Methodenartikel

Een proteoliposome-Based Efflux Assay om Enkelmolecuul Eigenschappen van Cl Bepaal

DOI:

10.3791/52369

⸱

20 april 2015

 , 
1Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, 2Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 3Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteoliposomen worden gebruikt om gezuiverde kanalen en transporteurs te bestuderen die gereconstitueerd zijn in een goed gedefinieerde biochemische omgeving. Er wordt een experimentele procedure geïllustreerd om efflux gemedieerde door deze eiwitten te meten. De stappen om proteoliposomen voor te bereiden, de opnames uit te voeren en gegevens te analyseren om de functionele eigenschappen van het gereconstitueerde eiwit kwantitatief te bepalen worden beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afgelopen 15 jaar zijn gekenmerkt door een explosie in de mogelijkheid om membraaneiwitten te overexpresseren en te zuiveren uit zowel prokaryotische organismen als uit eukaryoten. Deze toename is grotendeels gedreven door de succesvolle inspanningen om structurele informatie over membraaneiwitten te verkrijgen. Echter, de mogelijkheid om deze eiwitten functioneel te onderzoeken, is niet in dezelfde mate gevorderd en is vaak beperkt tot kwalitatieve tests met beperkte kwantitatieve waarde, waardoor de mechanistische inzichten die ze kunnen bieden beperkt blijven. Een test wordt beschreven om de transportactiviteit van gereconstitueerde Cl- kanalen of transporteurs kwantitatief te onderzoeken. De test is gebaseerd op de meting van de effluxsnelheid van Cl- uit proteoliposomen na toevoeging van het K+ ionofoor valinomycine om het membraanpotentiaal te shunten. Een ionengevoelige elektrode wordt gebruikt om de tijdsverloop van ionenefflux van proteoliposomen, gereconstitueerd met het gewenste eiwit, te volgen. De methode is zeer geschikt voor mechanistische studies, omdat het de kwantitatieve bepaling van sleuteleigenschappen van het gereconstitueerde eiwit mogelijk maakt, zoals de unitaire transportsnelheid, het percentage actieve eiwitten en de moleculaire massa van de functionele eenheid. De test kan ook worden gebruikt om het effect van kleine molecuulverbindingen die het gereconstitueerde eiwit direct remmen/activeren te bepalen, evenals om de modulatorische effecten van de membraansamenstelling of lipide-modificerende reagentia te testen. Waar mogelijk, werd een directe vergelijking tussen resultaten verkregen met deze methode in goede overeenstemming gevonden met die verkregen met elektrofysiologische benaderingen. De techniek wordt geïllustreerd met behulp van CLC-ec1, een CLC-type H+/Cl- uitwisselingssysteem, als modelsysteem. De efflux-test kan worden gebruikt om elke Cl- geleidende kanaal/transporteur te bestuderen en kan, met minimale wijzigingen, worden aangepast om elk ion-transporterend eiwit te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de laatste twee decennia is de mogelijkheid om overexpressie en te zuiveren membraan transporteiwitten is dramatisch toegenomen: ionkanalen, primaire en secundaire transporteurs worden nu routinematig gezuiverd van heterologe expressie systemen, alsmede natuurlijke bronnen. Nieuwe benaderingen te controleren meningsuiting, te verbeteren en de winning faciliteren en versterken de stabiliteit van deze eiwitten worden constant ontwikkeld 1-5. Deze technologische doorbraken zijn geweest bij het activeren van de explosie van atoom-niveau structurele informatie over membraaneiwitten die op zijn beurt verbeterde ons begrip van de structurele basis van hun functie is. Daarentegen ons vermogen sonderen de functionele eigenschappen van de gezuiverde eiwitten geen verhoging in hetzelfde tempo, zodat in sommige gevallen hoge resolutie structuurinformatie gepaard met kwalitatieve functionele gegevens, waardoor ons vermogen om kwantitatief te testen structuur gebaseerde voorspellingen beperkt. Vandaar dat de development van kwantitatieve en generaliseerbaar functionele assays is een belangrijke stap naar de ontrafeling van de mechanistische onderbouwing van membraaneiwit functie.

