oplossing belucht met een mengsel van 95% _O2 en 5% _CO2. Bewaar de segmenten in de incubatiekamer minstens 30 minuten tot 1 uur of bij kamertemperatuur of bij -30 ° C, afhankelijk van het soort experiment.

3. Paired patch-clamp-opname en biocytine Vullen

Afhankelijk van het type synaptische verbinding drie benaderingen gebruikt om synaptisch gekoppelde neuronen vinden. Als de verbinding kans is laag (zoals te verwachten voor de meest prikkelende verbindingen), gaat u als volgt te werk:

1. Neuronale verbindingen met een lage connectiviteit
   1. Vul het pleister pipetten met een interne oplossing van het preparaat opgenomenTabel 4 Voor alle opnames in de gehele-cel configuratie toe biocytine bij concentraties tussen 3 -. 5 mg / ml van de interne (pipet) oplossing goede kleuringen voor de pre- en postsynaptische neuronen verkrijgen. Laat biocytine diffuse in de cel ten minste 15-30 minuten (afhankelijk van de grootte van de neuron).
      OPMERKING: Voeg geen biocytine aan de oplossing die in de hieronder vermelde 'zoeken' pipetten.
   2. Patch een vermeende postsynaptische neuron in de whole-cell-modus. Gebruik patch pipetten met een lange en slanke schacht. Dit vergemakkelijkt de manoeuvreerbaarheid van de pipet onder de doelstelling en vermindert bewegingsartefacten die optreden wanneer de elektrode wordt ingebracht in de slice.
   3. Dan, patch een potentiële presynaptische neuron in een cel bevestigd configuratie met behulp van een 'zoek' patch pipet van 8 - 10 MQ weerstand en een kleine tip diameter. Met deze pipetten oprichting van een 'losse' cel bevestigd patch. Fill het "zoeken" pipet met een inwendige oplossing waarin K ⁺ wordt vervangen door Na ⁺ (tabel 5) om geen neuronen depolariseren tijdens het zoeken naar een presynaptische cel.
      OPMERKING: De 'losse' seal weerstand is niet in de GQ bereik, maar meestal rond de 30-300 MQ.
   4. Houd de membraanpotentiaal onder de 'losse' zegel tot ongeveer -30 tot -60 mV in stroomtang modus. Dan passen grote stroom pulsen (0,2-2 nA) om een ​​actiepotentiaal in het potentieel presynaptische cel ontlokken. Observeer deze actie potentieel als een klein aartje van de spanning reactie.
   5. Stel de stimulatie frequentie tot 0,1 Hz tot afbouw van een postsynaptische reactie te voorkomen. Met lagere stimulatiefrequenties wanneer het hersenweefsel zeer jonge of de synaptische verbinding niet erg betrouwbaar.
   6. Indien de "postsynaptische" neuron niet reageren op stimulatie van de geteste "presynaptische 'neuron, patch een nieuw neuron in 'losse' seal-modus. Niet in de plaats van de 'zoek' patch elektrode zolang de afdichting met een weerstand van> 30 MQ is gevestigd. Test tot 30 mogelijk presynaptische neuronen op deze manier.
      OPMERKING: Om beschadiging van de neuron tijdens de zoekprocedure met losse patch clamp voorkomen, alleen voorzichtig zuigkracht moet worden toegepast om het zoeken pipet vergeleken met die toegepast op de whole-cell patch pipet.
   7. Als stimulatie in de 'losse' zegel modus resulteert in een EPSP / IPSP met een latency <5 msec in de postsynaptische neuron verwijder het 'zoeken' pipet uit de presynaptische neuron.
   8. Vervang het 'zoeken' patch pipet met een patch elektrode gevuld met-biocytine bevatten, regelmatige interne oplossing. Zorgen deze opname patch pipet heeft een weerstand van 4 - 8 MQ; hoe groter de soma formaat hoe lager de weerstand elektrode kan zijn.
   9. Patch het presynaptischeneuron en opnemen in whole-cell, stroom-clamp-modus. Ontlokken actiepotentialen door de huidige injectie in de presynaptische neuronen en noteer de postsynaptische respons. Sla de gegevens op een computer voor latere off-line analyse.
2. Neuronale verbindingen met een hoge connectiviteit
   LET OP: Voor neuronale microschakelingen met een hoge connectiviteit verhouding (> 30%) maken gebruik van een andere procedure om synaptische verbindingen te vinden. Deze procedure wordt hieronder beschreven en wordt vaak gebruikt voor remmende synaptische verbinding die hebben gemiddeld een hogere verhouding dan verbindingen prikkelende verbindingen ^36. Het mag niet worden gebruikt wanneer de verbinding verhouding onder deze waarde.
   1. Patch een presynaptische neuron direct in de whole-cell-modus. Vervolgens patch potentiële postsynaptische neuron, ook geheel celmodus. Beide cellen moet onder stroomklem controle. Ontlokken een actiepotentiaal in de presynaptische cel. Bewaken van de aspirant postsynaptische neuron voor een postsynaptic potentieel.
   2. In het geval dat het neuron niet een reactie op presynaptische stimulatie tonen, patchen een nieuw neuron in whole-cell-modus met behulp van een patch elektrode gevuld met regelmatige interne oplossing. Als er een verbinding wordt gevonden, hoeft de patch pipet niet veranderen, maar door te gaan met de opname. Ga dan verder zoals in stap 3.1.9.
3. Neuronale verbindingen via gap-junctions
   OPMERKING: Voor het zoeken van elektrische (gap-junction) aansluitingen gebruikt u de volgende procedure die is een aangepaste versie van die gebruikt worden voor lage waarschijnlijkheid verbindingen.
   1. Patch een postsynaptische neuron in de whole-cell patch clamp-configuratie.
   2. Vervolgens patch een vermeende presynaptische neuron in de losse-seal configuratie (laag zegel weerstand van 30-300 MQ) met behulp van een 'zoek' patch pipet van 7-10 MQ weerstand. Deze pipet moet worden gevuld met de gewijzigde hoge Na ⁺ interne oplossing voor losse-seal stimulatie.
   3. Inject 100-300 msec lang hyperpolariserende huidige pulsen via de 'losse' zegel; de pipet commando potentieel moet worden ingesteld op ongeveer -60 tot -70 mV. Observeer een gap junction verbinding als dit stimulatie resultaten in een kleine hyperpolarizing reactie in het 'postsynaptische' neuron.
   4. Repatch het "presynaptische" neuron in de gehele-cel functie en ga verder zoals hierboven beschreven.
      OPMERKING: Om een ​​goede kleuring van de axonen en dendrieten processen te waarborgen, gebruik dan de onderstaande protocol gegeven. Dit protocol wordt beschreven in het kort hier echter een gedetailleerd protocol voor histochemische verwerking in ons laboratorium is gegeven in ref. ^37.