Hier beschrijven we een efflux assay die kan worden gebruikt om kwantitatief belangrijkste functionele eigenschappen van gezuiverd en gereconstitueerd Cl - kanalen en transporters. De beginselen van de test kan worden gegeneraliseerd naar diverse transportsystemen, alsmede niet-ion transport eiwitten. Liposomen worden gereconstitueerd met gezuiverde Cl - kanaal / transporters in de aanwezigheid van een grote Cl - helling (figuur 1A, B). Cl - efflux wordt geïnitieerd door de toevoeging van een ionofoor om voor tegenion flux, in ons geval de K + ionofoor valinomycine, dat voldoet aan de Cl spanning shunt - gradiënt en het beginvolume membraanpotentiaal de evenwichtspotentiaal van K + 6,7. Zonder thij ionofoor geen significant netto Cl - efflux optreedt, zoals wordt voorkomen door het genereren van een transmembraanpotentiaal. De data wordt kwantitatief beschreven door twee meetbare parameters (figuur 1C): τ de tijdconstante van Cl - efflux en f0, de fractie van liposomen actief eiwit bevatten. Van τ en f 0 de unitaire Cl - transportsnelheid, kan de fractie van actief eiwit en de molecuulmassa van het actieve complex afgeleid 8. De techniek wordt hier geïllustreerd aan de hand proteoliposomen gereconstitueerd met CLC-EC1, een goed gekarakteriseerde CLC-type H + / Cl - wisselaar van bekende structuur en functie. Deze test wordt gemakkelijk gegeneraliseerd om kanalen of transporters met verschillende ionische selectiviteit of waarvan de activiteit afhankelijk van de aanwezigheid van spanning en / of liganden. Bovendien kan deze bepaling worden vastgesteld of kleine moleculen rechtstreeks de gereconstitueerde eiwit,om de effecten van deze verbindingen en hoe membraansamenstelling of lipidemodificerend reagentia invloed op de functie van de gereconstitueerde kanalen en transporters kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. lipidepreparaat

  1. Aliquot de gewenste hoeveelheid lipiden in een heldere glazen buis. Gebruik E. coli polair lipide-extract, maar de meeste lipidesamenstellingen worden gebruikt. Indien lipiden in poedervorm, resuspendeer ze in chloroform tot een concentratie van 20 mg / ml. Droog de ​​lipiden bij KT onder N2-gas totdat al het oplosmiddel verdampt.
  2. Resuspendeer de lipiden in pentaan en drogen weer een gestage stroom van gas N2 overgebleven sporen van chloroform te verwijderen. Droog totdat al het oplosmiddel verdampt. Tijdens het drogen voorzichtig zwenken de buis zodanig dat het lipide is verdeeld in een gelijkmatige film die het onderste derde van de buis in plaats van de vorming van een dichte massa onderin.
  3. Voeg de reconstitutie buffer die detergens (300 mM KCI, 50 mM citroenzuur, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 mM CHAPS) de lipiden ontbinden. Gebruik andere milde wasmiddelen voor deze stap over als het eiwit is slecht tolerant CHAPS.
  4. Resuspend de lipiden aan duidelijkheid met behulp van een waterbad sonicator. Dompel de buis in het midden van het water sonificator bad op maximaal vermogen in het kort (30 sec-1 min) pulsen met kort (30 sec-1 min) pauzeert. De oplossing moet helder worden.
    Opmerking: De uiteindelijke mate duidelijk mogelijk afhankelijk van de specifieke lipide samenstelling gebruikt. Sommige batch-to-batch variatie in deze stap, zelfs onder nominaal identieke lipiden, is eveneens mogelijk. Residuele waas door lichtverstrooiing door grote deeltjes in de suspensie, die kan worden verwijderd door centrifugatie.
  5. Incubeer de geresuspendeerde lipiden bij kamertemperatuur gedurende 20-60 min.

2. proteoliposome Vorming

OPMERKING: Verschillende strategieën kunnen worden toegepast om het detergens gesolubiliseerde proteïne te voegen in liposomen. Voor CLC-EC1 dialyse werkt goed en is daarom de methode van keuze 6,9,10.

  1. Voeg de gezuiverde eiwit aan het gewenste eiwit tot lipide (P / L) verhouding (uitgedrukt in pg o F-eiwit / mg Lipid). De keuze van de P / L-verhouding afhankelijk van het doel van het experiment.
    1. Als het doel is om de activiteit van het eiwit van belang kan reconstitueren hoge P / L's om het signaal te maximaliseren, omdat elk liposoom bevat meerdere kopieën van het eiwit. Om de activiteit en / of unitaire transportsnelheid van het eiwit te kwantificeren, gereconstitueerde een Poisson verdunning regime lage P / L's, zodat elk vesikel gemiddeld 1 proteïne. Zie stap 7 en discussie voor een meer diepgaande analyse van toen aan elke regeling te gebruiken.
  2. Om de optimale P / L-waarden voor de verschillende regimes te bepalen voor een volledige titratie van de activiteit als functie van eiwitconcentratie 8,11-13. Voor elk eiwit waarvoor het molecuulgewicht (MW, uitgedrukt in kDa) van de actieve eenheid is bekend de volgende P / L-waarden worden gebruikt als initiële guesstimates:
    pg "/>
    figure-protocol-1
  3. Laad het proteïne en lipide mengsel in een vooraf bevochtigde dialyse buis of een cassette. Plaats de dialyse inrichting in een bekerglas met 500-1,000x het volume van de lipide reconstitutie buffer (dat wil zeggen 1 liter buffer gedurende 1 ml lipide resuspensie) onder voorzichtig roeren.
    1. Wijzig buffer 3-4 keer om> 3 uur. Bij elke oplossing verandering, was de cassette / buizen en de beker met gedestilleerd water en vul de beker met verse reconstitutie buffer. Omvatten 1-2 O / N-intervallen voor de oplossing verandering. Het exacte aantal en de duur van de oplossing verandert afhankelijk van de precieze lipide en detergenten gebruikt.
  4. Na de laatste stap is voltooid, verwijdert de liposomen van de dialyse vat, aliquot ze in buizen en flash invriezen in vloeibare N2 of bevriezen bij -80 ° C.

3. Opname Set-up

NB: De opname opstelling (figuur 2A) bestaat uit twee kamers (platte bodem cilinders, ~ 3-4 ml volume), een Cl - (zie hieronder) elektrode, een pH-meter met een analoge of digitale elektrisch vermogen, een digitizer, en een computer met een passende acquisitie software.

  1. Sluit de Cl - elektrode om de pH meter, de uitgang van de pH-meter om de digitizer die is aangesloten op de computer. Plaats de referentie-elektrode in één kamer en de hercodering draad in de andere (figuur 2B).
    OPMERKING: De polariteit van de draden is correct als AV Cal (zie Stap 6.4 en 7.2) is positief.
  2. Plaats de kamers op een roer plaat met een roerstaafje in de opname kamer (Figuur 1B). Zorg ervoor dat het roerstaafje niet de elektrode aanraken.
  3. Sluit de camera's met behulp van een agar brug (Figuur 2B) (100 mM KCl en 2% agarose). Bewaar de Agar bruggen in 100 mM KCl.

4. Voorbereiding van de Cl - elektrode

  1. Neem een ​​oude en -possibly- niet-functionerende pH-elektrode. Breek het glas coating volledig onthullen de zilveren draden.
  2. Verwijder de bekleding voorzichtig uit de zilveren draden met behulp van een scalpel. Maak de draden met overvloedige hoeveelheden H 2 O en EtOH.
  3. Plaats in een verzadigde oplossing van FeCl3 (of bleekmiddel) tot draden bedekt met een uniforme donkere laag AgCl.