4. Histochemische Processing

1. Breng de hersenen slice met het paar synaptisch gekoppelde neuronen in een flacon met 4% paraformaldehyde opgelost in 0,1 M fosfaatbuffer en fixeren de plak gedurende 24 uur. Voor elektronenmicroscopie, fixeren de slice met 2,5% glutaraldehyde en 1% paraformaldehyde.
2. Op de volgende dag, dragen de plakjes in normale fosfaatbuffer die geen fixeermiddel. Was segmenten met fosfaatbuffer gedurende 6-8 keer gedurende 10-15 minuten elk om overmaat fixeermiddel verwijderd.
3. Incubeer plakken voor 20 min in een 3% H ₂ O _2-oplossing in 0,1 M fosfaatbuffer bij de endogene peroxidase reactie minimaliseren. Observeren sterke formatie zeepbel. Zet de destructie tot geen verdere belletjes worden geproduceerd. Vervolgens spoel de plakken in 0,1 M fosfaatbuffer gedurende 6-8 keer (10 minuten elk) om alle overblijvende H ₂ O ₂ verwijderen.
4. Immuuncytochemische en chromogene reacties
   Visualisatie van biocytine gevulde neuronen is gebaseerd op een streptavidine-gebiotinyleerd mierikswortel peroxidase gekatalyseerde reactie met diaminobenzidine; Dit produceert een donkere neerslag die een scherpe vlek met een hoge ruimtelijke resolutie produceert. De volgende procedures worden toegepast voor de chromogene reactie
   1. Bereid de ABC oplossing volgens het protocol van de fabrikant. Naar 14.55 ml fosfaatbuffer aangevuld met 150 ui 10% Triton X100 (Tabel 6, alleen voor lichtmicroscopie) en houden van de oplossing gedurende ongeveer 30 minuten in het donker. Incubeer segmenten in deze oplossing O / N voor gebruik.
   2. Incubeer segmenten in ABC oplossing op een schudder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en in het donker. Vervolgens houden plakjes O / N bij 4 ° C in een koelkast. De volgende ochtend, incubeer schijfjes bij kamertemperatuur een uur.
   3. Daarna afspoelen plakken minstens vier maal gedurende 10 minuten elk in fosfaatbuffer. Vervolgens incuberen op een schudinrichting gedurende 30 minuten in het donker in 2 ml van een nikkel geïntensiveerd 3-3'-diaminobenzidine oplossing (Tabel 7). Wees zeer voorzichtig bij het hanteren van diaminobenzidine en gebruik alleen onder de zuurkast; het zeer kankerverwekkend, zelfs bij zeer lage concentraties.
   4. Voeg 6,5 gl 3% H ₂ O ₂ de diaminobenzidine bevattendeoplossing. Toezien op de chromogene reactie onder een lichtmicroscoop tot bruin-zwart gebeitst neuronen zijn duidelijk zichtbaar. Vervolgens stopt de reactie onmiddellijk door wassen segmenten meerdere malen in fosfaatbuffer.
   5. Mount plakjes met lood neuronen op zelfklevende, silaan gecoate Histobond of gelatinized standaard object dia's.
   6. Houd de objectglaasjes in een vochtige kamer met ten minste 80% vochtigheid O / N. Op de volgende dag, laat de plakjes lucht drogen voor een verdere 10 min. Vóór inbedden overdracht dia in oplossingen met toenemende concentraties ethanol (20-100%) om ze te drogen.
      OPMERKING: Het droogproces moet langzaam anders verstoringen in de dendritische en axonale processen zijn te verwachten ^37. Als een alternatief inbedding procedure wordt gekozen, bijvoorbeeld een met de glycerol gebaseerde Moviol een dehydratatie niet nodig; maar dit is waarschijnlijk resulteren in een inhomogeen compressie van de slice en dus een vertekend neuronale morphology.
   7. Tenslotte Incubeer 10 minuten in xyleen, verankeren de plakjes in een hydrofoob inbedding medium voor lichtmicroscopie en plaats een ultradunne dekglaasjes bovenaan. Laat slides drogen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