5. Bereiding van Unilamellaire Vesicles

  1. De nacht vóór de experimenten, zwellen 1 g Sephadex G-50 kralen in 15 ml externe buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citroenzuur, pH 4,5) onder zacht schudden (niet roeren) voor ten minste 3 uur bij kamertemperatuur vóór gebruik. Elk experiment vereist ~ 3 ml van gezwollen korrels. Houd de gezwollen korrels bij 4 ° C gedurende enkele dagen hooguit.
  2. Terwijl de liposomen ontdooien bij kamertemperatuur, giet in elke kolom ~ 3 ml gezwollen G-50 kralen. Laat ze drogen door de zwaartekracht stroom bij RT; Dit duurt meestal 1-2 min.
  3. Bereid unilamellaire blaasjes door het extruderen van de proteoliposomen 11 keer door een mini-extruder met een 0,4 m Teflon cutoff.
  4. Plaats de kolom in een plastic ronde bodem buis. Spin de kolommen om overtollige oplossing te verwijderen. Centrifugeer gedurende 20-30 seconden bij 1400 xg in een klinische centrifuge.
  5. Gooi doorstroom plaats kolom in een 13 x 100 mm glazen buis en voeg 100 ul van de geëxtrudeerde blaasjes aan de kolom. Spin kolom gedurende 1 min bij 500 xg in een klinische centrifuge.
  6. Verzamel ~ 200 ul doorstroom die worden toegevoegd aan de opname kamer in stap 6.5.

6. Efflux Meting

  1. Plaats 2 ml van 100 mM KCl in de referentie (grond) kamer en 1,8 ml van de externe buffer (1 mM KCl, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM citroenzuur, pH 4,5) om de opname kamer. De lichte osmotische onbalans tussen de interneen externe oplossingen geen invloed
  2. Start de acquisitie programma. Laat de basislijn in evenwicht, dit kan een paar minuten duren.
  3. Zodra het signaal een stabiele basislijn (de liposomen zijn klaar en de kolommen drogen) bereikt, start de opname (figuur 3A).
  4. Voeg 15 ul van 10 mM KCl oplossing voor het systeem (figuur 2A) te kalibreren.
  5. Liposomen voegen. Een kleine sprong kan zichtbaar door de onvolledige verwijdering van externe Cl - van proteoliposomen (figuur 3A). Wacht maar tot de basislijn stabiliseert.
  6. Voeg Valinomycin (1 ui 1 mg / ml in EtOH) om efflux (figuur 3A) te leiden.
  7. Laat de uitstroom lopen het tijdsverloop tot het plateaus (Figuur 3A).
  8. Voeg 40 ul van 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) bereid in de externe buffer om alle liposomen (Figuur 3A) oplossen. Stop de opname.

7. Data ANALYSE

  1. Het trace bestand exporteren uit in een ASCII of tekstformaat en importeren om de analyse programma naar keuze.
  2. Meet de spanning op de volgende plaatsen (Figuur 3A):
    Aan het begin van de opname (0 V);
    Na toevoeging van het kalibreren puls (V cal);
    Na toevoeging van de liposomen (V lipo);
    Aan het einde van de efflux (V fin);
    Na toevoeging van detergens (V tot);
    Baseline de spanningen zodat V 0 = 0.
  3. Gebruik de Nernst-Plank vergelijking om de experimentele waarde van te bepalen figure-protocol-2 door meting
    figure-protocol-3
    Wanneer Vol Cal is het volume van de kalibratiepuls in pl, 1800 wordt de volumekamer aan het begin van het experiment uitgedrukt1; l, [Cl] cal / in de Cl - concentraties van de kalibratiepuls en van de externe buffer in mm en AV cal is de sprong in mV gemeten na de kalibratiepuls.
    LET OP: Deze empirische bepaling van α dient drie doelen: het zorgt ervoor dat het systeem goed reageert, biedt een maat voor de consistentie van de reactie van het instrument tussen de experimenten, alsmede om te controleren dat er geen fouten zijn gemaakt in de oplossing maken.
  4. Bereken de Cl concentraties na elke stap als volgt:
    figure-protocol-4
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
    De factor 3/400 komt van de verdunning van de 15 pl kalibratiepuls in de 2000 pl eindvolume.
  5. Calculaten de veranderingen in [Cl] bij elke stap, ΔCl lipo / fin / tot.
  6. Zet V (t) in Cl (t) met
    figure-protocol-7
    Direct bepalen [Cl] waarden kritische punten en te vergelijken met de berekende waarden als een interne controle.
  7. Normaliseren van de sporen, zodat de Cl rel lipo = 0 en Cl rel tot = 1
    figure-protocol-8
  8. Breng de efflux tijdsverloop aan de volgende vergelijking:
    figure-protocol-9
    Waarbij L de snelheid van Cl - lek experimenteel wordt bepaald door Cl - efflux van eiwitvrije liposomen bereid onder dezelfde omstandigheden en τ de tijdconstante van het proces.
  9. Bereken v, de beginsnelheid:
    figure-protocol-10
    Wanneer ΔCl vin wordt uitgedrukt in mM en V het volume van de kamer in ul.
  10. Bereken het transport tarief / geleiding
    figure-protocol-11
    Waarbij p de P / L, MW is het molecuulgewicht van het actieve complex uitgedrukt in kDa

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een gedetailleerd en robuust protocol om Cl te meten - transport gemedieerd door gezuiverd CLC-EC1, een prokaryotische CLC-type H + / Cl - wisselaar, gereconstitueerd in liposomen. Een schematische voorstelling van het experiment wordt getoond in figuur 3 proteoliposomen gereconstitueerd met gezuiverd CLC-EC1 en met hoge interne Cl -. Ondergedompeld in een bad oplossing die lage Cl -. Onder deze omstandigheden net Cl - effl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transport gemedieerd door gezuiverd anion-selectieve kanalen of transporteurs gereconstitueerd in liposomen - We hebben een gedetailleerd protocol om Cl te meten beschreven. Het voorbeeld gebruikt was de prokaryotische H + / Cl - wisselaar CLC-EC1. Echter, kan de methode gemakkelijk worden aangepast om kanalen afgesloten door liganden 12,13,15, 11,12 spanning of sportieve andere anionogene selectiviteit 15,16 door vervanging van de Ag bestuderen: AgCl elektrode met ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie GM085232 en een Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier-beurs (voor A.A.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.610200
IEC Centra CL2 BenchtopThermo Scientific
Orion Research Model 701A Digital pH-mV meterDeze kunnen worden gevonden op Ebay.
Niet-functionele pH-sondeElke pH-meter sonde met zilveren draden zal werken. De glas/kunststof coating moet worden verwijderd en de draden schoongemaakt.
DI-710 Data LoggerDATAQ instruments
WinDAQ acquisitiesoftwareDATAQ instruments
Pierce wegwerpbare kunststof kolommen, zwaartekracht-flow, 2mlPierce (Thermo Scientific)29922
KIMAX Cultuurbuizen, Wegwerp, BorosilicaatglasKimble Chase73500-13100
Extruder Set Met Houder/VerwarmingsblokAvanti Polar Lipids Inc.610000
Computer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
  2. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
  3. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  4. Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
  5. Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
  6. Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
  7. Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
  8. Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
  9. Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
  10. Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
  11. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
  12. Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
  13. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367(2013).
  14. Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
  15. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
  16. Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
  17. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
  18. Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
  19. Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
  20. Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
  21. Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
  22. Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
  23. Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
  24. Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084(2013).
  25. Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7(2004).
  26. Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
  27. Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chloride effluxanalyseproteoliposoom reconstitutieunittest transportsnelheidiongevoelige elektrodevalinomycine ionofoorCLC ec1 exchangermembraanpotentiaalshuntliposoom fluxmetingionentransportanalyse

Gerelateerde artikelen