5. Neuronale Wederopbouw en Synaptic Contact Localization

1. Onderzoek slides met biocytine gelabelde neuronen onder een lichtmicroscoop uitgerust met een 60X / 100x olie-immersie objectief en een condensor met een hoge numerieke apertuur voor optimale ruimtelijke resolutie. Zorg ervoor dat axonale boutons en dendritische stekels zijn duidelijk zichtbaar.
2. Trace neuronen of synaptically gekoppeld neuron paren met behulp van een commercieel neuron tracing systeem (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur) naar 3D neuronale reconstructies te verkrijgen. Voeren tracing handmatig onder voortdurende visuele inspectie om zelfs kleine axonale of dendritische zekerheden te detecteren. Voor gepaarde opnames van synaptically gekoppeld neuronen handleiding tracing is nog steeds de methode vankeuze, omdat de toekenning van bijvoorbeeld een axonale profiel om ofwel de pre- of postsynaptische neuron vereist substantiële reconstructie ervaring.
3. Indien nodig, maken tellingen van axonale boutons en / of dendritische stekels. Omdat stekels of zelfs subtypes wervelkolom en axonale boutons een specifieke verdeling en dichtheid kan vertonen met betrekking tot bijvoorbeeld corticale laag of gebied, kan dit bijdragen tot neuronale celtypen karakteriseren.
4. Voor synaptically gekoppeld neuron paren, controleer dan de presynaptische axon en postsynaptische dendrieten voor close apposities op het hoogste vergroting beschikbaar. Observeer een axonale bouton en een postsynaptische dendritische wervelkolom of as is in hetzelfde focal plane kan worden beschouwd als een vermeende synaptische contact. Markeer deze contactpersoon bij de wederopbouw.
5. Corrigeer de neuronale reconstructies voor krimp in alle drie ruimtelijke dimensies in het desbetreffende gedeelte van de tracing programma.
   OPMERKING: Tijdens fixatie, histochemische verwerkingen uitdroging aanzienlijke mechanische vervorming en krimp optreden; dit zal axonen en dendrieten lengte metingen beïnvloeden en ernstig vervormen hun ruimtelijke opstelling. Krimp correctiefactoren voor de inbeddingmedium zijn ~ 1.1 voor x en y richtingen en ~ 2.1 voor de z-richting ^37.
6. Voor een kwantitatieve morfologische analyse gebruik maken van een data-analyse programma voor de neurofysiologie (zie Tabel van specifieke materialen / apparatuur).

Resultaten

Gepaarde opnamen de voorkeursmethode voor een grondige karakterisering van morfologisch geïdentificeerd uni- of bidirectionele synaptische verbindingen alsmede gap junction (elektrische) aansluitingen (figuur 1). Een voorbeeld van een gepaarde opname laag 4 van de somatosensorische cortex vat wordt getoond in figuur 1A. Zowel unidirectionele prikkelende en remmende synaptische verbindingen worden gekarakteriseerd (Figuur 1B, C). Verder gepaarde opnames laten opnemen bid...

Discussie

Gepaarde opnames van synaptisch gekoppelde prikkelende en / of remmende neuronen een zeer veelzijdige benadering voor de studie van neuronale microschakelingen. Niet alleen heeft deze benadering mogelijk maken om schatten synaptische verbindingen tussen soorten neuronen, maar maakt ook de bepaling van de functionele eigenschappen van de verbinding en de morfologie van pre- en postsynaptische neuronen. Bovendien kunnen agonist en / of antagonist eenvoudig worden toegepast op neuronen in slice preparaat. Hierdoor kan men ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Versterker	HEKA	EPC 10 USB Triple	met 2 - 3 voorversterkers
Microscoop	Olympus	BX51WI	met 2 camerapoorten, een 4X objectief en een 40X water-immersieobjectief
Camera	TILL Photonics	VX55	infrarood CCD-camera
Werkstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	met een gemotoriseerde x-y-fase en een gemotoriseerde focusas voor de microscoop
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulatoren voor 2 - 3 voorversterkers
Faraday-kooi	Luigs & Neumann
Anti-vibratietafel	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtoom	Microm International	HM650V
Micropipettrekker	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida-systeem	Microbrightfield		met Neurolucida en Neuroexplorer softwares